생산 및 실험 작업은 여기 Reynaldo Pareja의 헌신적이고 열정적 인 도움을 반영 발표했다. 콜롬비아의 행정 과학학과, 기술과 혁신 (Colciencias)와 빌 &amp; 그랜드 도전의 탐험 사업을 통해 멜린다 게이츠 재단의 교부금으로 운용.

1. 식물 <ol><li> 표면 살균 0.5 % 차아 염소산 나트륨의 2 분 70 % 에탄올에 2 분을 immersing하여 콩 종자 (cv. Calima를). 멸균 증류수의 씨앗을 세 번 씻어. </li><li> 감자 dextroxe 한천 (PDA) 미디어에 마지막 린스 물을 100 μl를 도금, 25에서 10 일 동안 판을 잠복기하여 살균의 성공 ° C.를 평가 모든 성장은 판에 표시되는 경우 실험을 종료하고 다시 시작합니다. </li><li> 2시 1분 비율로 토양과 모래의 무균 혼합을 포함 냄비에 세 그룹의 종자를 심습니다. 25 성장 챔버 ° C, CA에 냄비를 전송합니다. 50% RH, 12 시간 photoperiod. 일주일 발아 후, 두 최소 힘차게 모종을 제거합니다. 멸균 증류수 및 NPK 15-15-15 비료 6g / L 물 솔루션으로 재배 한 후 10 이십일 비옥 물에 모든 2-3일. </li></ol> 2. 진균류 <ol><li> commer을 확보Beauveria bassiana 변형 가나 (Mycotrol SE, Laverlam, 칼리, 콜롬비아)의 cial 제형. </li><li> 단일 포자 주식 문화를 생성하려면 CA를 일시 중지합니다. 하나는 10 초에 0.1 % 물 튼-X 100의 솔루션과 소용돌이의 1 ML에 conidia의 전체 루프를 inoculating. 25 24 시간에 2.5 % 귀족 한천과 배양에 정지 후, 판 100 μl ° C. 100mm 플레이트가 포함 된 PDA에 하나의 germinating conidium를 전송하고 전체 플레이트 (ca. 3-4주)를 포함 할 때까지 성장합니다. </li><li> 무균 조건에서 매체의 표면에서 곰팡이 성장을 다쳤고, 10 ML 멸균 0.1 % 트리톤 - X 100에 일시 중지됩니다. 1 분 와동. 그런 다음 균사를 제거하고 주식 정지를 얻기 위해 멸균 일종의 투박한 무명을 통해 정지 필터링합니다. </li><li> 주식 정지 conidial 농도를 추정하기 위해 hemocytometer를 사용합니다. conidial 카운트를 촉진하기 때마다 100 μl O를 전송, 주식의 10,000 배 희석 시리얼을 준비F conidial 0.1 % 트리톤 - X 100 900 μl에 정지하고, 다음 희석하기 전에 10 초에 vortexing. </li><li> inoculum를 생성하려면 다음 수식을 사용하여 10 8 conidia / ML의 최종 농도에 주식 정지를 조정 : <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="방정식 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> 25에서 24 시간에 2.5 % 귀족 한천과 배양에 10,000 배 희석의 conidial 생존, 판 100 μl을 평가하기 위해 ° C. 그런 다음 %의 발아을 예측할 수 100 conidia 세 무작위로 그룹을 검사한다. germinated conidium을 고려 할 때의 conidium 프로젝트의 절반 직경보다 눈에 띄는 세균 관 이상. 평균 %의 발아이 90 %를 초과하는 경우에만 정지를 사용합니다. </li></ol> 3. 접종 <ol><li> 그들의 최초의 잎 단계 (ca. 십사일 재배 후)에 도달 할 때 식물의 예방. 멸균과 토양 용량 물 식물 증류예방 접종하기 전에 에드 물을 24 시간. </li><li> 잎 스프레이 방식의 경우 conidial 정지 (치료) 또는 0.1 % 트리톤 - X 100 (제어) 잎의 adaxial (위쪽) 표면에 사람들이 포화에 도달 할 때까지를 적용 할 수동 분무​​기를 사용합니다. 