A produção eo trabalho experimental aqui apresentados refletem a ajuda dedicado e entusiasta de Reynaldo Pareja. Financiado pelo Departamento Administrativo da Colômbia de Ciência, Tecnologia e Inovação (Colciencias) e por uma doação da Fundação Bill &amp; Melinda Gates através da Grande iniciativa Explorations Desafios.

1. Plantas <ol><li> Surface-esterilizar as sementes de feijão (cv. Calima) por imersão durante dois minutos em hipoclorito de sódio a 0,5%, e dois minutos em etanol a 70%. Enxaguar as sementes três vezes em água destilada estéril. </li><li> Avaliar o sucesso da sua esterilização através do plaqueamento de 100 ul de água de enxaguamento final em agar de batata dextroxe (PDA) meios de comunicação, e incubando a placa durante 10 dias a 25 ° C. Encerrar e reiniciar o experimento se algum crescimento é visto na placa. </li><li> Plantar as sementes, em grupos de três em vasos contendo uma mistura estéril de solo e areia numa proporção de 2:1. Transferir os vasos para uma câmara de crescimento a 25 ° C, ca. 50% UR e 12 horas de fotoperíodo. Uma semana após a germinação, eliminar os menos duas mudas vigorosas. De água cada 2-3 dias com água destilada estéril e fertilizar 10 e 20 dias após plantação, com uma solução de água de 6 g / L de fertilizante NPK 15-15-15. </li></ol> 2. Fungo <ol><li> Obter um commerformulação social de Beauveria bassiana cepa GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colômbia). </li><li> Para gerar uma cultura de um único esporo, suspender ca. um circuito de inoculação cheia de conídios em 1 ml de uma solução aquosa a 0,1% de Triton X-100 e vortex durante 10 seg. Em seguida, a placa 100 uL da suspensão em 2,5% de agar Noble e incubar durante 24 horas a 25 ° C. Transferir um único conídio germinando em um PDA placa contendo 100 milímetros e crescer até cobrir toda a placa (cerca de 3-4 semanas). </li><li> Sob condições estéreis, raspar o crescimento de fungos na superfície do meio e suspendê-lo em 10% de 0,1 ml estéril Triton X-100. Vortex durante um minuto. Em seguida, filtrar a suspensão através de uma gaze estéril para remover hifas e obter a suspensão de estoque. </li><li> Usar um hemocitómetro para estimar a concentração de conídios de a suspensão de estoque. Para facilitar a contagem de conídios, preparar uma diluição de 10 mil vezes em série das ações, cada vez que a transferência de 100 o ulf suspensão de conídios em 900 ul de 0,1% de Triton X-100, e vortex durante 10 segundos antes da diluição seguinte. </li><li> Para gerar o inóculo, ajustar a suspensão de pasta até uma concentração final de 10 8 conídios / ml, utilizando a fórmula: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="equação 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Para avaliar a viabilidade de conídios, a placa 100 uL de uma diluição de 10.000 vezes em 2,5% de agar Noble e incubar durante 24 horas a 25 ° C. Então, inspecionar três grupos aleatórios de 100 conídios para estimar a germinação por cento. Considere um conídio germinado quando um tubo de germe visível superior a metade do diâmetro dos projectos de conídios a partir dele. Só use a suspensão quando a porcentagem de germinação média superior a 90%. </li></ol> 3. Inoculação <ol><li> Inocular plantas quando atingirem o estágio de primeiras folhas (cerca de 14 dias após o plantio). As plantas aquáticas para a capacidade do solo estéril com destilared água 24 horas antes da inoculação. </li><li> Para o método de pulverização da folhagem, utilizar um atomizador manual para aplicar a suspensão de conídios (tratamento) ou 0,1% de Triton X-100 (testemunha) para a superfície (superior) adaxial de folhas até atingirem a saturação. Cobrir a parte superior do vaso com folha de alumínio para evitar o escoamento de conídios ao solo. Após a pulverização, as plantas cobrir com um saco de plástico durante 24 horas para manter um elevado nível de humidade facilitando invasão de fungos. </li><li> Para o método de rega do solo, utilizar um cilindro graduado para aplicar 10 ml de suspensão de conídios (tratamento) ou 0,1% de Triton X-100 (testemunha) para a superfície do solo na base da planta. </li><li> Após a inoculação, as plantas retornar para as câmaras de crescimento organizando-os em um delineamento em blocos casualizados. Nada menos do que quatro blocos experimentais adicionais devem ser instalados para possibilitar a avaliação do crescimento das plantas, além de avaliações de colonização endofítica, no mesmo experimento. </li></ol> 4. Evaluations <ol><li> Avaliar a experiência um bloco de cada vez, a selecção dos blocos por ordem aleatória. Isto é particularmente importante para as experiências de grandes dimensões que não podem ser avaliados num único dia. </li><li> Antes de processamento de uma planta, medir e registar a sua altura a partir da base para o meristema apical. Então, arrancar com cuidado e lave em água corrente. </li><li> De cada planta amostra, dois folhetos, dois pedaços de raiz e dois pedaços de caule. Seleccionar amostras aleatoriamente a partir do folheto da primeira folha verdadeira da planta. Em seguida, obter duas amostras estaminais, 3 cm de comprimento cada, a partir do meio da planta e de perto da superfície do solo. Finalmente, obter duas amostras taproot, também 3 cm de comprimento cada, a partir do meio da raiz e a partir de 1 cm atrás da ponta da raiz. Colocar as amostras em três sacos de papel separados e etiqueta de forma