Die Produktion und der experimentellen Arbeiten hier vorgestellten spiegeln die engagierten und enthusiastischen Hilfe von Reynaldo Pareja. Gefördert durch Verwaltungsabteilung Kolumbiens für Wissenschaft, Technologie und Innovation (Colciencias) und durch einen Zuschuss von der Bill &amp; Melinda Gates Foundation durch die Grand Challenges Explorations-Initiative.

Ein. Pflanzen <ol><li> Oberflächenaktive sterilisieren Bohnensamen (cv. Calima) durch Eintauchen für zwei Minuten in 0,5% Natriumhypochlorit und zwei Minuten in 70% Ethanol. Spülen Sie die Samen dreimal in sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Bewerten Sie den Erfolg Ihrer Sterilisation durch Ausplattieren 100 ul der letzten Spülwasser auf Kartoffel dextroxe Agar (PDA) Medien und Inkubation der Platte für 10 Tage bei 25 ° C. Beenden und neu starten das Experiment, wenn kein Wachstum auf der Platte zu sehen ist. </li><li> Pflanzen die Samen in Gruppen von drei in Töpfen mit einer sterilen Mischung von Erde und Sand im Verhältnis 2:1. Übertragen der Töpfe in eine Wachstumskammer bei 25 ° C, ca.. 50% RH und 12 h Photoperiode. Eine Woche nach der Keimung, beseitigen die beiden mindestens kräftige Sämlinge. Wasser alle 2-3 Tage mit sterilem destilliertem Wasser und düngen 10 und 20 Tage nach der Pflanzung mit einem 6 g / L Wasser-Lösung von NPK 15-15-15 Dünger. </li></ol> 2. Pilz <ol><li> Besorgen Sie sich eine komsoziale Formulierung Beauveria bassiana Stamm GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Kolumbien). </li><li> Um eine einzelne Sporen Stammkultur erzeugen, auszusetzen ca. ein Impföse voll von Konidien in 1 ml einer 0,1% igen wässrigen Lösung von Triton-X 100 und Vortex für 10 Sekunden. Dann Platte 100 ul der Suspension auf 2,5% Noble-Agar und Inkubation für 24 Stunden bei 25 ° C. Übertragen einer einzigen keimenden Konidien in eine 100 mm Platte mit PDA und wachsen, bis sie die gesamte Platte (ca. 3-4 Wochen) abdeckt. </li><li> Unter sterilen Bedingungen, kratzen die Pilzwachstum von der Oberfläche des Mediums und suspendieren in 10 ml steriler 0,1% Triton X-100. Vortex für eine Minute. Dann filtern die Suspension durch eine sterile Gaze um Hyphen zu entfernen und die Stoffsuspension. </li><li> Verwenden Sie eine Zählkammer die Konidien Konzentration der Stoffsuspension zu schätzen. Um Konidien zählt zu erleichtern, bereiten eine 10.000-fach Verdünnungsreihe der Aktie, jedes Mal, wenn die Übertragung 100 ul of Konidienaufschwemmung in 900 ul 0,1% Triton-X 100 und Vortexen für 10 Sek. vor der nächsten Verdünnung. </li><li> Um das Inokulum zu erzeugen, Einstellen der Stoffsuspension auf eine Endkonzentration von 10 8 Sporen / ml, nach der Formel: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="Gleichung 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Um Konidien Lebensfähigkeit Platte 100 ul der 10.000-fachen Verdünnung auf 2,5% Noble-Agar und Inkubation für 24 Stunden zu beurteilen bei 25 ° C. Dann untersuchen drei zufällige Gruppen von 100 Konidien auf Prozent der Keimung zu schätzen. Betrachten wir ein Conidium gekeimt wenn eine sichtbare Keimschlauch länger als die Hälfte des Durchmessers der Conidium Projekte daraus. Verwenden Sie nur die Aussetzung, wenn die durchschnittliche prozentuale Keimung 90% übersteigt. </li></ol> 3. Impfung <ol><li> Beimpfen Pflanzen, wenn sie ihre erste echte Blatt-Stadium (ca. 14 Tage nach dem Einpflanzen) zu erreichen. Wasserpflanzen zu Boden Kapazität mit sterilen destillierened Wasser 24 Stunden vor Impfungen. </li><li> Für die Blatt-Sprühverfahren, verwenden eine manuelle Zerstäubers um die Konidienaufschwemmung (Behandlung) oder 0,1% Triton-X 100 (Kontrolle) der adaxial (oberen) Oberfläche der Blätter bis sie Sättigung erreichen anzuwenden. Decken Sie die Oberseite des Topfes mit Aluminiumfolie Konidien Abfluss in den Boden vermeiden. Nach dem Aufsprühen decken Pflanzen mit einer Plastiktüte für 24 Stunden, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu erleichtern Pilz Invasion zu halten. </li><li> Für den Boden drench Verfahren, verwenden Sie einen Meßzylinder auf 10 ml Konidiensuspension (Behandlung) oder 0,1% Triton-X 100 (Kontrolle) auf die Oberfläche des Bodens auf der Basis der Pflanze. Gelten </li><li> Nach Impfungen, zurückzukehren Pflanzen zu den Klimakammern ordnet sie in einer randomisierten vollständigen Block-Design. Nicht weniger als vier zusätzliche experimentelle Blöcken installiert werden, um Auswertungen des Pflanzenwachstums zu ermöglichen, zusätzlich zu Auswertungen endophytischen Kolonisierung im gleichen Experiment. </li></ol> 4. Evaluations <ol><li> Auswertung des Versuchs ein Block in einer Zeit, die Auswahl der Blöcke in zufälliger Reihenfolge. Dies ist insbesondere wichtig für große Experimente, die nicht an einem einzigen Tag ausgewertet werden können. </li><li> Vor der Verarbeitung einer Pflanze, messen und aufzeichnen seine Höhe von der Basis zu dem apikalen Meristem. Dann vorsichtig entwurzeln und gründlich unter fließendem Leitungswasser. </li><li> Von jeder Pflanze, Probe zwei Blättchen, zwei Stücke von Wurzel und zwei Stücke von Stammzellen. Wählen Sie Broschüre Proben zufällig aus der ersten echten Blatt der Pflanze. Dann erhält man zwei Proben Schaft, 3 cm langen jeweils von der Mitte der Pflanze und von der Nähe der Bodenoberfläche. Schließlich erhalten zwei taproot Proben, auch 3 cm lang jeweils von der Mitte der Wurzel und von 1 cm hinter der Wurzelspitze. Legen Sie die Proben auf drei separaten Papiertüten und Label angemessen. </li><li> Nach dem Waschen und Abtasten aller Pflanzen in einem Block, durch Verarbeiten der Blätter startet, dann Wurzeln, und schließlich werden die Stiele. </li><li> Oberfläche zu sterilisieren tFragen in einem sterilen Laminarströmungshaube wie in 1,1 oben. Spülen Sie jede Probe dreimal durch Eintauchen in sterilem destilliertem Wasser und lassen es trocken in sterilen Tuch Papier. Dann zerlegen und entsorgen ihren äußeren Rändern, wo Endophyten beseitigt haben könnten aufgrund der mit Desinfektionsmitteln zu kontaktieren. </li><li> Schneiden Sie den getrimmt Probe in sechs Abschnitte mit durchschnittlich 6x6 mm für Blätter und 6 mm-lange Stängel und Wurzeln. Platte die sechs Abschnitte über eine 60 mm Petrischale mit PDA Medien mit dem Antibiotika Tetracyclin, Streptomycin und Penicillin bei 2 mg / L jeweils ergänzt. