La producción y el trabajo experimental presentado en este documento reflejan la ayuda dedicada y entusiasta de Reynaldo Pareja. Financiado por el Departamento Administrativo de Colombia de Ciencia, Tecnología e Innovación (Colciencias) y por una donación de la Fundación Bill &amp; Melinda Gates Foundation a través de la iniciativa Grand Challenges Exploraciones.

1. Plantas <ol><li> Superficie a esterilizar las semillas de frijol (cv. Calima) sumergiéndolos durante dos minutos en hipoclorito de sodio al 0,5% y dos minutos en 70% de etanol. Enjuague las semillas tres veces en agua destilada estéril. </li><li> Evaluar el éxito de su esterilización mediante siembra de 100 l de la última agua de lavado de la papa dextroxe agar (PDA) medios de comunicación, e incubar la placa durante 10 días a 25 ° C. Terminar y reinicie el experimento si cualquier crecimiento se ve en la placa. </li><li> Plantar las semillas en grupos de tres en macetas que contenían una mezcla estéril de tierra y arena en una proporción de 2:1. Transferir las ollas a una cámara de crecimiento a 25 ° C, ca. 50% de humedad relativa y fotoperíodo 12 h. Una semana después de la germinación, eliminar los menos dos plántulas vigorosas. De agua cada 2-3 días con agua destilada estéril y fertilizar 10 y 20 días después de la siembra con una solución de agua 6 g / l de fertilizante NPK 15-15-15. </li></ol> 2. Hongo <ol><li> Obtener una comerciacial formulación de Beauveria bassiana cepa GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombia). </li><li> Para generar un cultivo de una sola espora, suspender ca. un asa de inoculación completo de conidios en 1 ml de una solución de agua 0,1% de Triton X-100 y agitar durante 10 seg. Entonces, la placa 100 l de la suspensión en 2,5% de agar Noble y se incuba durante 24 horas a 25 ° C. Transferir un conidio germina solo en una PDA 100 mm placa que contiene y crecer hasta que cubra toda la placa (ca. semanas 3-4). </li><li> En condiciones estériles, raspar el crecimiento de los hongos de la superficie del medio y suspenderlo en 10 ml estéril 0,1% de Triton X-100. Vortex durante un minuto. A continuación, se filtra la suspensión a través de una gasa estéril para eliminar las hifas y obtener la suspensión de valores. </li><li> Usar un hemocitómetro para estimar la concentración de la suspensión conidial stock. Para facilitar el recuento de conidios, preparar una dilución serial de 10.000 veces de la población, cada vez que la transferencia de 100 l of suspensión de conidias en 900 l de 0,1% de Triton X-100, y agitación en vórtex durante 10 s antes de la siguiente dilución. </li><li> Para generar el inóculo, ajustar la suspensión de stock a una concentración final de 10 8 conidios / ml, usando la fórmula: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="ecuación 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Para evaluar la viabilidad de conidios, la placa 100 l de la dilución de 10.000 veces en 2,5% de agar Noble y se incuba durante 24 horas a 25 ° C. A continuación, inspeccione tres grupos al azar de 100 conidios para estimar el porcentaje de germinación. Considere un conidio germinado cuando un tubo germinal visible más largo que el diámetro medio de los proyectos de conidios de ella. Utilice únicamente la suspensión cuando el porcentaje de germinación promedio supera el 90%. </li></ol> 3. Inoculación <ol><li> Se inoculan las plantas cuando llegan a su etapa primera hoja verdadera (unos 14 días después de la siembra). Plantas de agua a la capacidad del suelo estéril con destilared agua 24 horas antes de inoculaciones. </li><li> Para el método de pulverización foliar, utilizar un atomizador manual para aplicar la suspensión de conidias (tratamiento) o 0,1% Triton X-100 (control) a la adaxial (superior) de la superficie de hojas, hasta alcanzar la saturación. Cubrir la parte superior de la olla con papel de aluminio para evitar la escorrentía conidial para el suelo. Después de la pulverización, las plantas cubren con una bolsa de plástico durante 24 horas para mantener un alto nivel de humedad facilitar la invasión de hongos. </li><li> Para el método de empapamiento de tierra, utilice un cilindro graduado para aplicar 10 ml de suspensión de conidias (tratamiento) o 0,1% Triton X-100 (control) a la superficie del suelo en la base de la planta. </li><li> Después de inoculación, las plantas de volver a las cámaras de crecimiento organizarlos en un diseño de bloques completos al azar. No menos de cuatro bloques experimentales adicionales deben ser instalados para permitir evaluaciones de crecimiento de las plantas, además de las evaluaciones de la colonización endofítica, en el mismo experimento. </li></ol> 4. Evalluaciones <ol><li> Evaluar el experimento de un bloque a la vez, la selección de los bloques en orden aleatorio. Esto es particularmente importante para los experimentos de gran tamaño que no pueden ser evaluadas en un solo día. </li><li> Antes de procesar una planta, medir y registrar su altura desde la base hasta el meristemo apical. A continuación, arrancar de raíz con cuidado y lavar abundantemente con agua corriente del grifo. </li><li> De cada planta, muestra dos valvas, dos pedazos de raíz y dos trozos de tallo. Selección de muestras prospecto al azar de la primera hoja verdadera de la planta. A continuación, obtener dos muestras de tallo, 3 cm de largo cada una, a partir de la media de la planta y desde cerca de la superficie del suelo. Finalmente, obtener dos muestras de raíz principal, también de 3 cm de largo cada uno, desde la mitad de la raíz y de 1 cm por detrás de la punta de la raíz. Coloque las muestras en tres bolsas de papel y la etiqueta apropiada. </li><li> Después de lavar