Die Produktion und der experimentellen Arbeiten hier vorgestellten spiegeln die engagierten und enthusiastischen Hilfe von Reynaldo Pareja. Gefördert durch Verwaltungsabteilung Kolumbiens für Wissenschaft, Technologie und Innovation (Colciencias) und durch einen Zuschuss von der Bill &amp; Melinda Gates Foundation durch die Grand Challenges Explorations-Initiative.

Ein. Pflanzen <ol><li> Oberflächenaktive sterilisieren Bohnensamen (cv. Calima) durch Eintauchen für zwei Minuten in 0,5% Natriumhypochlorit und zwei Minuten in 70% Ethanol. Spülen Sie die Samen dreimal in sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Bewerten Sie den Erfolg Ihrer Sterilisation durch Ausplattieren 100 ul der letzten Spülwasser auf Kartoffel dextroxe Agar (PDA) Medien und Inkubation der Platte für 10 Tage bei 25 ° C. Beenden und neu starten das Experiment, wenn kein Wachstum auf der Platte zu sehen ist. </li><li> Pflanzen die Samen in Gruppen von drei in Töpfen mit einer sterilen Mischung von Erde und Sand im Verhältnis 2:1. Übertragen der Töpfe in eine Wachstumskammer bei 25 ° C, ca.. 50% RH und 12 h Photoperiode. Eine Woche nach der Keimung, beseitigen die beiden mindestens kräftige Sämlinge. Wasser alle 2-3 Tage mit sterilem destilliertem Wasser und düngen 10 und 20 Tage nach der Pflanzung mit einem 6 g / L Wasser-Lösung von NPK 15-15-15 Dünger. </li></ol> 2. Pilz <ol><li> Besorgen Sie sich eine komsoziale Formulierung Beauveria bassiana Stamm GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Kolumbien). </li><li> Um eine einzelne Sporen Stammkultur erzeugen, auszusetzen ca. ein Impföse voll von Konidien in 1 ml einer 0,1% igen wässrigen Lösung von Triton-X 100 und Vortex für 10 Sekunden. Dann Platte 100 ul der Suspension auf 2,5% Noble-Agar und Inkubation für 24 Stunden bei 25 ° C. Übertragen einer einzigen keimenden Konidien in eine 100 mm Platte mit PDA und wachsen, bis sie die gesamte Platte (ca. 3-4 Wochen) abdeckt. </li><li> Unter sterilen Bedingungen, kratzen die Pilzwachstum von der Oberfläche des Mediums und suspendieren in 10 ml steriler 0,1% Triton X-100. Vortex für eine Minute. Dann filtern die Suspension durch eine sterile Gaze um Hyphen zu entfernen und die Stoffsuspension. </li><li> Verwenden Sie eine Zählkammer die Konidien Konzentration der Stoffsuspension zu schätzen. Um Konidien zählt zu erleichtern, bereiten eine 10.000-fach Verdünnungsreihe der Aktie, jedes Mal, wenn die Übertragung 100 ul of Konidienaufschwemmung in 900 ul 0,1% Triton-X 100 und Vortexen für 10 Sek. vor der nächsten Verdünnung. </li><li> Um das Inokulum zu erzeugen, Einstellen der Stoffsuspension auf eine Endkonzentration von 10 8 Sporen / ml, nach der Formel: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="Gleichung 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Um Konidien Lebensfähigkeit Platte 100 ul der 10.000-fachen Verdünnung auf 2,5% Noble-Agar und Inkubation für 24 Stunden zu beurteilen bei 25 ° C. Dann untersuchen drei zufällige Gruppen von 100 Konidien auf Prozent der Keimung zu schätzen. Betrachten wir ein Conidium gekeimt wenn eine sichtbare Keimschlauch länger als die Hälfte des Durchmessers der Conidium Projekte daraus. Verwenden Sie nur die Aussetzung, wenn die durchschnittliche prozentuale Keimung 90% übersteigt. </li></ol> 3. Impfung <ol><li> Beimpfen Pflanzen, wenn sie ihre erste echte Blatt-Stadium (ca. 14 Tage nach dem Einpflanzen) zu erreichen. Wasserpflanzen zu Boden Kapazität mit sterilen destillierened Wasser 24 Stunden vor Impfungen. </li><li> Für die Blatt-Sprühverfahren, verwenden eine manuelle Zerstäubers um die Konidienaufschwemmung (Behandlung) oder 0,1% Triton-X 100 (Kontrolle) der adaxial (oberen) Oberfläche der Blätter bis sie Sättigung erreichen anzuwenden. Decken Sie die Oberseite des Topfes mit Aluminiumfolie Konidien Abfluss in den Boden vermeiden. Nach dem Aufsprühen decken Pflanzen mit einer Plastiktüte für 24 Stunden, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu erleichtern Pilz Invasion zu halten. </li><li> Für den Boden drench Verfahren, verwenden Sie einen Meßzylinder auf 10 ml Konidiensuspension (Behandlung) oder 0,1% Triton-X 100 (Kontrolle) auf die Oberfläche des Bodens auf der Basis der Pflanze. Gelten </li><li> Nach Impfungen, zurückzukehren Pflanzen zu den Klimakammern ordnet sie in einer randomisierten vollständigen Block-Design. Nicht weniger als vier zusätzliche experimentelle Blöcken installiert werden, um Auswertungen des Pflanzenwachstums zu ermöglichen, zusätzlich zu Auswertungen endophytischen Kolonisierung im gleichen Experiment. </li></ol> 4. Evaluations <ol><li> Auswertung des Versuchs ein Block in einer Zeit, die Auswahl der Blöcke in zufälliger Reihenfolge. Dies ist insbesondere wichtig für große Experimente, die nicht an einem einzigen Tag ausgewertet werden können. </li><li> Vor der Verarbeitung einer Pflanze, messen und aufzeichnen seine Höhe von der Basis zu dem apikalen Meristem. Dann vorsichtig entwurzeln und gründlich unter fließendem Leitungswasser. </li><li> Von jeder Pflanze, Probe zwei Blättchen, zwei Stücke von Wurzel und zwei Stücke von Stammzellen. Wählen Sie Broschüre Proben zufällig aus der ersten echten Blatt der Pflanze. Dann erhält man zwei Proben Schaft, 3 cm langen jeweils von der Mitte der Pflanze und von der Nähe der Bodenoberfläche. Schließlich erhalten zwei taproot Proben, auch 3 cm lang jeweils von der Mitte der Wurzel und von 1 cm hinter der Wurzelspitze. Legen Sie die Proben auf drei separaten Papiertüten und Label angemessen. </li><li> Nach dem Waschen und Abtasten aller Pflanzen in einem Block, durch Verarbeiten der Blätter startet, dann Wurzeln, und schließlich werden die Stiele. </li><li> Oberfläche zu sterilisieren tFragen in einem sterilen Laminarströmungshaube wie in 1,1 oben. Spülen Sie jede Probe dreimal durch Eintauchen in sterilem destilliertem Wasser und lassen es trocken in sterilen Tuch Papier. Dann zerlegen und entsorgen ihren äußeren Rändern, wo Endophyten beseitigt haben könnten aufgrund der mit Desinfektionsmitteln zu kontaktieren. </li><li> Schneiden Sie den getrimmt Probe in sechs Abschnitte mit durchschnittlich 6x6 mm für Blätter und 6 mm-lange Stängel und Wurzeln. Platte die sechs Abschnitte über eine 60 mm Petrischale mit PDA Medien mit dem Antibiotika Tetracyclin, Streptomycin und Penicillin bei 2 mg / L jeweils ergänzt. