生産と実験的な作品は、本明細書でレイナルドパレハの献身的で熱心な助けを反映提示。科学技術革新のコロンビアの管理部門（Colciencias）により、グランドチャレンジレーションズ·イニシアチブを通じてビル＆メリンダ·ゲイツ財団からの助成金によって賄われて。

1。植物<ol><li> 0.5％次亜塩素酸ナトリウム、70％エタノールで2分で2分のためにそれらを浸漬することにより豆の種子（品カリマ）の表面殺菌。種子を滅菌蒸留水で3回リンスする。 </li><li>ジャガイモdextroxeス寒天（PDA）培地上で最後の​​すすぎ水100μlをメッキし、25℃で10日間プレートをインキュベートすることによって殺菌の成功℃を評価するどんな成長がプレート上に確認された場合の実験を終了し、再起動します。 </li><li> 2:1の比率で土と砂の混合物を含有する無菌のポットに3つのグループに種を植える。 25℃で成長チャンバ℃、CAに鉢を移す。 50％RH、12時間日長。一週間発芽後、2つ以上積極的な苗を排除します。水滅菌蒸留水で2〜3日毎とNPK 15-15-15の肥料6g / Lの水溶液で播種後10日と20日肥やす。 </li></ol> 2。菌<ol><li>商業を得るボーベリアひずみGHA（Mycotrol SE、Laverlam、カリ、コロンビア）の金融製剤。 </li><li>単一胞子在庫文化を生成するには、CAを中断します。 1は、Triton X-100、10秒間ボルテックスの0.1％水溶液1mlに分生子の完全なループを接種。その後、25℃で24時間プレートは2.5％ノーブル寒天とインキュベート上の懸濁液100μl℃、 PDAを含む100mmプレートに単発芽分生子を転送し、それがプレート全体（約3〜4週間）をカバーするまでに成長。 </li><li>無菌条件下で、培地の表面から真菌の増殖を削ると10 mlの滅菌0.1％トリトンX-100でそれを中断します。 1分間ボルテックスする。その後、菌糸を除去し、純正サスペンションを得るために無菌寒冷紗を通して懸濁液をろ過する。 </li><li>純正サスペンションの分生子濃度を推定するために血球計を使用してください。生子カウントを容易にするため、各時間は、100μlのoを譲渡、株式の10,000倍希釈を準備0.1％トリトンX-100、および次の希釈前に10秒間ボルテックス900μlの中のf分生子懸濁液。 </li><li>接種材料を生成するには、次式を用いて、10 8分生子/ mlの最終濃度に純正サスペンションを調整します。 <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="式（1）" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> 25℃で24時間、2.5パーセントノーブル寒天、インキュベートで10,000倍希釈液の分生子の生存率、プレートを100μlを評価するために℃のその後、パーセント発芽を推定するために100分生子の3つのランダムなグループを検査します。発芽分生子を考えると、そこから分生子プロジェクトの直径の半分以上見える発芽管より長い。平均パーセント発芽率が90％を超えた場合にのみサスペンションを使用しています。 </li></ol> 3。接種<ol><li>彼らは最初の真の葉期（播種後約14日間）に達したときに植物を植菌する。無菌蒸留による土壌容量に水プラントED水の接種前に24時間。 </li><li>葉面散布の方法については、それらが飽和状態に達するまでの葉の向軸（上側）表面に分生子懸濁液（治療）または0.1％トリトンX-100（コントロール）を適用するには、手動噴霧器を使用しています。土壌に分生子の流出を避けるためにアルミホイルで鍋の上部を覆う。噴霧した後、菌の侵入を容易に湿度の高いレベルを維持するために24時間、ビニール袋で植物をカバーしています。 </li><li>土壌灌注方法については、植物の根元の土壌の表面に分生子懸濁液10ml（治療）または0.1％トリトンX-100（コントロール）を適用するためにメスシリンダーを使用しています。 </li><li>接種後、乱塊法でそれらを整理して成長室に植物を返す。劣らず4より追加の実験ブロックは同じ実験で、内生の植民地化の評価に加えて、植物の成長の評価を可能にするためにインストールする必要があります。 </li></ol> 4。評価uations <ol><li>ランダムな順序でブロックを選択し、一度に実験1ブロックを評価します。これは1日で評価できない大実験のために特に重要です。 </li><li>植物を処理する前に、測定し基部から頂端分裂組織にその高さを記録します。その後、慎重に根絶し、水道水の流水でよく洗ってください。 </li><li>各工場から、サンプル2リーフレット、根の2個、茎の二枚。植物の最初の本葉からランダムリーフレットのサンプルを選択します。その後、工場の真ん中から、土壌表面付近から、2幹サンプル、3センチ長さがそれぞれを得る。最後に、ルートの途中からと根端の後ろに1cmから、また、3 cmの長さがそれぞれ、2主根のサンプルを入手してください。適当に3つの別々の紙袋やラベルにサンプルを置きます。 </li><li>ブロック内のすべての植物を洗浄、サンプリングした後、最終的に根、茎、次に葉を処理することによって開始します。 </li><li>表面はトンを消毒上記1.1のような無菌層流フードで問題。滅菌蒸留水に浸漬することにより、各サンプルを3回リンスし、滅菌タオルペーパーで乾燥させます。その後、エンドファイトが消毒との接触により排除されている可能性があり、その外側のエッジを、解剖して廃棄します。 </li><li>茎や根の葉と6mmの長い間、6x6のミリメートルを平均、6つのセクションにトリミングされたサンプルをカットします。プレート2 mg / Lのそれぞれにおける抗生物質テトラサイクリン、ストレプトマイシン、ペニシリン、PDAのメディアと60ミリメートルペトリ皿の上に6つのセクション。パラフィルムでプレートをシールし、25℃、暗所でインキュベート℃を各工場では、6つのプレート、2当たりの植物の一部が得られます。 </li><li>与えられた植物の部分の各ブロックを処理した後、すすぎ水を変更します。捨てる前に使用し、水洗、プレート℃は殺菌の成功を25℃で10日間インキュベートし、PDA、メディア上に100μlのサンプルを評価した。真菌の増殖が続いて起こる場合には、分析のための対応するサンプルを考慮していない。 </li><li>真菌の増殖を観察し、記録するために20日間、2〜3日毎プレートを点検してください。物品税と移転植物のセクションでは、新鮮なPDAを含むプレートに真菌エンドファイトの存在を示す。これは、元のプレート内の隣接するプラントセクションの汚染を避けることができます。 </li><li> レコード Bプラントセクションからバッシアナ成長 。 ボーベリアは、特徴的な白い菌糸が密なエッジで淡黄色にクリームになることによって識別することができます。疑問がある場合は、一滴の水に試料をマウントし、顕微鏡下で検査し、種の特徴、球形の分生子とジグザグ状の分生子柄を探しています。 </li><li>植物バイオマスに治療の影響を評価するために、追加の実験的ブロックを使用します。まず、基地からの頂端分裂組織のトップには、高さを測定します。その後、慎重に根絶し、水道水で植物を洗うとその乾燥重量を決定するために、三日間45℃で、それらを乾燥させます。 </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+the+entomopathogen+Beauveria+bassiana+(Balsamo)+Vuillemin+in+different+tillage+regimes+and+in+Zea+mays+L.+and+virulence+towards+Ostrinia+nubilalis+(H&#252;bner).">Occurrence of the entomopathogen Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin in different tillage regimes and in Zea mays L. and virulence towards Ostrinia nubilalis (H&#252;bner).</a> Agriculture, ecosystems &amp; environment. 45, 147-156 (1993).</li><li>Akello, J., Sikora, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+acropedal+influence+of+endophyte+seed+treatment+on+Acyrthosiphon+pisum+and+Aphis+fabae+offspring+development+and+reproductive+fitness.">Systemic acropedal influence of endophyte seed treatment on Acyrthosiphon pisum and Aphis fabae offspring development and reproductive fitness.</a> Biological. 61, 215-221 (2012).</li><li>Reddy, N. 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著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