y muestreo de todas las plantas en un bloque, comienza el procesamiento de las hojas, luego las raíces, los tallos y, finalmente, los. </li><li> Surface esterilizar tcuestiones en una campana de flujo laminar estéril como en 1,1, por encima. Enjuague cada muestra tres veces por inmersión en agua destilada estéril y dejar secar en una toalla de papel estéril. Entonces, diseccionar y desechar sus bordes exteriores, donde los endófitos podrían haber sido eliminados debido al contacto con desinfectantes. </li><li> Cortar la muestra recortada en seis secciones, con un promedio de 6x6 mm para hojas y 6 mm de longitud de los tallos y raíces. Placa de las seis secciones en un 60 mm placa de Petri con medio PDA suplementado con antibióticos de la tetraciclina, estreptomicina y penicilina a 2 mg / l de cada uno. Sellar la placa con parafilm y se incuba en la oscuridad a 25 ° C. Cada planta produce seis platos, dos por parte de la planta. </li><li> Cambiar el agua de enjuague después de procesar cada bloque de una parte de planta dada. Antes de desechar el agua de lavado utilizado, la placa una muestra de 100 l en los medios de PDA y se incuban durante 10 días a 25 ° C para evaluar el éxito de la esterilización. Si el crecimiento de hongos se produce, no tienen en cuenta las correspondientes muestras para análisis. </li><li> Inspeccione las placas cada 2-3 días durante 20 días para observar y registrar el crecimiento de hongos. Secciones sobre consumos específicos y la transferencia de las plantas exhiben presencia de hongos endófitos de placas que contienen PDA fresco. Esto evitará la contaminación de las secciones de la planta vecinos en la placa original. </li><li> Record B. bassiana crecimiento de secciones de la planta. Beauveria bassiana se pueden identificar por característica micelio blanco denso convertirse en crema a amarillo pálido en el borde. En caso de duda, montar la muestra en una gota de agua e inspeccionar debajo de un microscopio, en busca de globosos conidios y conidióforos en forma de zigzag, característico de la especie. </li><li> Utilice bloques experimentales adicionales para evaluar el impacto de los tratamientos sobre la biomasa vegetal. En primer lugar, medir su altura desde la base hasta la parte superior del meristemo apical. Luego, con cuidado desarraigar las plantas y lavar con agua corriente y dejar secar a 45 º C durante tres días para determinar su peso seco. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Hay muchos factores que pueden influir en el resultado específico de un experimento para establecer un hongo entomopatógeno como endofito. Nuestros resultados demuestran el método de inoculación es una de ellas. Los factores biológicos incluyen a experimentar con el cultivo de especies o cultivares seleccionados y la cepa del hongo entomopatógeno especies o aislar utilizado. Otros factores a considerar incluyen la manipulación de la concentración del inóculo, la edad de la planta durante inoculaciones, y las condiciones de crecimiento de la planta. Sería ideal para un método de inoculación para dar lugar a la colonización planta sistémica por un entomopatógeno 14,17,18,21 hongos. En cambio, parece que los métodos de inoculación tienden a favorecer un patrón específico de colonización local. En el café, por ejemplo, pulverizaciones foliares favorecer la colonización hoja mientras que empapa el suelo favorece colonización de la raíz 17. Encontramos el mismo patrón en el frijol común. En última instancia, la elección del método de inoculación debe serguiada por la ubicación prevista de la endofito dentro de una planta, es de suponer que coincida con el lugar de destino o el herbívoro patógeno de la planta. Aunque comúnmente utilizado, la detección y cuantificación endofito basa en culturas mediáticas puede ser costoso, difícil y propenso a errores. Por ejemplo, un total de 10.800 secciones de la planta (1.800 sembraron en placas de Petri) se evaluaron en un experimento para optimizar B. bassiana inoculaciones de plátano 16. De estos, 4.496 secciones fueron colonizados por un putativo B. bassiana, como se identifica principalmente por la morfología de colonia. Es evidente que una verificación microscópica de la especie para cada colonia habría sido un paso deseable, pero inalcanzable. Por otra parte, 1.176 secciones fueron colonizadas por otros hongos y se descartaron y se trata como datos que faltan 16. La probabilidad existe, sin embargo, que B. bassiana es un mal competidor o más lento para crecer, y eventualmente podría haber surgido de esas secciones si untiempo suficiente llowed. Por lo tanto, los métodos de detección basados ​​en endófitos culturas mediáticas están sujetos a los falsos positivos y falsos negativos. En consecuencia, el desarrollo de una detección más fiable y cuantificación métodos, por ejemplo los basados ​​en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 20,21,24, está bien justificada. El objetivo final de los experimentos de inoculación debe ser el desarrollo de un tratamiento eficaz que proporciona una resistencia sistémica duradera contra la herbivoría y / o enfermedad. Una plausible, pero como aún no probado, la hipótesis es que el alcance de la colonización endofítica debe correlacionarse positivamente con el grado de endófito resistencia mediada. Un paso natural después de refinar los métodos de inoculación, por lo tanto, podría ser examinar esta correlación. Varios protocolos de vídeo puede ayudar a los investigadores a diseñar un ensayo de resistencia adecuada para una plaga o patógeno 29-31. En última instancia, este ensayo es lo que determina el éxito de la inoculaciónmétodo ción, y el potencial para el control biológico asociado endofítica.