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren im Dunkeln bei 25 ° C. Jede Pflanze liefert sechs Platten, zwei pro Anlagenteil. </li><li> Anderer das Wasser nach der Verarbeitung jedes Blocks eines gegebenen Pflanzenteil spülen. Vor der Entsorgung des verwendeten Spülwassers, Platte eine 100 ul Probe auf PDA Medien und inkubieren für 10 Tage bei 25 ° C zu beurteilen Sterilisation Erfolg. Wenn Pilzwachstum erfolgt, berücksichtigen nicht die entsprechenden Proben für Analysen. </li><li> Überprüfen Sie die Platten alle 2-3 Tage für 20 Tage zu beobachten und aufzuzeichnen Pilzwachstum. Verbrauchsteuern und Transfer Anlagenteile ausstellenden Vorhandensein von Pilz-Endophyten auf Platten mit frischem PDA. Dies wird eine Kontamination benachbarter Anlagenteile in der Original-Platte. </li><li> Rekord B. bassiana Wachstum von Anlagenteilen. Beauveria bassiana kann durch charakteristische weiße dichten Myzel immer cream bis blassgelb am Rande identifiziert werden. Wenn Sie Zweifel haben, montieren Sie die Probe in einem Tropfen Wasser und überprüfen unter dem Mikroskop auf der Suche nach globose Konidien und Zick-Zack-förmigen Konidienträgern, charakteristisch für die Spezies. </li><li> Verwenden Sie zusätzliche experimentelle Blöcke, um die Auswirkungen der Behandlungen auf pflanzlicher Biomasse zu evaluieren. Zunächst messen deren Höhe von der Basis bis zur Spitze des apikalen Meristem. Dann vorsichtig entwurzeln und waschen Pflanzen in Leitungswasser und lassen Sie sie trocknen bei 45 ° C für drei Tage, um ihre Trockengewicht zu bestimmen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Viele Faktoren können Einfluss auf die konkrete Ergebnis eines Experiments, eine Pilz Entomoerreger als Endophyten zu etablieren. Unsere Ergebnisse zeigen die Inokulation Verfahren ist eines davon. Biologische Faktoren zu experimentieren sind die Pflanzenart oder Sorte ausgewählt und die Pilz Entomoerreger Arten Belastung oder isolieren. Andere Faktoren zu berücksichtigen Manipulation beinhalten die Konzentration des Inokulums, das Alter der Anlage während Impfungen und der Anlage Anbaubedingungen. Es wäre ideal für eine Impfung Methode der systemischen pflanzlichen Kolonisation durch eine Pilz Entomoerreger 14,17,18,21 führen. Stattdessen geht hervor, dass Methoden zur Inokulation ein spezifisches Muster von lokalen Kolonisierung bevorzugen. In Kaffee beispielsweise begünstigen Blattsprays Blatt Kolonisierung Erwägung Boden Drenchen Wurzelbesiedlung 17 begünstigen. Wir fanden das gleiche Muster in der gemeinsamen Bohne. Letztlich sollte die Wahl der Impfung Methodegeleitet von dem vorgesehenen Standort des Endophyten innerhalb einer Anlage, vermutlich passenden Nische des Ziels Herbivore oder Pflanzenpathogen. Obwohl häufig verwendet, Endophyten Detektion und Quantifizierung basierend auf Medienkulturen kann teuer werden, schwierig und fehleranfällig. Beispielsweise wurden insgesamt 10.800 Teilanlagen (plattiert auf Petrischalen 1800) in einem Experiment evaluiert nach B. optimieren bassiana Impfungen auf Banane 16. Von diesen wurden 4.496 Abschnitte durch eine vermeintliche B. kolonisiert bassiana, wie sie vor allem durch Kolonie Morphologie identifiziert. Natürlich wäre eine mikroskopische Überprüfung der Arten für jede Kolonie eine wünschenswerte, aber nicht finanzierbare Schritt. Auf der anderen Seite wurden 1176 Teile von anderen Pilzen besiedelt und wurden verworfen und behandelt wie fehlende Daten 16. Die Wahrscheinlichkeit besteht jedoch, dass B. bassiana war ein armer Konkurrenten oder langsamer zu wachsen, und konnte schließlich aus diesen Abschnitten entstanden sind, wenn einllowed genügend Zeit. Daher sind Endophyten Nachweisverfahren auf Medienkulturen Basis unterliegen falsche Positive und falsche Negative. Dementsprechend ist die Entwicklung zuverlässiger Nachweis und die Quantifizierung Methoden, beispielsweise solche auf Basis von Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Assays 20,21,24, ist gut begründet. Das ultimative Ziel für Impfversuche sollte es sein, eine effiziente Behandlung, die dauerhaft systemische Resistenz gegen Insektenfraß und / oder Krankheit zu entwickeln. Eine plausible, aber noch nicht getestet, ist Hypothese, dass das Ausmaß der endophytischen Kolonisierung sollte positiv korreliert mit dem Ausmaß der Endophyten-vermittelte Resistenz. Eine natürliche nächste Schritt nach Verfeinerung Impfung Methoden, daher könnte es sein, diesen Zusammenhang zu untersuchen. Mehrere Video-Protokolle können Forschern helfen entwerfen eine geeignete Resistenzassay für ein Ziel Schädlings oder Krankheitserregers 29-31. Letztlich ist es dieser Assay, was den Erfolg der Inokula bestimmenmethode und die damit verbundene Potenzial für endophytischen biologische Kontrolle.