多くの要因がエンドファイトのような真菌昆虫病原物質を確立するための実験の特定の結果に影響を与えることができる。我々の結果は、接種方法は、そのうちの一つであることを示している。を使って実験する生物学的要因は、作物の種や品種を選択し、真菌種昆虫病原物質の歪みを含めたり、隔離するために使用。操作に考慮すべきその他の要因としては、接種物の濃度、接種時の植物の年齢、および植物の生育条件が含まれています。 それは、真菌昆虫病原物質14,17,18,21によって全身植物植民地化の結果に接種方法のために理想的であろう。代わりに、それは、接種方法は、ローカルの植民地化の特定のパターンを好む傾向があるように思われる。土壌水薬がルート植民17を好むのに対し、コーヒーでは、例えば、葉面スプレーは葉の植民地化を支持している。我々は、共通のBeanで同じパターンを発見した。最終的には、接種方法の選択は、あるべきおそらくターゲット草食動物や植物病原体のニッチをマッチング、工場内のエンドファイトの意図された場所に導かれ。 一般的に使用されていますが、メディア文化に基づいたエンドファイト検出および定量は、高価難しく、エラーが発生しやすくなります。たとえば、10800植物切片（1800ペトリ皿上にプレート）の合計は、Bを最適化するために、実験で評価したバナナ16でバッシアナ接種 。これらのうち、4496セクションは推定Bによって植民地化されたとして主にコロニー形態によって識別バッシアナ 、。明らかに、各コロニーのための樹種の微視的検証が望ましいのですが手が届かない段階だっただろう。一方、1176セクションは他の菌類によって植民地化され、破棄され、データ16を行方不明として扱われていました。確率はそのB.しかし、存在バッシアナが悪い選手や成長することが遅かったし、最終的にそれらのセクションから浮上している可能性がある場合十分な時間をllowed。したがって、メディア文化に基づいたエンドファイトの検出方法としては、偽陽性と偽陰性の対象となります。従って、例えば、より信頼性の高い検出および定量方法の開発は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイ20,21,24に基づくものは、十分に正当化される。 接種実験のための究極の目標は、草食性および/または疾患に対して耐久性のある全身の抵抗を提供する効率的な治療法を開発することであるべきです。もっともらしいが、まだテストされていない、仮説は、エンドファイトの植民地化の程度は、エンドファイト媒介抵抗の程度と正の相関であるということです。接種方法を精緻化した後自然な次のステップは、そのため、この相関関係を調べることである可能性があります。いくつかのビデオプロトコルは、研究者が標的害虫や病原体29から31に適した抵抗性検定を設計するのを助けることができます。最終的には、接種の成功を決定する何このアッセイであるる方法、および内部寄生生物的防除のために関連する潜在的な。

