生産と実験的な作品は、本明細書でレイナルドパレハの献身的で熱心な助けを反映提示。科学技術革新のコロンビアの管理部門（Colciencias）により、グランドチャレンジレーションズ·イニシアチブを通じてビル＆メリンダ·ゲイツ財団からの助成金によって賄われて。

1。植物<ol><li> 0.5％次亜塩素酸ナトリウム、70％エタノールで2分で2分のためにそれらを浸漬することにより豆の種子（品カリマ）の表面殺菌。種子を滅菌蒸留水で3回リンスする。 </li><li>ジャガイモdextroxeス寒天（PDA）培地上で最後の​​すすぎ水100μlをメッキし、25℃で10日間プレートをインキュベートすることによって殺菌の成功℃を評価するどんな成長がプレート上に確認された場合の実験を終了し、再起動します。 </li><li> 2:1の比率で土と砂の混合物を含有する無菌のポットに3つのグループに種を植える。 25℃で成長チャンバ℃、CAに鉢を移す。 50％RH、12時間日長。一週間発芽後、2つ以上積極的な苗を排除します。水滅菌蒸留水で2〜3日毎とNPK 15-15-15の肥料6g / Lの水溶液で播種後10日と20日肥やす。 </li></ol> 2。菌<ol><li>商業を得るボーベリアひずみGHA（Mycotrol SE、Laverlam、カリ、コロンビア）の金融製剤。 </li><li>単一胞子在庫文化を生成するには、CAを中断します。 1は、Triton X-100、10秒間ボルテックスの0.1％水溶液1mlに分生子の完全なループを接種。その後、25℃で24時間プレートは2.5％ノーブル寒天とインキュベート上の懸濁液100μl℃、 PDAを含む100mmプレートに単発芽分生子を転送し、それがプレート全体（約3〜4週間）をカバーするまでに成長。 </li><li>無菌条件下で、培地の表面から真菌の増殖を削ると10 mlの滅菌0.1％トリトンX-100でそれを中断します。 1分間ボルテックスする。その後、菌糸を除去し、純正サスペンションを得るために無菌寒冷紗を通して懸濁液をろ過する。 </li><li>純正サスペンションの分生子濃度を推定するために血球計を使用してください。生子カウントを容易にするため、各時間は、100μlのoを譲渡、株式の10,000倍希釈を準備0.1％トリトンX-100、および次の希釈前に10秒間ボルテックス900μlの中のf分生子懸濁液。 </li><li>接種材料を生成するには、次式を用いて、10 8分生子/ mlの最終濃度に純正サスペンションを調整します。 <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="式（1）" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> 25℃で24時間、2.5パーセントノーブル寒天、インキュベートで10,000倍希釈液の分生子の生存率、プレートを100μlを評価するために℃のその後、パーセント発芽を推定するために100分生子の3つのランダムなグループを検査します。発芽分生子を考えると、そこから分生子プロジェクトの直径の半分以上見える発芽管より長い。平均パーセント発芽率が90％を超えた場合にのみサスペンションを使用しています。 </li></ol> 3。接種<ol><li>彼らは最初の真の葉期（播種後約14日間）に達したときに植物を植菌する。無菌蒸留による土壌容量に水プラントED水の接種前に24時間。 </li><li>葉面散布の方法については、それらが飽和状態に達するまでの葉の向軸（上側）表面に分生子懸濁液（治療）または0.1％トリトンX-100（コントロール）を適用するには、手動噴霧器を使用しています。土壌に分生子の流出を避けるためにアルミホイルで鍋の上部を覆う。噴霧した後、菌の侵入を容易に湿度の高いレベルを維持するために24時間、ビニール袋で植物をカバーしています。 </li><li>土壌灌注方法については、植物の根元の土壌の表面に分生子懸濁液10ml（治療）または0.1％トリトンX-100（コントロール）を適用するためにメスシリンダーを使用しています。 </li><li>接種後、乱塊法でそれらを整理して成長室に植物を返す。劣らず4より追加の実験ブロックは同じ実験で、内生の植民地化の評価に加えて、植物の成長の評価を可能にするためにインストールする必要があります。 </li></ol> 4。評価uations <ol><li>ランダムな順序でブロックを選択し、一度に実験1ブロックを評価します。これは1日で評価できない大実験のために特に重要です。 </li><li>植物を処理する前に、測定し基部から頂端分裂組織にその高さを記録します。その後、慎重に根絶し、水道水の流水でよく洗ってください。 </li><li>各工場から、サンプル2リーフレット、根の2個、茎の二枚。植物の最初の本葉からランダムリーフレットのサンプルを選択します。その後、工場の真ん中から、土壌表面付近から、2幹サンプル、3センチ長さがそれぞれを得る。最後に、ルートの途中からと根端の後ろに1cmから、また、3 cmの長さがそれぞれ、2主根のサンプルを入手してください。適当に3つの別々の紙袋やラベルにサンプルを置きます。 </li><li>ブロック内のすべての植物を洗浄、サンプリングした後、最終的に根、茎、次に葉を処理することによって開始します。 </li><li>表面はトンを消毒上記1.1のような無菌層流フードで問題。滅菌蒸留水に浸漬することにより、各サンプルを3回リンスし、滅菌タオルペーパーで乾燥させます。その後、エンドファイトが消毒との接触により排除されている可能性があり、その外側のエッジを、解剖して廃棄します。 </li><li>茎や根の葉と6mmの長い間、6x6のミリメートルを平均、6つのセクションにトリミングされたサンプルをカットします。プレート2 mg / Lのそれぞれにおける抗生物質テトラサイクリン、ストレプトマイシン、ペニシリン、PDAのメディアと60ミリメートルペトリ皿の上に6つのセクション。パラフィルムでプレートをシールし、25℃、暗所でインキュベート℃を各工場では、6つのプレート、2当たりの植物の一部が得られます。 </li><li>与えられた植物の部分の各ブロックを処理した後、すすぎ水を変更します。捨てる前に使用し、水洗、プレート℃は殺菌の成功を25℃で10日間インキュベートし、PDA、メディア上に100μlのサンプルを評価した。真菌の増殖が続いて起こる場合には、分析のための対応するサンプルを考慮していない。 </li><li>真菌の増殖を観察し、記録するために20日間、2〜3日毎プレートを点検してください。物品税と移転植物のセクションでは、新鮮なPDAを含むプレートに真菌エンドファイトの存在を示す。これは、元のプレート内の隣接するプラントセクションの汚染を避けることができます。 </li><li> レコード Bプラントセクションからバッシアナ成長 。 ボーベリアは、特徴的な白い菌糸が密なエッジで淡黄色にクリームになることによって識別することができます。疑問がある場合は、一滴の水に試料をマウントし、顕微鏡下で検査し、種の特徴、球形の分生子とジグザグ状の分生子柄を探しています。 </li><li>植物バイオマスに治療の影響を評価するために、追加の実験的ブロックを使用します。まず、基地からの頂端分裂組織のトップには、高さを測定します。その後、慎重に根絶し、水道水で植物を洗うとその乾燥重量を決定するために、三日間45℃で、それらを乾燥させます。 </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+the+entomopathogen+Beauveria+bassiana+(Balsamo)+Vuillemin+in+different+tillage+regimes+and+in+Zea+mays+L.+and+virulence+towards+Ostrinia+nubilalis+(H&#252;bner).">Occurrence of the entomopathogen Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin in different tillage regimes and in Zea mays L. and virulence towards Ostrinia nubilalis (H&#252;bner).</a> Agriculture, ecosystems &amp; environment. 45, 147-156 (1993).</li><li>Akello, J., Sikora, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+acropedal+influence+of+endophyte+seed+treatment+on+Acyrthosiphon+pisum+and+Aphis+fabae+offspring+development+and+reproductive+fitness.">Systemic acropedal influence of endophyte seed treatment on Acyrthosiphon pisum and Aphis fabae offspring development and reproductive fitness.</a> Biological. 61, 215-221 (2012).</li><li>Reddy, N. 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著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