Fungal Entomopathogens sind wichtige Regulatoren der Insekten-Populationen mit erheblichem Potenzial als mycopesticides 1. Erst kürzlich haben jedoch gezeigt worden pilzlichen Entomoerreger als Endophyten, sowohl natürlich als auch in Reaktion auf verschiedene Methoden Inokulation 2 auftreten. Die ökologische Funktion der endophytischen Pilz Entomopathogens weitgehend unbekannt, aber einige Studien haben sie in das Pflanzenwachstum 3,4, Pflanzenfresser Widerstand 5-8 und Krankheitsresistenz 9,10 verwickelt. Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, ein Pilz Entomoerreger als Endophyten einzuführen, in Vorbereitung für spätere Auswertungen endophytischer biologische Kontrolle. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) ist die am besten untersuchte endophytischen Pilz Entomoerreger 5-9,11-19, und es ist als kommerzielles mycopesticide. Inokulation Methoden getestet, um festzustellen <em&gt; B. bassiana als Endophyten sind Boden durchnässt 14,17, Samenbeschichtungen 18 und Tauchgänge 14, radicle Dressings 13,15, Wurzel und Rhizom Tauchgänge 11,16,18, Stammzellen-Injektionen 17, Blattsprays 14,17,20 und Blüten Sprays 19. Mit Hilfe dieser Methoden haben die Forscher B. eingeführt bassiana in Bananenblätter 11, bean 7, Kakao 13, Kaffee 17, Mais 7, Baumwolle 7, Dattelpalme 12, Jute 21, Schlafmohn 20, Kürbis 7, radiata Kiefer 18, Sorghum 14, Tomate 7 und Weizen 7. Neuere Erkenntnisse legen nahe, dass endophytischen B. bassiana hat das Potential, nicht nur aus Pflanzen Arthropodenschädlinge 5-7,22-27 schützen, sondern auch aus einigen Pflanzenpathogene 9. Die gemeinsame Bohne (Phaseolus vulgaris) gehört zu den Pflanzen besonders anfällig für Schädlingeund Krankheiten. Es kann durch mehr als 400 Schädlinge und 200 Erreger, dessen Angriff wird angenommen, dass die Begrenzung der bean Produktionsfaktor in den Regionen 28 werden betroffen sein. Dementsprechend kann der gemeine Bohne ein hervorragendes Modell Ernte sein, um das gesamte Spektrum der endophytischen biologische Kontrolle von B. zu untersuchen bassiana. Als ersten Schritt in diese Richtung, beschreibt dieser Artikel Blattsprays und Boden durchnässt als Impfung Methoden B.bassiana als Endophyten in der gemeinen Bohne vorstellen.