真菌entomopathogensはmycopesticides 1とかなりの可能性を秘めた昆虫集団の重要な調節因子である。ごく最近になって、しかし、真菌entomopathogensは両方の自然と様々な接種方法2に応答して、エンドファイトとして発生することが示されている。内部寄生菌類entomopathogensの生態学的機能の大部分は不明のままですが、いくつかの研究では、植物の成長3,4、草食性5-8、および病害抵抗9,10でそれらが示唆されている。ここで紹介する方法の全体的な目的は、内部寄生生物的防除のその後の評価の準備のために、エンドファイトとして菌類昆虫病原物質を導入することである。 ボーベリア （バルサモ）Vullemin（子嚢菌門：ボタンタケ）が最も研究内生菌の昆虫病原物質5-9,11-19であり、そしてそれは商業mycopesticideとして利用可能です。接種方法を確立するためにテスト<eメートル&gt; Bエンドファイトとしてボーベリア土壌の水薬14,17、種子コーティング18および浸漬14、幼根ドレッシング13,15、根および根茎はめ込み11,16,18、幹注射17、葉面スプレー14,17,20と花スプレー19を含む。これらのメソッドを使用して、研究者はBを導入していますバナナ11にバッシアナ 、豆7、カカオ13、コーヒー17、コーン7、綿7、ナツメヤシ12、ジュート21ケシ20、カボチャ7、ラジアータ松18、モロコシ14、トマト7、小麦7。最近の証拠は、その内生Bを示唆しているバッシアナだけではなく、節足動物害虫5-7,22-27から植物を保護するために可能性を秘めているだけでなく、いくつかの植物病原体9から。 インゲンマメ（ インゲンマメ ）害虫の影響を最も受けやすい作物間のランクと疾患。それは、その攻撃の領域28を越え、最も制限的な豆生産要素であると考えられている400以上の害虫や病原体200によって影響を受けることができます。したがって、共通のBeanがBで内部寄生生物的防除の完全なスペクトルを調べるために優れたモデル作物かもしれませんバッシアナ 。この方向での最初のステップとして、この記事では、インゲンマメにおけるエンドファイトとしてB.bassianaを導入するために接種方法として葉面スプレーや土壌の水薬を説明しています。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Name of Reagent/Material</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td></td></tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Noble agar</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (100 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Potato dextrose agar</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Regular bleach (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate salt</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triple quince (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Biological safety cabinet</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM LB microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control