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren im Dunkeln bei 25 ° C. Jede Pflanze liefert sechs Platten, zwei pro Anlagenteil. </li><li> Anderer das Wasser nach der Verarbeitung jedes Blocks eines gegebenen Pflanzenteil spülen. Vor der Entsorgung des verwendeten Spülwassers, Platte eine 100 ul Probe auf PDA Medien und inkubieren für 10 Tage bei 25 ° C zu beurteilen Sterilisation Erfolg. Wenn Pilzwachstum erfolgt, berücksichtigen nicht die entsprechenden Proben für Analysen. </li><li> Überprüfen Sie die Platten alle 2-3 Tage für 20 Tage zu beobachten und aufzuzeichnen Pilzwachstum. Verbrauchsteuern und Transfer Anlagenteile ausstellenden Vorhandensein von Pilz-Endophyten auf Platten mit frischem PDA. Dies wird eine Kontamination benachbarter Anlagenteile in der Original-Platte. </li><li> Rekord B. bassiana Wachstum von Anlagenteilen. Beauveria bassiana kann durch charakteristische weiße dichten Myzel immer cream bis blassgelb am Rande identifiziert werden. Wenn Sie Zweifel haben, montieren Sie die Probe in einem Tropfen Wasser und überprüfen unter dem Mikroskop auf der Suche nach globose Konidien und Zick-Zack-förmigen Konidienträgern, charakteristisch für die Spezies. </li><li> Verwenden Sie zusätzliche experimentelle Blöcke, um die Auswirkungen der Behandlungen auf pflanzlicher Biomasse zu evaluieren. Zunächst messen deren Höhe von der Basis bis zur Spitze des apikalen Meristem. Dann vorsichtig entwurzeln und waschen Pflanzen in Leitungswasser und lassen Sie sie trocknen bei 45 ° C für drei Tage, um ihre Trockengewicht zu bestimmen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Viele Faktoren können Einfluss auf die konkrete Ergebnis eines Experiments, eine Pilz Entomoerreger als Endophyten zu etablieren. Unsere Ergebnisse zeigen die Inokulation Verfahren ist eines davon. Biologische Faktoren zu experimentieren sind die Pflanzenart oder Sorte ausgewählt und die Pilz Entomoerreger Arten Belastung oder isolieren. Andere Faktoren zu berücksichtigen Manipulation beinhalten die Konzentration des Inokulums, das Alter der Anlage während Impfungen und der Anlage Anbaubedingungen. Es wäre ideal für eine Impfung Methode der systemischen pflanzlichen Kolonisation durch eine Pilz Entomoerreger 14,17,18,21 führen. Stattdessen geht hervor, dass Methoden zur Inokulation ein spezifisches Muster von lokalen Kolonisierung bevorzugen. In Kaffee beispielsweise begünstigen Blattsprays Blatt Kolonisierung Erwägung Boden Drenchen Wurzelbesiedlung 17 begünstigen. Wir fanden das gleiche Muster in der gemeinsamen Bohne. Letztlich sollte die Wahl der Impfung Methodegeleitet von dem vorgesehenen Standort des Endophyten innerhalb einer Anlage, vermutlich passenden Nische des Ziels Herbivore oder Pflanzenpathogen. Obwohl häufig verwendet, Endophyten Detektion und Quantifizierung basierend auf Medienkulturen kann teuer werden, schwierig und fehleranfällig. Beispielsweise wurden insgesamt 10.800 Teilanlagen (plattiert auf Petrischalen 1800) in einem Experiment evaluiert nach B. optimieren bassiana Impfungen auf Banane 16. Von diesen wurden 4.496 Abschnitte durch eine vermeintliche B. kolonisiert bassiana, wie sie vor allem durch Kolonie Morphologie identifiziert. Natürlich wäre eine mikroskopische Überprüfung der Arten für jede Kolonie eine wünschenswerte, aber nicht finanzierbare Schritt. Auf der anderen Seite wurden 1176 Teile von anderen Pilzen besiedelt und wurden verworfen und behandelt wie fehlende Daten 16. Die Wahrscheinlichkeit besteht jedoch, dass B. bassiana war ein armer Konkurrenten oder langsamer zu wachsen, und konnte schließlich aus diesen Abschnitten entstanden sind, wenn einllowed genügend Zeit. Daher sind Endophyten Nachweisverfahren auf Medienkulturen Basis unterliegen falsche Positive und falsche Negative. Dementsprechend ist die Entwicklung zuverlässiger Nachweis und die Quantifizierung Methoden, beispielsweise solche auf Basis von Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Assays 20,21,24, ist gut begründet. Das ultimative Ziel für Impfversuche sollte es sein, eine effiziente Behandlung, die dauerhaft systemische Resistenz gegen Insektenfraß und / oder Krankheit zu entwickeln. Eine plausible, aber noch nicht getestet, ist Hypothese, dass das Ausmaß der endophytischen Kolonisierung sollte positiv korreliert mit dem Ausmaß der Endophyten-vermittelte Resistenz. Eine natürliche nächste Schritt nach Verfeinerung Impfung Methoden, daher könnte es sein, diesen Zusammenhang zu untersuchen. Mehrere Video-Protokolle können Forschern helfen entwerfen eine geeignete Resistenzassay für ein Ziel Schädlings oder Krankheitserregers 29-31. Letztlich ist es dieser Assay, was den Erfolg der Inokula bestimmenmethode und die damit verbundene Potenzial für endophytischen biologische Kontrolle.