<table border="1">
<tbody>
	<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Mycotrol SE	</td>
 <td>Laverlam</td>
 <td>4167</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Noble agar</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A5431-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Penicillin G sodium salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3032-25MU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (100 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (60 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-13A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Potato dextrose agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>213400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Regular bleach (NaOCl)</td>
 <td>CLOROX</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Streptomycin sulfate salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S6501-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Tetracycline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T3258-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triple quince (NPK)</td>
 <td>ABOCOL</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>X-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Biological safety cabinet</td>
 <td>NuAire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Hemocytometer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-671-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Leica DM LB microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control

Beauveria bassiana eine Pilz Entomoerreger mit der Fähigkeit zu Pflanzen endophytisch kolonisieren. Als Endophyt, B. bassiana eine Rolle beim Schutz der Pflanzen vor Insektenfraß und Krankheit spielen. Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden B. etablieren bassiana endophytisch in der gemeinen Bohne (Phaseolus vulgaris), in Vorbereitung für spätere Auswertungen endophytischer biologische Kontrolle. Die Pflanzen werden von der Oberfläche sterilisiert Samen für zwei Wochen, bevor er eine B. gewachsen bassiana Behandlung von 10 8 Sporen / ml (oder Wasser) angewendet entweder als Blattspray oder eines Bodens durchnässen. Zwei Wochen später werden die Pflanzen geerntet und ihre Blätter, Stängel und Wurzeln werden abgetastet, um endophytischen Pilzbesiedlung bewerten. Hierzu werden Proben einzeln sterilisiert Oberfläche geschnitten in mehrere Abschnitte und inkubiert in Kartoffeldextroseagar Medium für 20 Tage. Die Medien kontrolliert wird alle 2-3 Tage, um Pilz-Wachstum zu beobachtensociated mit Anlagenteilen und notieren das Auftreten von B. bassiana zu schätzen den Umfang ihrer endophytischen Kolonisation. Analysen der Impfung Erfolg vergleichen das Auftreten von B. bassiana innerhalb einer bestimmten Anlagenteil (dh Blätter, Stängel und Wurzeln) über Behandlungen und Kontrollen. Neben der Impfung Verfahren, das konkrete Ergebnis des Experiments kann auf die Zielkultur Art oder Sorte abhängen, belasten die Pilz Entomoerreger Arten oder isolieren verwendet, und die Pflanze Anbaubedingungen.