Hongos entomopatógenos son importantes reguladores de las poblaciones de insectos con un potencial considerable como micopesticidas 1. Sólo recientemente, sin embargo, tienen hongos entomopatógenos han demostrado que se producen como endófitos, tanto de forma natural y en respuesta a los métodos de inoculación diferentes 2. La función ecológica de los hongos entomopatógenos endofíticos sigue siendo en gran parte desconocida, pero algunos estudios han implicado en el crecimiento de las plantas 3,4, la resistencia herbívoro 5-8, y la resistencia a la enfermedad 9,10. El objetivo general de los métodos presentados aquí es la introducción de un hongo entomopatógeno como endofito, en preparación para las evaluaciones posteriores de control biológico endofítica. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) es el mejor estudiado hongos endofíticos entomopatógeno 5-9,11-19, y está disponible como una mycopesticide comercial. Inoculación probado a establecer <em&gt; B. bassiana como endofito incluyen pociones suelos, revestimientos de semillas 14,17 18 y 14 inmersiones, salsas 13,15 radícula, raíz y rizoma inmersiones 11,16,18, tallo inyecciones de 17 de pulverizaciones foliares 14,17,20 y sprays de flores 19. Utilizando estos métodos, los investigadores han introducido B. bassiana en 11 plátano, frijol 7, 13 cacao, café 17, 7 de maíz, algodón 7, palmera datilera 12 de yute 21 de adormidera 20, calabaza 7, pino radiata 18, sorgo 14, tomate y trigo 7 7. La evidencia reciente sugiere que endofítica B. bassiana tiene el potencial de proteger a las plantas no sólo de las plagas de artrópodos 5-7,22-27, sino también de algunos patógenos de plantas 9. El frijol común (Phaseolus vulgaris) se encuentra entre los cultivos más vulnerables a las plagasplagas y enfermedades. Puede ser afectado por más de 400 plagas y patógenos 200, cuyo ataque se cree que es el factor más limitante bean producción entre las regiones 28. En consecuencia, la alubia común puede ser un modelo de cultivo excelente para examinar todo el espectro de control biológico endofítica por B. bassiana. Como primer paso en esta dirección, este artículo describe aplicaciones foliares y de suelo pociones como métodos de inoculación para introducir B.bassiana como endofito en el frijol común.