adequada. </li><li> Depois de lavar e amostragem todas as plantas em um bloco, começar pelo processamento das folhas, raízes, em seguida, e, finalmente, as hastes. </li><li> Superfície esterilizar tquestões em um capuz de fluxo laminar estéril como em 1.1, acima. Lavar cada amostra três vezes por imersão em água destilada estéril e deixe secar em papel toalha estéril. Então, dissecar e descartar suas bordas exteriores, onde endófitos poderiam ter sido eliminado devido ao contato com desinfetantes. </li><li> Cortar a amostra cortada em seis seções, com média de 6x6 mm para as folhas e 6 mm de comprimento para caules e raízes. Placa das seis secções sobre uma placa de Petri 60 mm com meio BDA suplementado com o antibiótico tetraciclina, estreptomicina e penicilina a 2 mg / L de cada. Selar a placa com parafilme e incubadas no escuro a 25 ° C. Cada planta produz seis pratos, duas peças por planta. </li><li> Mude a água de enxágüe após o processamento de cada bloco de uma parte determinada planta. Antes de eliminar a água de lavagem utilizada chapa, uma amostra de 100 ul de meio BDA e incubar durante 10 dias a 25 ° C para avaliar o sucesso da esterilização. Se o crescimento de fungos se segue, não consideram as amostras correspondentes para análise. </li><li> Inspecionar as placas a cada 2-3 dias durante 20 dias para observar e registrar crescimento de fungos. Seções especiais sobre o consumo de plantas e transferência exibindo presença de endófitos fúngicos para placas contendo PDA fresco. Isto irá evitar a contaminação das secções de plantas vizinhas na placa original. </li><li> Registro B. bassiana crescimento das partes da instalação. Beauveria bassiana podem ser identificados por micélio branco característico denso tornando o creme a amarelo pálido na borda. Quando em dúvida, montar o espécime em uma gota de água e verifique sob um microscópio, procurando globosa conídios e em forma de ziguezague conidióforos, característica da espécie. </li><li> Use blocos experimentais adicionais para avaliar o impacto dos tratamentos sobre a biomassa da planta. Em primeiro lugar, mede a sua altura a partir da base para o topo do meristema apical. Então, cuidadosamente desenraizar e lavar as plantas em água da torneira e deixar secar a 45 ° C durante três dias, para determinar o seu peso seco. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Muitos fatores podem influenciar o resultado de um experimento específico para estabelecer um entomopatógeno fungos como um endófito. Os nossos resultados demonstram o método de inoculação é um deles. Fatores biológicos para experimentar com incluem a colheita de espécies ou de cultivares selecionadas e do fungo entomopatogênico tensão espécies ou isolar usado. Outros factores a considerar incluem a manipulação da concentração do inoculo, a idade da planta durante a inoculação, e as condições de crescimento da planta. Seria ideal para um método de inoculação de resultar em colonização planta sistémica por um fungo entomopatógeno 14,17,18,21. Em vez disso, parece que os métodos de inoculação tendem a favorecer um padrão específico de colonização local. No café, por exemplo, pulverizações foliares, ao passo que favorecem a colonização folha poções solo favorecem a colonização de raiz 17. Encontramos o mesmo padrão do feijoeiro comum. Finalmente, a escolha do método de inoculação deve serguiado pelo local pretendido do endófito dentro de uma planta, provavelmente combinando o nicho do herbívoro alvo ou patógeno de planta. Embora comumente usado detecção, endófito e quantificação com base em meios de cultura pode ser caro, difícil e sujeito a erros. Por exemplo, um total de 10.800 partes de plantas (plaqueadas em placas de Petri 1800) foram avaliados num ensaio de optimizar B. inoculações bassiana em banana 16. Destes, 4.496 seções foram colonizados por um suposto B. bassiana, conforme identificado principalmente pela morfologia das colónias. Claramente, uma verificação microscópica das espécies para cada colônia teria sido um passo desejável, mas inacessível. Por outro lado, as secções 1176 foram colonizados por outros fungos e foram descartados e tratados como dados perdidos 16. A probabilidade de existir, no entanto, que a B. bassiana era um concorrente pobres ou mais lento a crescer, e poderia ter eventualmente emergiu dessas seções se umtempo suficiente llowed. Portanto, os métodos de detecção de endofíticos baseados em culturas de mídia estão sujeitos a falsos positivos e falsos negativos. Por conseguinte, o desenvolvimento de uma detecção mais fiável e quantificação de métodos, por exemplo aquelas baseadas em reacção em cadeia de polimerase (PCR) 20,21,24, é bem justificado. O objetivo final para experimentos de inoculação deve ser desenvolver um tratamento eficaz que proporciona resistência sistêmica durável contra herbivoria e / ou doença. Um plausível, mas ainda não testados, a hipótese é a de que a extensão da colonização endofítica deve correlacionar-se positivamente com o grau de resistência mediada endófita. Um próximo passo natural após o refino métodos de inoculação, portanto, poderia ser a de examinar essa correlação. Vários protocolos de vídeo pode ajudar os pesquisadores a desenvolver um ensaio de resistência adequada para uma praga ou patógeno alvo 29-31. Em última análise, este ensaio é o que vai determinar o sucesso da inóculosmétodo ção, e do potencial para o controle biológico associado endofítica.