토양에 conidial 결선을 피하기 위해 알루미늄 호일로 냄비의 상단을 커버. 분사 후, 곰팡이 침략을 촉진 습도의 높은 수준을 유지하기 위해 24 시간을위한 비닐 봉지에 식물을 다룹니다. </li><li> 토양 물약 방법에 대해 conidial 정지 (치료)의 10 ML 또는 0.1 % 트리톤 - X 100 (제어) 공장의 바닥에있는 흙의 표면합니다.을 적용하기 위해 눈금 실린더를 사용하여 </li><li> 예방 접종 후, 무작위로 전체 블록 디자인을 주선 성장 방으로 식물을 반환합니다. 이하 사보다 추가 실험 블록이 같은 실험에서, endophytic 식민지의 평가뿐만 아니라, 식물 성장의 평가를 허용하도록 설치해야합니다. </li></ol> 4. 건강 검진 보고서uations <ol><li> 무작위 순서로 블록을 선택 한 번에 실험 한 블록을 평가합니다. 이 하루에 평가 될 수없는 대규모 실험에 특히 중요합니다. </li><li> 식물을 처리하기 전에 측정하고 기지에서 꼭대기의 분열 조직과의 높이를 기록합니다. 그런 다음, 신중하게 근절하고 수돗물을 실행에 철저하게 씻는다. </li><li> 각 공장, 샘플에서 두 전단지, 루트 두 가지와 줄기의 두 조각. 식물의 최초의 잎에서 무작위로 전단지 샘플을 선택합니다. 그런 다음, 식물의 중간에서와 토양 표면 근처에서 두 줄기 샘플, 3cm 길이의 각을 구하십시오. 마지막으로, 루트의 중간에서와 루트 끝 뒤에 1cm에서, 또한 3cm 길이 각각 두 개의 직근 샘플을 얻습니다. 적절하게 세 가지 종이 봉투 및 레이블에 샘플을 배치합니다. </li><li> 블록에있는 모든 식물을 세탁 및 샘플링 후, 다음, 잎을 처리하여 뿌리를 시작하고 마지막으로 줄기. </li><li> t를 검사 표면위의 1.1에서와 같이 무균 층류 후드에 문제를 해결합니다. 멸균 증류수에 침수하여 각 샘플을 세 번 씻어 살균 수건 종이에 말 리도록 해. 그런 다음 해부 및 endophytes은 소독제와의 접촉으로 인해 제거되었을 수있는 곳, 그 바깥 쪽 가장자리를 폐기하십시오. </li><li> 줄기와 뿌리에 잎과 6mm 길이에 대한 6x6 mm의 평균 여섯 부분으로 다듬어 샘플을 잘라 버릴거야. 판 2 밀리그램 / L 각에서 항생제의 테트라 사이클린, 스트렙토 마이신과 페니실린을 보충 PDA 미디어 60mm 페트리 접시에 여섯 섹션을 제공합니다. parafilm으로 판을 봉쇄하고 25 어둠 속에서 길러 ° C.를 각 공장은 여섯 접시, 두 당 공장의 일부를 얻을. </li><li> 특정 식물 부분의 각 블록을 처리 한 후 물을 씻어 변경합니다. 폐기하기 전에 사용 린스 물, 음식 ° C는 살균 성공을 25 10 일간 PDA 미디어 및 배양에 100 μl 샘플을 평가합니다. 곰팡이 성장이 ensues 경우, 분석에 해당하는 샘플을 고려하지 않습니다. </li><li> 곰팡이 성장을 관찰하고 기록하기 위해서는 20 일 동안 판 매 2-3 일 검사합니다. 소비세와 송금 공장 섹션 신선한 PDA를 포함하는 접시에 곰팡이 endophytes의 존재를 전시. 이것은 원래 판에 인접한 공장 섹션의 오염을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 기록 B. 식물 섹션에서 bassiana 성장. Beauveria bassiana는 특성 흰색 조밀 mycelia는 가장자리에 연한 노란색으로 크림이 될 때 추가로 식별 할 수 있습니다. 의심, 물 한 방울에 표본을 마운트 종의 특성 구형의 conidia과 지그재그 모양의 conidiophores, 찾고, 현미경으로 검사합니다. </li><li> 식물 바이오 매스에 대한 치료의 영향을 평가하기 위해 추가 실험 블록을 사용합니다. 첫째, 기지에서 꼭대기의 분열 조직의 상단에 자신의 높이를 측정합니다. 그런 다음, 신중하게 근절하고 수돗물에 식물을 씻어하고 건조 중량을 결정하기 위해 사흘 동안 45 ° C에서 그들을 건조 보자. </li></ol>