Fungal Entomopathogens sind wichtige Regulatoren der Insekten-Populationen mit erheblichem Potenzial als mycopesticides 1. Erst kürzlich haben jedoch gezeigt worden pilzlichen Entomoerreger als Endophyten, sowohl natürlich als auch in Reaktion auf verschiedene Methoden Inokulation 2 auftreten. Die ökologische Funktion der endophytischen Pilz Entomopathogens weitgehend unbekannt, aber einige Studien haben sie in das Pflanzenwachstum 3,4, Pflanzenfresser Widerstand 5-8 und Krankheitsresistenz 9,10 verwickelt. Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, ein Pilz Entomoerreger als Endophyten einzuführen, in Vorbereitung für spätere Auswertungen endophytischer biologische Kontrolle. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) ist die am besten untersuchte endophytischen Pilz Entomoerreger 5-9,11-19, und es ist als kommerzielles mycopesticide. Inokulation Methoden getestet, um festzustellen <em&gt; B. bassiana als Endophyten sind Boden durchnässt 14,17, Samenbeschichtungen 18 und Tauchgänge 14, radicle Dressings 13,15, Wurzel und Rhizom Tauchgänge 11,16,18, Stammzellen-Injektionen 17, Blattsprays 14,17,20 und Blüten Sprays 19. Mit Hilfe dieser Methoden haben die Forscher B. eingeführt bassiana in Bananenblätter 11, bean 7, Kakao 13, Kaffee 17, Mais 7, Baumwolle 7, Dattelpalme 12, Jute 21, Schlafmohn 20, Kürbis 7, radiata Kiefer 18, Sorghum 14, Tomate 7 und Weizen 7. Neuere Erkenntnisse legen nahe, dass endophytischen B. bassiana hat das Potential, nicht nur aus Pflanzen Arthropodenschädlinge 5-7,22-27 schützen, sondern auch aus einigen Pflanzenpathogene 9. Die gemeinsame Bohne (Phaseolus vulgaris) gehört zu den Pflanzen besonders anfällig für Schädlingeund Krankheiten. Es kann durch mehr als 400 Schädlinge und 200 Erreger, dessen Angriff wird angenommen, dass die Begrenzung der bean Produktionsfaktor in den Regionen 28 werden betroffen sein. Dementsprechend kann der gemeine Bohne ein hervorragendes Modell Ernte sein, um das gesamte Spektrum der endophytischen biologische Kontrolle von B. zu untersuchen bassiana. Als ersten Schritt in diese Richtung, beschreibt dieser Artikel Blattsprays und Boden durchnässt als Impfung Methoden B.bassiana als Endophyten in der gemeinen Bohne vorstellen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Name of Reagent/Material</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td></td></tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Noble agar</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (100 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Potato dextrose agar</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Regular bleach (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate salt</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triple quince (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Biological safety cabinet</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM LB microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control