多くの要因がエンドファイトのような真菌昆虫病原物質を確立するための実験の特定の結果に影響を与えることができる。我々の結果は、接種方法は、そのうちの一つであることを示している。を使って実験する生物学的要因は、作物の種や品種を選択し、真菌種昆虫病原物質の歪みを含めたり、隔離するために使用。操作に考慮すべきその他の要因としては、接種物の濃度、接種時の植物の年齢、および植物の生育条件が含まれています。 それは、真菌昆虫病原物質14,17,18,21によって全身植物植民地化の結果に接種方法のために理想的であろう。代わりに、それは、接種方法は、ローカルの植民地化の特定のパターンを好む傾向があるように思われる。土壌水薬がルート植民17を好むのに対し、コーヒーでは、例えば、葉面スプレーは葉の植民地化を支持している。我々は、共通のBeanで同じパターンを発見した。最終的には、接種方法の選択は、あるべきおそらくターゲット草食動物や植物病原体のニッチをマッチング、工場内のエンドファイトの意図された場所に導かれ。 一般的に使用されていますが、メディア文化に基づいたエンドファイト検出および定量は、高価難しく、エラーが発生しやすくなります。たとえば、10800植物切片（1800ペトリ皿上にプレート）の合計は、Bを最適化するために、実験で評価したバナナ16でバッシアナ接種 。これらのうち、4496セクションは推定Bによって植民地化されたとして主にコロニー形態によって識別バッシアナ 、。明らかに、各コロニーのための樹種の微視的検証が望ましいのですが手が届かない段階だっただろう。一方、1176セクションは他の菌類によって植民地化され、破棄され、データ16を行方不明として扱われていました。確率はそのB.しかし、存在バッシアナが悪い選手や成長することが遅かったし、最終的にそれらのセクションから浮上している可能性がある場合十分な時間をllowed。したがって、メディア文化に基づいたエンドファイトの検出方法としては、偽陽性と偽陰性の対象となります。従って、例えば、より信頼性の高い検出および定量方法の開発は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイ20,21,24に基づくものは、十分に正当化される。 接種実験のための究極の目標は、草食性および/または疾患に対して耐久性のある全身の抵抗を提供する効率的な治療法を開発することであるべきです。もっともらしいが、まだテストされていない、仮説は、エンドファイトの植民地化の程度は、エンドファイト媒介抵抗の程度と正の相関であるということです。接種方法を精緻化した後自然な次のステップは、そのため、この相関関係を調べることである可能性があります。いくつかのビデオプロトコルは、研究者が標的害虫や病原体29から31に適した抵抗性検定を設計するのを助けることができます。最終的には、接種の成功を決定する何このアッセイであるる方法、および内部寄生生物的防除のために関連する潜在的な。