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(15), e683 (2008).</li><li>Parsa, S., Sotelo, G., Cardona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+herbivore+resistance+mechanisms:+spittlebugs+on+Brachiaria+spp.+as+an+example.">Characterizing herbivore resistance mechanisms: spittlebugs on Brachiaria spp. as an example.</a> J. Vis. Exp. (52), e3047 (2011).</li><li>Atamian, H., Roberts, P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+throughput+screens+with+root-knot+nematodes+Meloidogyne+spp.">High and low throughput screens with root-knot nematodes Meloidogyne spp.</a> J. Vis. Exp. (61), e3629 (2012).</li></ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

많은 요소가 endophyte으로 곰팡이 entomopathogen를 구축 할 수있는 실험의 구체적인 결과에 영향을 미칠 수있다. 결과는 접종 방법이 그 중 하나입니다 보여줍니다. 과 실험 생물 요소는 작물 종이나 개량 품종 선택하고 곰팡이 entomopathogen 종 변형을 포함하거나 사용 격리. 조작 고려해야 할 다른 요소는 inoculum의 농도, 예방 접종 동안 식물의 연령, 식물의 성장 조건이 포함되어 있습니다. 이 곰팡이 entomopathogen 14,17,18,21하여 체계적 식물의 식민지가 발생하는 접종 방법에 적합 할 것입니다. 대신, 접종 방법은 현지 식민지의 특정 패턴을 선호하는 경향이있는 것 같습니다. 토양 drenches 루트 식민지 17 선호하는 반면 커피에서 예를 들어, 잎 스프레이는 잎 식민지를 선호. 우리는 일반적으로 빈에서 동일한 패턴을 발견했다. 결국, 접종 방법의 선택은해야합니다아마 대상 herbivore 또는 식물 병원체의 틈새 시장을 일치 공장 내에서 endophyte의 의도 위치별로 안내. 미디어 문화에 따라 비록 일반적으로 사용되는, endophyte 감지 및 정량화는 비용이 많이 드는 어려운 및 오류 발생하기 쉬운 수 있습니다. 예를 들어, 10800 식물의 부분 (1,800 배양 접시에 도금)의 총 B.를 최적화하는 실험에서 평가 된 바나나 16 bassiana 예방 접종. 이 중에 4,496 섹션은 putative B.에 의해 식민지되었습니다 bassiana는 등 주로 식민지의 형태에 의해 식별. 분명, 각 식민지의 종의 미세 인증은 바람직하지만 unaffordable 단계이었습니다. 한편, 1176 섹션은 다른 곰팡이에 의해 식민지되었으며 폐기 및 데이터 (16) 누락으로 처리되었다. 확률은 B. 그러나, 존재 bassiana는 가난한 경쟁이나 성장 속도가 느린이었고, 결국 그 섹션에서 부상 할 수있는 경우llowed 충분한 시간. 따라서, 미디어 문화에 따라 endophyte 감지 방법은 잘못된 반응과 거짓 네거티브 필름이 적용됩니다. 따라서, 예를 들어, 더 신뢰할 수있는 탐지 및 정량화 방법의 개발은 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) assays 20,21,24에 따라 사람들은 잘 정당화된다. 접종 실험의 궁극적 인 목표는 herbivory 및 / 또는 질병에 대한 내구성이 전신 저항을 제공하는 효율적인 치료를 개발해야합니다. 그럴듯하지만 아직까지는 untested, 가설은 endophytic 식민지의 범위는 endophyte로 인한 저항의 범위와 긍정적 인 상관 관계를해야한다는 것입니다. 접종 방법을 수정 한 후 자연 다음 단계는 않으므로,이 상관 관계를 조사 할 수 있습니다. 여러 비디오 프로토콜은 연구자 대상 해충이나 병원균 29-31에 적합한 저항 분석을 설계 할 수 있습니다. 궁극적으로, 그것은 inocula의 성공을 결정합니다 어떤이 검정입니다기 방법, 그리고 endophytic 생물학적 방제를위한 관련 가능성.