B. bassiana konnte endophytisch besiedeln P. vulgaris in Reaktion auf die Impfung nachgewiesen Behandlungen (Abbildung 1). Beide Blattsprays und Boden durchnässt führte endophytischen Besiedlung durch B. bassiana in über 80% der behandelten Pflanzen (Abbildung 2). Allerdings hing das Ausmaß der Besiedelung auf der Anlage Teil ausgewertet und die Impfung Methode verwendet. Leaves reagiert am besten auf spray Impfungen. Wurzeln, auf der anderen Seite, reagiert nur zu durchnässen Impfungen. Schließlich Stiele ähnlich beiden Inokulation Methoden reagiert. B. bassiana wurde in keinem der Steuerdaten Anlagenteile erfasst. Unabhängig von der Behandlung, mit Ausnahme von B. Endophyten bassiana wuchs von 15% der ausgewerteten Anlagenteile, aber sie wurden aus den Medien Platten zerlegt, bevor sie angrenzenden Abschnitte könnten eindringen und die Ergebnisse beeinflussen. Behandlung und Kontrolle Pflanzen waren sichtlich unterscheiden zwei Wochen nach Impfungen. Es wurden keine Unterschiede in ihrer Trockengewicht und in ihrer Höhe festgestellt. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse der Impfung Behandlungen auf endophytischen Kolonisierung der Bohne (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Durch Beauveria bassiana Oben links:. Kontrollplatten ohne Wachstum. Oben rechts: Fungal Endophyten aus einem Anlagenteil verunreinigen gesamte Platte. Unten links: B. bassiana wächst aus zwei Anlagenteilen. Unten rechts: Endophytic B. bassiana Konidien und Konidiophoren wie unter einem Mikroskop betrachtet. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Abbildung 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Abbildung 2. Wirkung der Impfung Behandlungen auf endophytischen Kolonisierung bean (Phaseolus vulgaris cv. Calima) von Beauveria bassiana, zwei Wochen nach Impfung mit dem Stamm GHA. Prozent Kolonisierung repräsentiert die Anzahl der besiedelten Anlagenteilen durch die Anzahl der gebildeten Abschnitte unterteilt.

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Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden, um den Pilz Entomoerreger einzuführen<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; Als Endophyten in der gemeinsamen Bohne (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), In Vorbereitung für nachfolgende Auswertungen der endophytische biologischen Kontrolle.

Gründung Fungal Entomopathogens als Endophyten: Gegen Endophytic Biological Control

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

34.4K Aufrufe.  International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia. Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden, um den Pilz Entomoerreger einzuführen Beauveria bassiana Als Endophyten in der gemeinsamen Bohne ( Phaseolus vulgaris), In Vorbereitung für nachfolgende Auswertungen der endophytische biologischen Kontrolle.

Serie: Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Forschung

Biotechnik

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imaging von biologischem Gewebe durch Desorption Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM der biologischen Baugruppen in Flüssig

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Synthese von Hydrogelen mit Antifouling-Eigenschaften als Membranen für die Wasserreinigung

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Synthese von biokompatiblen Liquid Crystal Elastomerschäume als Zellgerüste für 3D Spatial Zellkulturen

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

Erste 3D Cluster Zellkontrolle in einem Hybrid Gel Cube Gerät für wiederholbare Muster Formationen

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Experimental Methods to Study Human Postural Control

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied by appropriate mathematical methods are needed to understand the role of the different sub-systems involved in human postural control. This article describes a protocol for performing perturbed standing experiments, acquiring experimental data, and carrying out the subsequent mathematical analysis, with the aim of understanding the role of musculoskeletal system and central control in human upright posture. The results generated by these methods are important, because they provide insight into the healthy balance control, form the basis for understanding the etiology of impaired balance in patients and the elderly, and aid in the design of interventions to improve postural control and stability. These methods can be used to study the role of somatosensory system, intrinsic stiffness of ankle joint, and visual system in postural control, and may also be extended to investigate the role of vestibular system. The methods are to be used in the case of an ankle strategy, where the body moves primarily about the ankle joint and is considered a single-link inverted pendulum.

This article presents an experimental/analytic framework to study human postural control. The protocol provides step-by-step procedures for performing standing experiments, measuring body kinematics and kinetics signals, and analyzing the results to provide insight into the mechanisms underlying human postural control.

Experimentelle Methoden zur Erforschung der menschlichen Posturalkontrolle

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

Synthese von Nahinfrarot emittierenden Gold-Nanoclustern für biologische Anwendungen

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Elektrische und magnetische Feldgeräte zur Stimulation biologischer Gewebe

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...