Beauveria bassiana eine Pilz Entomoerreger mit der Fähigkeit zu Pflanzen endophytisch kolonisieren. Als Endophyt, B. bassiana eine Rolle beim Schutz der Pflanzen vor Insektenfraß und Krankheit spielen. Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden B. etablieren bassiana endophytisch in der gemeinen Bohne (Phaseolus vulgaris), in Vorbereitung für spätere Auswertungen endophytischer biologische Kontrolle. Die Pflanzen werden von der Oberfläche sterilisiert Samen für zwei Wochen, bevor er eine B. gewachsen bassiana Behandlung von 10 8 Sporen / ml (oder Wasser) angewendet entweder als Blattspray oder eines Bodens durchnässen. Zwei Wochen später werden die Pflanzen geerntet und ihre Blätter, Stängel und Wurzeln werden abgetastet, um endophytischen Pilzbesiedlung bewerten. Hierzu werden Proben einzeln sterilisiert Oberfläche geschnitten in mehrere Abschnitte und inkubiert in Kartoffeldextroseagar Medium für 20 Tage. Die Medien kontrolliert wird alle 2-3 Tage, um Pilz-Wachstum zu beobachtensociated mit Anlagenteilen und notieren das Auftreten von B. bassiana zu schätzen den Umfang ihrer endophytischen Kolonisation. Analysen der Impfung Erfolg vergleichen das Auftreten von B. bassiana innerhalb einer bestimmten Anlagenteil (dh Blätter, Stängel und Wurzeln) über Behandlungen und Kontrollen. Neben der Impfung Verfahren, das konkrete Ergebnis des Experiments kann auf die Zielkultur Art oder Sorte abhängen, belasten die Pilz Entomoerreger Arten oder isolieren verwendet, und die Pflanze Anbaubedingungen.