곰팡이 entomopathogens는 mycopesticides 1로 상당한 잠재력을 지닌 곤충 집단의 중요한 조절기입니다. 최근에, 그러나, 곰팡이 entomopathogens이 endophytes 모두 자연스럽게 다양한 접종 방법 2 반응으로 발생하는 표시되었습니다. endophytic 곰팡이 entomopathogens의 생태 기능은 대부분 알 수없는 남아 있지만, 일부 연구는 식물의 성장 3,4, herbivore 저항 5-8, 질병 저항 9,10에서 그들을 연루 있습니다. 여기에 제시된 방법의 전반적인 목적은 endophytic 생물학적 방제의 후속 평가에 대한 준비, endophyte로 곰팡이 entomopathogen을 소개하는 것입니다. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota : Hypocreales)는 최고의 연구 endophytic 곰팡이 entomopathogen 5-9,11-19이며, 상업 mycopesticide로 사용할 수 있습니다. 접종 방법은 확립 테스트 <em&gt; B. endophyte으로 bassiana는 토양 drenches 14,17, 종자 코팅 18 immersions 14 잔뿌리 드레싱 13,15, 루트와 rhizome immersions 11,16,18, 줄기 주사 17, 잎 스프레이 14,17,20와 꽃 스프레이 19 등이 있습니다. 이러한 방법을 사용하여, 연구자들은 B.를 도입 한 bassiana 바나나 11, 콩 7, 카카오 13, 커피 17, 옥수수 7면 7, 날짜 야자 12, 주트 사람 21 아편 양귀비 20, 호박 7 radiata 소나무 18 수수 14, 토마토 7 밀 7에. 최근 증거 endophytic B.를 제안 bassiana는뿐만 아니라 arthropod 해충 5-7,22-27에서 식물을 보호 할 수있는 잠재력을 가지고 있지만, 일부 식물 병원균 9. 일반 콩 (Phaseolus vulgaris의)는 해충에 가장 취약한 작물 사이에 위및 질병. 그것은 그의 공격 지역 28에서 가장 제한 콩 생산 요소로 생각됩니다 400 개 이상의 해충 200 병원균에 의해 영향을받을 수 있습니다. 따라서, 일반적으로 콩은 B.에 의해 endophytic 생물학적 방제의 전체 스펙트럼을 조사하는 훌륭한 모델 작물 될 수 있습니다 bassiana. 이 방향으로 첫 번째 단계로,이 글은 일반적인 콩의 endophyte로 B.bassiana을 소개 접종 방법으로 잎 스프레이와 토양 drenches에 대해 설명합니다.

<table border="1">
<tbody>
	<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Mycotrol SE	</td>
 <td>Laverlam</td>
 <td>4167</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Noble agar</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A5431-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Penicillin G sodium salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3032-25MU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (100 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (60 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-13A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Potato dextrose agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>213400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Regular bleach (NaOCl)</td>
 <td>CLOROX</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Streptomycin sulfate salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S6501-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Tetracycline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T3258-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triple quince (NPK)</td>
 <td>ABOCOL</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>X-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Biological safety cabinet</td>
 <td>NuAire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Hemocytometer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-671-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Leica DM LB microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control

Beauveria bassiana는 endophytically 식물을 이식 할 수있는 능력을 곰팡이 entomopathogen입니다. endophyte, B.로 bassiana는 herbivory과 질병으로부터 식물을 보호하는 역할을 재생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 B.를 설정하는 두 가지 접종 방법을 보여줍니다 endophytic 생물학적 방제의 후속 평가에 대비 일반 콩 (Phaseolus vulgaris)에 endophytically bassiana. 식물은 B.를 받고 2 주 후면에 표면 소독 종자에서 재배 10 8 conidia / ML (또는 물)의 bassiana 치료는 잎 스프레이 또는 토양 물약으로도 적용했습니다. 2 주 후에 식물 수확을하고 있으며 잎, 줄기 및 뿌리는 endophytic 곰팡이 식민지을 평가하는 샘플입니다. 이 경우, 샘플은 개별적으로 여러 부분으로 절단, 소독 표면되며, 20 일 동안 감자 덱스 트로 오스 한천 미디어에서 incubated. 미디어로 곰팡이 성장을 관찰 할 때마다 2-3일 검사를식물 섹션과 sociated와 B의 발생을 기록 bassiana는 endophytic 식민지의 범위를 측정합니다. 접종의 성공 분석은 B.의 발생을 비교 트리트먼트와 컨트롤에서 특정 식물의 부분에서 bassiana (예 : 잎, 줄기 또는 뿌리). 접종 방법뿐만 아니라, 실험의 구체적인 결과가 대상 작물 종이나 다양한에 따라 달라질 수 있습니다, 곰팡이 entomopathogen 종 변형 또는 사용 분리 및 식물의 성장 조건.