真菌entomopathogensはmycopesticides 1とかなりの可能性を秘めた昆虫集団の重要な調節因子である。ごく最近になって、しかし、真菌entomopathogensは両方の自然と様々な接種方法2に応答して、エンドファイトとして発生することが示されている。内部寄生菌類entomopathogensの生態学的機能の大部分は不明のままですが、いくつかの研究では、植物の成長3,4、草食性5-8、および病害抵抗9,10でそれらが示唆されている。ここで紹介する方法の全体的な目的は、内部寄生生物的防除のその後の評価の準備のために、エンドファイトとして菌類昆虫病原物質を導入することである。 ボーベリア （バルサモ）Vullemin（子嚢菌門：ボタンタケ）が最も研究内生菌の昆虫病原物質5-9,11-19であり、そしてそれは商業mycopesticideとして利用可能です。接種方法を確立するためにテスト<eメートル&gt; Bエンドファイトとしてボーベリア土壌の水薬14,17、種子コーティング18および浸漬14、幼根ドレッシング13,15、根および根茎はめ込み11,16,18、幹注射17、葉面スプレー14,17,20と花スプレー19を含む。これらのメソッドを使用して、研究者はBを導入していますバナナ11にバッシアナ 、豆7、カカオ13、コーヒー17、コーン7、綿7、ナツメヤシ12、ジュート21ケシ20、カボチャ7、ラジアータ松18、モロコシ14、トマト7、小麦7。最近の証拠は、その内生Bを示唆しているバッシアナだけではなく、節足動物害虫5-7,22-27から植物を保護するために可能性を秘めているだけでなく、いくつかの植物病原体9から。 インゲンマメ（ インゲンマメ ）害虫の影響を最も受けやすい作物間のランクと疾患。それは、その攻撃の領域28を越え、最も制限的な豆生産要素であると考えられている400以上の害虫や病原体200によって影響を受けることができます。したがって、共通のBeanがBで内部寄生生物的防除の完全なスペクトルを調べるために優れたモデル作物かもしれませんバッシアナ 。この方向での最初のステップとして、この記事では、インゲンマメにおけるエンドファイトとしてB.bassianaを導入するために接種方法として葉面スプレーや土壌の水薬を説明しています。

<table border="1">
<tbody>
	<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Mycotrol SE	</td>
 <td>Laverlam</td>
 <td>4167</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Noble agar</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A5431-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Penicillin G sodium salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3032-25MU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (100 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (60 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-13A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Potato dextrose agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>213400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Regular bleach (NaOCl)</td>
 <td>CLOROX</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Streptomycin sulfate salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S6501-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Tetracycline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T3258-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triple quince (NPK)</td>
 <td>ABOCOL</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>X-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Biological safety cabinet</td>
 <td>NuAire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Hemocytometer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-671-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Leica DM LB microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control