B. bassiana konnte endophytisch besiedeln P. vulgaris in Reaktion auf die Impfung nachgewiesen Behandlungen (Abbildung 1). Beide Blattsprays und Boden durchnässt führte endophytischen Besiedlung durch B. bassiana in über 80% der behandelten Pflanzen (Abbildung 2). Allerdings hing das Ausmaß der Besiedelung auf der Anlage Teil ausgewertet und die Impfung Methode verwendet. Leaves reagiert am besten auf spray Impfungen. Wurzeln, auf der anderen Seite, reagiert nur zu durchnässen Impfungen. Schließlich Stiele ähnlich beiden Inokulation Methoden reagiert. B. bassiana wurde in keinem der Steuerdaten Anlagenteile erfasst. Unabhängig von der Behandlung, mit Ausnahme von B. Endophyten bassiana wuchs von 15% der ausgewerteten Anlagenteile, aber sie wurden aus den Medien Platten zerlegt, bevor sie angrenzenden Abschnitte könnten eindringen und die Ergebnisse beeinflussen. Behandlung und Kontrolle Pflanzen waren sichtlich unterscheiden zwei Wochen nach Impfungen. Es wurden keine Unterschiede in ihrer Trockengewicht und in ihrer Höhe festgestellt. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse der Impfung Behandlungen auf endophytischen Kolonisierung der Bohne (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Durch Beauveria bassiana Oben links:. Kontrollplatten ohne Wachstum. Oben rechts: Fungal Endophyten aus einem Anlagenteil verunreinigen gesamte Platte. Unten links: B. bassiana wächst aus zwei Anlagenteilen. Unten rechts: Endophytic B. bassiana Konidien und Konidiophoren wie unter einem Mikroskop betrachtet. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Abbildung 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Abbildung 2. Wirkung der Impfung Behandlungen auf endophytischen Kolonisierung bean (Phaseolus vulgaris cv. Calima) von Beauveria bassiana, zwei Wochen nach Impfung mit dem Stamm GHA. Prozent Kolonisierung repräsentiert die Anzahl der besiedelten Anlagenteilen durch die Anzahl der gebildeten Abschnitte unterteilt.

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Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden, um den Pilz Entomoerreger einzuführen<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; Als Endophyten in der gemeinsamen Bohne (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), In Vorbereitung für nachfolgende Auswertungen der endophytische biologischen Kontrolle.

Gründung Fungal Entomopathogens als Endophyten: Gegen Endophytic Biological Control

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

establishing-fungal-entomopathogens-as-endophytes-towards-endophytic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

34.5K Aufrufe.  International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia. Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden, um den Pilz Entomoerreger einzuführen Beauveria bassiana Als Endophyten in der gemeinsamen Bohne ( Phaseolus vulgaris), In Vorbereitung für nachfolgende Auswertungen der endophytische biologischen Kontrolle.

Serie: Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Forschung

Biotechnik

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and screening for the selection of a fast-acting, highly virulent entomopathogenic fungus are important steps. Entomopathogenic fungi, such as Metarhizium, Beauveria, and Nomurea, which act by contact, are better suited than Bacillus thuringiensis or nucleopolyhedrosis virus (NPV), which must be ingested by the insect pest. In the present work, we isolated 68 Metarhizium strains from infected insects using a soil dilution and bait method. The isolates were identified by the amplification and sequencing of the ITS1-5.8S-ITS2 and 26S rDNA region. The most virulent strain of Metarhizium anisopliae was selected based on the median lethal concentration (LC50) and time (LT50) obtained in insect bioassays against III-instar larvae of Helicoverpa armigera. The mass production of spores by the selected strain was carried out with solid-state fermentation (SSF) using rice as a substrate for 14 days. Spores were extracted from the sporulated biomass using 0.1% tween-80, and different formulations of the spores were prepared. Field trials of the formulations for the control of an H. armigera infestation in pigeon peas were carried out by randomized block design. The infestation control levels obtained with oil and aqueous formulations (78.0% and 70.9%, respectively) were better than the 63.4% obtained with chemical pesticide.