<table border="1">
<tbody>
	<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Mycotrol SE	</td>
 <td>Laverlam</td>
 <td>4167</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Noble agar</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A5431-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Penicillin G sodium salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3032-25MU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (100 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (60 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-13A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Potato dextrose agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>213400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Regular bleach (NaOCl)</td>
 <td>CLOROX</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Streptomycin sulfate salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S6501-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Tetracycline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T3258-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triple quince (NPK)</td>
 <td>ABOCOL</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>X-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Biological safety cabinet</td>
 <td>NuAire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Hemocytometer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-671-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Leica DM LB microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control

Beauveria bassiana es un hongo entomopatógeno con la capacidad de colonizar plantas endofíticamente. Como B. endófito, bassiana puede jugar un papel en la protección de plantas de herbivoría y enfermedad. Este protocolo se muestran dos métodos de inoculación para establecer B. bassiana endofíticamente en el frijol común (Phaseolus vulgaris), en preparación para las evaluaciones posteriores de control biológico endofítica. Las plantas se cultivan a partir de semillas esterilizadas superficialmente durante dos semanas antes de recibir una B. tratamiento de bassiana 10 8 conidios / ml (o agua) aplicados como una pulverización foliar o tratamiento del suelo. Dos semanas más tarde, las plantas se cosecharon y sus hojas, tallos y raíces se muestrean para evaluar la colonización de hongos endofíticos. Para esto, las muestras son individualmente esterilizadas en superficie, se cortaron en secciones múltiples, y se incubaron en medios de agar de dextrosa de patata durante 20 días. Los medios de comunicación se inspecciona cada 2-3 días para observar el crecimiento de hongos comoasociado con partes de la instalación y registrar la ocurrencia de B. bassiana para estimar el alcance de su colonización endofítica. Los análisis de éxito inoculación comparar la ocurrencia de B. bassiana dentro de una parte de planta dada (es decir, hojas, tallos o raíces) a través de tratamientos y controles. Además del método de inoculación, el resultado específico del experimento puede depender de las especies de cultivo o variedad, las especies de hongos entomopatógenos cepa o aislado utilizada, y las condiciones de crecimiento de la planta.