B. bassiana는 P.을 endophytically - 이식 할 수있었습니다 증명 접종 트리트먼트 (그림 1)에 대응 vulgaris. 잎 스프레이와 토양 drenches 모두 B.에 의해 endophytic 식민지 결과 처리 식물의 80 %에 bassiana (그림 2). 그러나, 식민지의 정도는 평가 공장 부분 및 사용 접종 방법에 의존한다. 잎은 스프레이 예방 접종에 가장 응답했습니다. 뿌리는 반면에, 만 물약 예방 접종에 응답했습니다. 마지막으로, 줄기 모두 접종 방법에 유사하게 대응했다. B.는 bassiana는 제어 공장 섹션 중 하나에 발견되지 않았습니다. B. 이외의 치료, endophytes의 독립 bassiana는 평가 플랜트 섹션의 15 %에서 증가하지만, 그 주변 부분을 침공하고 결과에 영향을 줄 수 전에이 미디어 판에서 로그 해부했다. 치료 및 제어 식물 두 주 예방 접종 후 가시적 구분할 수 있었다. 어떤 차이는 자신의 건조 무게와 높이 감지되지 않았습니다. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. Beauveria bassiana의 콩 식물의 endophytic 식민지 (. Phaseolus vulgaris CV Calima)에 접종 트리트먼트 대표 결과 왼쪽 상단 :. 제어없이 성장과 접시. 오른쪽 상단 : 전체 판을 오염 공장 섹션에서 곰팡이 endophyte. 왼쪽 하단 : B. bassiana 두 개의 공장 섹션에서 성장. 오른쪽 하단 : Endophytic B. bassiana conidia와 conidiophores은 현미경으로 본 적 있어요. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> 그림 2. BEA의 endophytic 식민지에 접종 트리트먼트 효과변형 가나와 예방 접종 후 Beauveria bassiana 두 주에 의해 N 식물 (Phaseolus vulgaris 이력서. Calima가). 비율 식민지는 교양 섹션의 수로 나눈 식민지 식물 섹션의 수를 나타냅니다.

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Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

이 프로토콜은 곰팡이 entomopathogen을 소개하는 두 접종 방법을 보여줍니다<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; 일반 콩에 endophyte로 (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), endophytic 생물학적 방제의 후속 평가에 대한 준비 인치

Endophytes로 곰팡이 Entomopathogens 구축 : Endophytic 생물학적 방제 향해

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

34.4K 조회수.  International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia. 이 프로토콜은 곰팡이 entomopathogen을 소개하는 두 접종 방법을 보여줍니다 Beauveria bassiana 일반 콩에 endophyte로 ( Phaseolus vulgaris), endophytic 생물학적 방제의 후속 평가에 대한 준비 인치

비디오: Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

연구

생체공학

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

탈착 전기 분무 이온화 질량 분석에 의한 생물 조직의 이미지

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

시투에서 액체에 있는 생물학 어셈블리의 TEM

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

물 정화를위한 막으로 방오 특성을 가진 히드로 겔의 합성

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

3D 공간 세포 배양을위한 세포 발판으로 생체 적합성 액정 엘라스토머 거품의 합성

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Experimental Methods to Study Human Postural Control

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied by appropriate mathematical methods are needed to understand the role of the different sub-systems involved in human postural control. This article describes a protocol for performing perturbed standing experiments, acquiring experimental data, and carrying out the subsequent mathematical analysis, with the aim of understanding the role of musculoskeletal system and central control in human upright posture. The results generated by these methods are important, because they provide insight into the healthy balance control, form the basis for understanding the etiology of impaired balance in patients and the elderly, and aid in the design of interventions to improve postural control and stability. These methods can be used to study the role of somatosensory system, intrinsic stiffness of ankle joint, and visual system in postural control, and may also be extended to investigate the role of vestibular system. The methods are to be used in the case of an ankle strategy, where the body moves primarily about the ankle joint and is considered a single-link inverted pendulum.

This article presents an experimental/analytic framework to study human postural control. The protocol provides step-by-step procedures for performing standing experiments, measuring body kinematics and kinetics signals, and analyzing the results to provide insight into the mechanisms underlying human postural control.

인간의 자세 제어를 연구하는 실험 방법

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

생물학적 응용 을 위한 근적외선 방출 금 나노클러스터의 합성

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

생물학적 조직의 자극을 위한 전기 및 자기장 장치

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...