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Here, we report the different stages involved in the knowledge-based development of an effective mycoinsecticide, including the isolation, identification, screening, and selection of the "best-fit" entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae, for the control of insect pests in agriculture.

Entwicklung von<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Als Mycoinsektizid: Von der Isolation bis zur Field Performance

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

Umwelt

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Immunologie und Infektion

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

Isolierung und Selektion entomopathogener Pilze aus Bodenproben und Bewertung der Pilzvirulenz gegen Schadinsekten

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Biologie

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. The increase in pest resistance to chemical insecticides, the growing concerns regarding the negative effects of insecticides on human health, and the environmental pollution from pesticides have led to a global drive to find novel sustainable strategies for crop protection and pest control. Previously, attempts to mass culture such entomopathogenic fungi (EPF) species as Beauveria bassiana have been conducted. However, only limited attempts have been conducted to mass culture Metarhizium robertsii and M. pinghaense for use against insect pests. This study aimed to mass-produce a sufficient number of resilient infective propagules of South African isolates of M. robertsii and M. pinghaense for commercial application. Three agricultural grain products, flaked oats, flaked barley, and rice, were used as the EPF solid fermentation substrates. Two inoculation methods, conidial suspensions and the liquid fungal culture of blastospores were used to inoculate the solid substrates. Inoculation using conidial suspensions was observed to be relatively less effective, as increased levels of contamination were observed on the solid substrates relative to when using the blastospore inoculation method. Flaked oats were found not to be a suitable growth substrate for both M. robertsii and M. pinghaense, as no dry conidia were harvested from the substrate. Flaked barley was found to favor the production of M. robertsii conidia over that of M. pinghaense, and an average of 1.83 g &plusmn; 1.47 g of dry M. robertsii conidia and zero grams of M. pinghaense conidia was harvested from the substrate. Rice grains were found to favor the conidial mass production of both M. pinghaense and M. robertsii isolates, with an average of 8.2 g &plusmn; 4.38 g and 6 g &plusmn; 2 g harvested from the substrate, respectively.

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Entomopathogenic fungi have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. In this study, the mass production of a sufficient number of resilient infective propagules of South African isolates of both Metarhizium robertsii and M. pinghaense for commercial application against insect pests was successfully conducted using agricultural grain products.

Massenproduktion von entomopathogenen Pilzen, Metarhizium robertsii und Metarhizium pinghaense, zur kommerziellen Anwendung gegen Insektenschädlinge

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. The soil is a rich habitat for microorganisms, including EPF particularly belonging to the genera Metarhizium and Beauveria, which can regulate arthropod pests. Biological products based on fungi are available in the market mainly for agricultural arthropod pest control. Nevertheless, despite the high endemic biodiversity, only a few strains are used in commercial bioproducts worldwide. In the present study, 524 soil samples were cultured on potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium). The growth of fungal colonies was observed for 3 weeks. All Metarhizium and Beauveria EPF were morphologically identified at the genus level. Additionally, some isolates were molecularly identified at the species level. Twenty-four out of these 524 soil samples were also surveyed for EPF occurrence using the insect bait method (Galleria mellonella and Tenebrio molitor). A total of 51 EPF strains were isolated (41 Metarhizium spp. and 10 Beauveria spp.) from the 524 soil samples. All fungal strains were isolated either from croplands or grasslands. Of the 24 samples selected for comparison, 91.7% were positive for EPF using Galleria bait, 62.5% using Tenebrio bait, and 41.7% using CTC. Our results suggested that using insect baits to isolate the EPF from the soil is more efficient than using the CTC medium. The comparison of isolation methods in addition to the identification and conservation of EPF has a positive impact on the knowledge about biodiversity. The improvement of EPF collection supports scientific development and technological innovation.

Entomopathogenic fungal colonies are isolated from tropical soil samples using Tenebrio bait, Galleria bait, as well as selective artificial medium, i.e., potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium).