ボーベリアは endophytically植物にコロニーを形成する能力を持つ菌の昆虫病原物質である。エンドファイト、Bとバッシアナは草食や病気から植物を保護する役割を果たしている可能性がある。このプロトコルは、Bを確立する2つの接種方法を示しています内部寄生生物的防除のその後の評価の準備のために一般的な豆（ インゲンマメ ）でendophytically バッシアナ 。植物は、Bを受信する前に、2週間の表面殺菌した種子から栽培されている10 8分生子/ ml（または水）のボーベリア治療は 、葉面散布や土壌潅注のいずれかとして適用された。二週間後、植物を採取し、それらの葉、茎、根は内生菌類のコロニー形成を評価するためにサンプリングされます。このために、サンプルを個別に、滅菌した面である複数のセクションにカットし、20日間ポテトデキストロース寒天培地中でインキュベートした。メディアは次のように真菌の増殖を観察するために2〜3日ごとに検査されプラントセクションとレコード Bの発生とsociated バッシアナそのエンドファイトの植民地化の程度を推定する。接種の成功の分析は 、Bの発生を比較するトリートメントやコントロール間で与えられた植物の部分の中でバッシアナ （ すなわち 、葉、茎または根）。接種方法に加えて、実験の具体的な成果が目標作物種または品種に依存することがあり、真菌種は、昆虫病原物質株または使用切り分け、植物の生育条件。

B.バッシアナはPを endophytically -植民地化することができました実証接種トリートメント（ 図1）に対応して尋常性 。 B.によってエンドファイト植民地化につながっ葉面スプレーや土壌水薬両方処理された植物の80％以上でバッシアナ （ 図2）。しかし、植民地化の程度が評価さ植物部分および使用接種方法に依存していた。葉は、噴霧接種に最高の答え。ルーツは、他の一方で、水薬接種のみに対応した。最後に、両方の接種方法と同様に答えた茎。B.はバッシアナは制御プラントのどのセクションにも検出されなかった。 治療の独立したA、B以外のエンドファイトバッシアナが評価プラントセクションの15％から増加したが、彼 ​​らは隣接するセクションに侵入し、業績に影響を与える前に、彼らは、メディア·プレートから摘出された。 治療群と対照植物は2週間接種後に目に見えて区別がつかなかった。差異は、その乾燥重量にして、その高さで検出されなかった。 <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。 ボーベリアによって豆の植物の内生植民地化（。 インゲンマメ品種カリマ）の接種トリートメントの代表的な結果左上：制御なしに成長したプレート。右上：プレート全体を汚染プラントセクションから真菌エンドファイト。左下：Bバッシアナは、2つのプラントセクションから成長しています。右下：エンドファイトB.バッシアナ生子および分生子柄は、顕微鏡下で見られる。 <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="図2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> 図2。 BEAのエンドファイトの植民地に接種処理の効果ひずみGHAと接種後のボーベリア 、二週間で、n植物（ インゲンマメ品種カリマ）が。パーセント植民地化が培養されたセクションの数で割った植民地化プラントセクションの数を表します。

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Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

このプロトコルは、真菌昆虫病原物質を導入するには、2つの接種方法を示しています<em&gt;ボーベリア</em&gt;インゲンマメにおけるエンドファイトとして（<em&gt;インゲンマメ</em&gt;）、内部寄生生物的防除のその後の評価のための準備インチ

エンドファイトのような真菌Entomopathogensの確立：内生生物制御に向けて

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

34.4K ビュー.  International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia. このプロトコルは、真菌昆虫病原物質を導入するには、2つの接種方法を示していますボーベリアインゲンマメにおけるエンドファイトとして（インゲンマメ）、内部寄生生物的防除のその後の評価のための準備インチ

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

生物工学

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析法による生体組織のイメージング

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

その時 液体中の生物学的集合体のTEM

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

水質浄化のための膜のような防汚特性を持つハイドロゲルの合成

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

3D空間の細胞培養のための細胞骨格などの生体適合性液晶エラストマー発泡体の合成

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

骨再生のための生体材料の生物学的互換性プロファイル

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

反復可能なパターン形成のためのハイブリッド ゲル キューブ デバイスで初期の 3 D 細胞クラスター制御

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Experimental Methods to Study Human Postural Control

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied by appropriate mathematical methods are needed to understand the role of the different sub-systems involved in human postural control. This article describes a protocol for performing perturbed standing experiments, acquiring experimental data, and carrying out the subsequent mathematical analysis, with the aim of understanding the role of musculoskeletal system and central control in human upright posture. The results generated by these methods are important, because they provide insight into the healthy balance control, form the basis for understanding the etiology of impaired balance in patients and the elderly, and aid in the design of interventions to improve postural control and stability. These methods can be used to study the role of somatosensory system, intrinsic stiffness of ankle joint, and visual system in postural control, and may also be extended to investigate the role of vestibular system. The methods are to be used in the case of an ankle strategy, where the body moves primarily about the ankle joint and is considered a single-link inverted pendulum.

This article presents an experimental/analytic framework to study human postural control. The protocol provides step-by-step procedures for performing standing experiments, measuring body kinematics and kinetics signals, and analyzing the results to provide insight into the mechanisms underlying human postural control.

人間の姿勢制御を研究する実験的方法

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

近赤外線発光金ナノクラスターの生物応用のための合成

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

生体組織の刺激のための電界・磁場装置

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...