Entomopatógenos fungos são importantes reguladores das populações de insetos com potencial considerável como mycopesticides 1. Apenas recentemente, contudo, tem sido mostrado por fungos entomopatógenos a ocorrer como endófitos, ambos naturalmente e, em resposta a vários métodos de inoculação 2. A função ecológica da endofíticas entomopatógenos fúngicas permanece em grande parte desconhecida, mas alguns estudos têm implicado los no crescimento de plantas 3,4, resistência herbívoro 5-8, e resistência a doenças 9,10. O objetivo geral dos métodos apresentados aqui é a introdução de um entomopatógeno fungos como um endófito, em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) é a mais estudada entomopatógeno fúngica endofítica 5-9,11-19, e está disponível como uma mycopesticide comercial. Métodos de inoculação testados para estabelecer <em&gt; B. bassiana como um endófito incluem poções solo 14,17, revestimentos de sementes 18 e 14 imersões, curativos radícula 13,15, de raiz e imersões rizoma, caule 11,16,18 injeções 17, pulverizações foliares 14,17,20 e sprays de flores 19. Utilizando estes métodos, os investigadores introduziram B. bassiana em 11 de banana, feijão 7, 13 cacau, café, 17, 7 milho, algodão 7, tamareira 12, juta 21, 20 papoula, abóbora 7, pinheiros radiata 18, 14 de sorgo, tomate e trigo 7 7. Evidências recentes sugerem que B. endofítica bassiana tem o potencial para proteger as plantas, não só a partir de pestes artrópodes 5-7,22-27, mas também de alguns agentes patogénicos de plantas 9. O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) está entre as culturas mais vulneráveis ​​a pragase doenças. Ele pode ser afetada por mais de 400 pragas e patógenos 200, cujo ataque é pensado para ser o fator mais limitante da produção de feijão em todas as regiões 28. Por conseguinte, o feijão comum pode ser uma colheita excelente modelo para estudar o espectro de controlo biológico endofítica por B. bassiana. Como um primeiro passo nesta direção, este artigo descreve pulverizações foliares e poções do solo como métodos de inoculação para introduzir B.bassiana como um endófito em feijoeiro.

<table border="1">
<tbody>
	<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Mycotrol SE	</td>
 <td>Laverlam</td>
 <td>4167</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Noble agar</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A5431-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Penicillin G sodium salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3032-25MU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (100 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (60 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-13A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Potato dextrose agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>213400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Regular bleach (NaOCl)</td>
 <td>CLOROX</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Streptomycin sulfate salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S6501-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Tetracycline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T3258-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triple quince (NPK)</td>
 <td>ABOCOL</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>X-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Biological safety cabinet</td>
 <td>NuAire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Hemocytometer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-671-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Leica DM LB microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control