B. bassiana fue capaz de colonizar endofíticamente-p vulgaris en respuesta a los tratamientos de inoculación demostrados (Figura 1). Ambas aplicaciones foliares y de suelo pociones resultado de la colonización endofítica por B. bassiana en más del 80% de las plantas tratadas (Figura 2). Sin embargo, el alcance de la colonización depende de la parte de la planta evaluada y el método de inoculación utilizado. Hojas respondido mejor a las inoculaciones por pulverización. Raíces, por otra parte, respondieron sólo a empapar inoculaciones. Finalmente, tallos respondieron de manera similar a los dos métodos de inoculación. B. bassiana no se detectó en ninguna de las secciones de control de planta. Independientemente de los tratamientos, distintos de los endofitos B. bassiana creció de 15% de las secciones de la planta evaluados, pero fueron disecados de las placas de los medios de comunicación antes de que pudieran invadir secciones vecinas e influir en los resultados. Las plantas de tratamiento y de control eran visiblemente indistinguible dos semanas después de inoculaciones. No se detectaron diferencias en su peso en seco y en su altura. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Los resultados representativos de los tratamientos de inoculación sobre la colonización endofítica de plantas de frijol (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Por Beauveria bassiana. Arriba izquierda: control de placas sin crecimiento. Arriba a la derecha: hongos endófitos de una sección de la planta contaminando toda la placa. Abajo a la izquierda: B. bassiana que crece a partir de dos secciones de la planta. Abajo a la derecha: Endofítico B. bassiana conidios y conidióforos como se ve en el microscopio. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Figura 2. Efecto de los tratamientos de inoculación sobre la colonización endofítica de bean plantas (Phaseolus vulgaris cv. Calima) por Beauveria bassiana, dos semanas después de la inoculación con la cepa GHA. colonización por ciento representa el número de secciones de la planta colonizados dividido por el número de secciones cultivadas.

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Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Este protocolo se muestran dos métodos de inoculación para introducir el hongo entomopatógeno<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; Como endofito en el frijol común (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), Como preparación para las evaluaciones posteriores de control biológico endofítica.

Establecimiento de hongos entomopatógenos como endófitos: Hacia Control Biológico Endofítico

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

34.4K vistas.  International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia. Este protocolo se muestran dos métodos de inoculación para introducir el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana Como endofito en el frijol común ( Phaseolus vulgaris), Como preparación para las evaluaciones posteriores de control biológico endofítica.

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

La ingeniería biológica basada en los injertos vasculares El uso de un biorreactor pulsátil

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Investigación

Bioingeniería

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Obtención de imágenes de tejidos biológicos por desorción ionización electrospray espectrometría de masas

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM de Ensamblajes Biológicos en Líquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Síntesis de hidrogeles con propiedades antiincrustantes como membranas de purificación de agua

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Síntesis de biocompatibles de cristal líquido de elastómero Espumas como andamios celulares para 3D espaciales Cultivos Celulares

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Perfil de compatibilidad biológica de Biomateriales para regeneración ósea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

Celular 3D inicial grupo Control en un dispositivo híbrido Gel cubo para formaciones de patrón repetible

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Experimental Methods to Study Human Postural Control

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied by appropriate mathematical methods are needed to understand the role of the different sub-systems involved in human postural control. This article describes a protocol for performing perturbed standing experiments, acquiring experimental data, and carrying out the subsequent mathematical analysis, with the aim of understanding the role of musculoskeletal system and central control in human upright posture. The results generated by these methods are important, because they provide insight into the healthy balance control, form the basis for understanding the etiology of impaired balance in patients and the elderly, and aid in the design of interventions to improve postural control and stability. These methods can be used to study the role of somatosensory system, intrinsic stiffness of ankle joint, and visual system in postural control, and may also be extended to investigate the role of vestibular system. The methods are to be used in the case of an ankle strategy, where the body moves primarily about the ankle joint and is considered a single-link inverted pendulum.

This article presents an experimental/analytic framework to study human postural control. The protocol provides step-by-step procedures for performing standing experiments, measuring body kinematics and kinetics signals, and analyzing the results to provide insight into the mechanisms underlying human postural control.

Métodos experimentales para estudiar el control postural humano

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

Síntesis de nanoclusters de oro de emisión de infrarrojo cercano para aplicaciones biológicas

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositivos eléctricos y de campo magnético para la estimulación de tejidos biológicos

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...