Vergleich von Methoden zur Isolierung entomopathogener Pilze aus Bodenproben

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as any other vital resource, the fungi with which these plants intimately associate are essential for them. Hence, some of the most relevant techniques in studying mycoheterotrophic species are the ones that enable the investigation of associated fungi, especially those inhabiting roots and subterranean organs. In this context, techniques for identifying culture-dependent and culture-independent endophytic fungi are commonly applied. Isolating fungal endophytes provides a means for morphologically identifying them, analyzing their diversity, and maintaining inocula for applications in the symbiotic germination of orchid seeds. However, it is known that there is a large variety of non-culturable fungi inhabiting plant tissues. Thus, culture-independent molecular identification techniques offer a broader cover of species diversity and abundance. This article aims to provide the methodological support necessary for starting two investigation procedures: a culture-dependent and an independent one. Regarding the culture-dependent protocol, the processes of collecting and maintaining plant samples from collection sites to laboratory facilities are detailed, along with isolating filamentous fungi from subterranean and aerial organs of mycoheterotrophic plants, keeping a collection of isolates, morphologically characterizing hyphae by slide culture methodology, and molecular identification of fungi by total DNA extraction. Encompassing culture-independent methodologies, the detailed procedures include collecting plant samples for metagenomic analyses and total DNA extraction from achlorophyllous plant organs using a commercial kit. Finally, continuity protocols (e.g., polymerase chain reaction [PCR], sequencing) are also suggested for analyses, and techniques are presented here.

The current article aims to provide detailed and adequate protocols for the isolation of plant-associated endophytic fungi, long-term preservation of isolates, morphological characterization, and total DNA extraction for subsequent molecular identification and metagenomic analyses.

Isolierung, Charakterisierung und Gesamt-DNA-Extraktion zur Identifizierung endophytischer Pilze in mykoheterotrophen Pflanzen

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

Optimierter Bioassay für entomopathogene Pilze gegen Senfblattlaus

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, entomopathogenic fungi (EPF) are potential microbial control agents for controlling this pest. Therefore, virulence screening of EPF isolates under Petri dish conditions is necessary before field application. However, the mustard aphid is a parthenogenetic insect, making it difficult to record data during Petri dish experiments. A modified system for detached-leaf bioassays was developed to address this issue, using a micro-sprayer to inoculate conidia onto aphids and prevent drowning by facilitating air-drying after spore suspension. The system maintained high relative humidity throughout the observation period, and the leaf disc remained fresh for over ten days, allowing parthenogenetic reproduction of the aphids. To prevent offspring buildup, a process of daily removal using a painting brush was implemented. This protocol demonstrates a stable system for evaluating the virulence of EPF isolates against mustard aphids or other aphids, enabling the selection of potential isolates for aphid control.

Autor im Rampenlicht: Umweltfreundliche Schädlingsbekämpfung mit entomopathogenen Pilzen gegen Senfblattläuse 

This protocol presents an optimized detached-leaf bioassay system for evaluating the effectiveness of entomopathogenic fungi (EPF) against the mustard aphid (Lipaphis erysimi (Kalt.)), a parthenogenetic insect. The method outlines the data collection process during Petri dish experiments, enabling researchers to consistently measure the virulence of EPF against mustard aphids and other parthenogenetic insects.

Bewertung der aphidiziden Wirkung entomopathogener Pilze gegen parthenogenetisches Insekt, Senfblattlaus, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, ...

Gründung Fungal Entomopathogens als Endophyten: Gegen Endophytic Biological Control

Zusammenfassung

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Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Entwicklung von

Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

Isolierung und Selektion entomopathogener Pilze aus Bodenproben und Bewertung der Pilzvirulenz gegen Schadinsekten

Massenproduktion von entomopathogenen Pilzen, Metarhizium robertsii und Metarhizium pinghaense, zur kommerziellen Anwendung gegen Insektenschädlinge

Vergleich von Methoden zur Isolierung entomopathogener Pilze aus Bodenproben

Isolierung, Charakterisierung und Gesamt-DNA-Extraktion zur Identifizierung endophytischer Pilze in mykoheterotrophen Pflanzen

Bewertung der aphidiziden Wirkung entomopathogener Pilze gegen parthenogenetisches Insekt, Senfblattlaus, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Bewertung der aphidiziden Wirkung entomopathogener Pilze gegen parthenogenetisches Insekt, Senfblattlaus, Lipaphis erysimi (Kalt.)