Beauveria bassiana é um entomopatógeno fúngico com a capacidade de colonizar plantas endofíticamente. Como um endófito, B. bassiana podem desempenhar um papel na protecção de plantas a partir de herbivoria e doença. Este protocolo demonstra dois métodos de inoculação para estabelecer B. bassiana endofíticamente no feijão comum (Phaseolus vulgaris), em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica. As plantas são cultivadas a partir de sementes esterilizadas na superfície, durante duas semanas antes de receberem a B. bassiana tratamento de 10 8 conídios / ml (ou água) aplicado quer como uma pulverização foliar ou uma rega do solo. Duas semanas depois, as plantas são colhidas e suas folhas, caules e raízes são colhidas amostras para avaliar a colonização de fungos endofíticos. Para isso, as amostras foram individualmente superfície esterilizada, cortadas em secções múltiplas, e incubados em meio de batata dextrose ágar durante 20 dias. A mídia é inspecionado a cada 2-3 dias para observar o crescimento de fungos comoassociada com seções de plantas e registrar a ocorrência de B. bassiana para estimar a extensão da sua colonização endofítica. As análises de sucesso inoculação comparar a ocorrência de B. bassiana dentro de uma parte determinada planta (folhas, caules ou seja, ou raízes) entre os tratamentos e controles. Para além do método de inoculação, o resultado específico da experiência pode depender da espécie alvo ou variedade de culturas, as espécies de fungos entomopatógenos estirpe ou isolar utilizado, e as condições de crescimento da planta.

B. bassiana foi capaz de colonizar endofíticamente-p vulgaris, em resposta aos tratamentos com inoculação demonstrado (Figura 1). Ambas as pulverizações foliares e de solo poções resultou na colonização endofítica por B. bassiana, em mais de 80% das plantas tratadas (Figura 2). No entanto, a extensão da colonização depende da parte da planta avaliada eo método de inoculação utilizado. Folhas respondem melhor a inoculações de pulverização. Raízes, por outro lado, respondeu apenas a inoculações rega. Finalmente, caules responderam de forma semelhante para ambos os métodos de inoculação. B. bassiana não foi detectada em qualquer uma das secções de controlo de plantas. Independente do tratamento, outros endófitos que B. bassiana cresceu de 15% das secções de plantas avaliadas, mas eles foram dissecados a partir de placas de meios antes que pudessem invadir secções vizinhas e influenciar os resultados. Estações de tratamento e controle foram visivelmente indistinguíveis duas semanas após a inoculação. Não foram detectadas diferenças em seu peso seco e na sua altura. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Os resultados representativos de inoculação sobre a colonização endofítica de plantas de feijão (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Por Beauveria bassiana superior esquerdo:. Controle de placas com nenhum crescimento. Superior direito: endófito fúngica de uma seção planta contaminando placa inteira. Canto inferior esquerdo: B. bassiana crescente a partir de duas partes da instalação. Inferior direito: endofítico B. bassiana e conidióforos como visto sob um microscópio. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Figura 2. Efeito da inoculação na colonização endofítica de beaplantas n (Phaseolus vulgaris cv. Calima) por Beauveria bassiana, duas semanas após a inoculação com a estirpe. GHA colonização por cento representa o número de secções de plantas colonizadas, dividido pelo número de secções de cultura.

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Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Este protocolo demonstra dois métodos de inoculação de introduzir o entomopatógeno fungos<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; Como um endófito em feijoeiro (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), Em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica.

Estabelecer Entomopatógenos fúngicas como endófitos: Rumo Controle Biológico endofítico

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

34.4K visualizações.  International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia. Este protocolo demonstra dois métodos de inoculação de introduzir o entomopatógeno fungos Beauveria bassiana Como um endófito em feijoeiro ( Phaseolus vulgaris), Em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica.

Vídeo: Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Bioengenharia

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imagem de tecidos biológicos por dessorção ionização electrospray Espectrometria de Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM de Assembleias Biológicas em Líquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Síntese de hidrogeles com propriedades anti-deposição como membranas de purificação de água

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Síntese de biocompatíveis cristal líquido de elastómero Espumas como andaimes celulares para cultura de células 3D espaciais

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

Controle de Cluster inicial célula 3D em um dispositivo de cubo híbrido Gel para formações padrão repetitivo

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Experimental Methods to Study Human Postural Control

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied by appropriate mathematical methods are needed to understand the role of the different sub-systems involved in human postural control. This article describes a protocol for performing perturbed standing experiments, acquiring experimental data, and carrying out the subsequent mathematical analysis, with the aim of understanding the role of musculoskeletal system and central control in human upright posture. The results generated by these methods are important, because they provide insight into the healthy balance control, form the basis for understanding the etiology of impaired balance in patients and the elderly, and aid in the design of interventions to improve postural control and stability. These methods can be used to study the role of somatosensory system, intrinsic stiffness of ankle joint, and visual system in postural control, and may also be extended to investigate the role of vestibular system. The methods are to be used in the case of an ankle strategy, where the body moves primarily about the ankle joint and is considered a single-link inverted pendulum.

This article presents an experimental/analytic framework to study human postural control. The protocol provides step-by-step procedures for performing standing experiments, measuring body kinematics and kinetics signals, and analyzing the results to provide insight into the mechanisms underlying human postural control.

Métodos experimentais para estudar o controle postural humano

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

Síntese de nanoaglomerados de ouro emissor próximos para aplicações biológicas

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositivos de campo elétrico e magnético para estimulação de tecidos biológicos

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...