ボーベリアは endophytically植物にコロニーを形成する能力を持つ菌の昆虫病原物質である。エンドファイト、Bとバッシアナは草食や病気から植物を保護する役割を果たしている可能性がある。このプロトコルは、Bを確立する2つの接種方法を示しています内部寄生生物的防除のその後の評価の準備のために一般的な豆（ インゲンマメ ）でendophytically バッシアナ 。植物は、Bを受信する前に、2週間の表面殺菌した種子から栽培されている10 8分生子/ ml（または水）のボーベリア治療は 、葉面散布や土壌潅注のいずれかとして適用された。二週間後、植物を採取し、それらの葉、茎、根は内生菌類のコロニー形成を評価するためにサンプリングされます。このために、サンプルを個別に、滅菌した面である複数のセクションにカットし、20日間ポテトデキストロース寒天培地中でインキュベートした。メディアは次のように真菌の増殖を観察するために2〜3日ごとに検査されプラントセクションとレコード Bの発生とsociated バッシアナそのエンドファイトの植民地化の程度を推定する。接種の成功の分析は 、Bの発生を比較するトリートメントやコントロール間で与えられた植物の部分の中でバッシアナ （ すなわち 、葉、茎または根）。接種方法に加えて、実験の具体的な成果が目標作物種または品種に依存することがあり、真菌種は、昆虫病原物質株または使用切り分け、植物の生育条件。

B.バッシアナはPを endophytically -植民地化することができました実証接種トリートメント（ 図1）に対応して尋常性 。 B.によってエンドファイト植民地化につながっ葉面スプレーや土壌水薬両方処理された植物の80％以上でバッシアナ （ 図2）。しかし、植民地化の程度が評価さ植物部分および使用接種方法に依存していた。葉は、噴霧接種に最高の答え。ルーツは、他の一方で、水薬接種のみに対応した。最後に、両方の接種方法と同様に答えた茎。B.はバッシアナは制御プラントのどのセクションにも検出されなかった。 治療の独立したA、B以外のエンドファイトバッシアナが評価プラントセクションの15％から増加したが、彼 ​​らは隣接するセクションに侵入し、業績に影響を与える前に、彼らは、メディア·プレートから摘出された。 治療群と対照植物は2週間接種後に目に見えて区別がつかなかった。差異は、その乾燥重量にして、その高さで検出されなかった。 <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。 ボーベリアによって豆の植物の内生植民地化（。 インゲンマメ品種カリマ）の接種トリートメントの代表的な結果左上：制御なしに成長したプレート。右上：プレート全体を汚染プラントセクションから真菌エンドファイト。左下：Bバッシアナは、2つのプラントセクションから成長しています。右下：エンドファイトB.バッシアナ生子および分生子柄は、顕微鏡下で見られる。 <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="図2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> 図2。 BEAのエンドファイトの植民地に接種処理の効果ひずみGHAと接種後のボーベリア 、二週間で、n植物（ インゲンマメ品種カリマ）が。パーセント植民地化が培養されたセクションの数で割った植民地化プラントセクションの数を表します。

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Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

このプロトコルは、真菌昆虫病原物質を導入するには、2つの接種方法を示しています<em&gt;ボーベリア</em&gt;インゲンマメにおけるエンドファイトとして（<em&gt;インゲンマメ</em&gt;）、内部寄生生物的防除のその後の評価のための準備インチ

エンドファイトのような真菌Entomopathogensの確立：内生生物制御に向けて

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

establishing-fungal-entomopathogens-as-endophytes-towards-endophytic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

34.5K ビュー.  International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia. このプロトコルは、真菌昆虫病原物質を導入するには、2つの接種方法を示していますボーベリアインゲンマメにおけるエンドファイトとして（インゲンマメ）、内部寄生生物的防除のその後の評価のための準備インチ

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

生物工学

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and screening for the selection of a fast-acting, highly virulent entomopathogenic fungus are important steps. Entomopathogenic fungi, such as Metarhizium, Beauveria, and Nomurea, which act by contact, are better suited than Bacillus thuringiensis or nucleopolyhedrosis virus (NPV), which must be ingested by the insect pest. In the present work, we isolated 68 Metarhizium strains from infected insects using a soil dilution and bait method. The isolates were identified by the amplification and sequencing of the ITS1-5.8S-ITS2 and 26S rDNA region. The most virulent strain of Metarhizium anisopliae was selected based on the median lethal concentration (LC50) and time (LT50) obtained in insect bioassays against III-instar larvae of Helicoverpa armigera. The mass production of spores by the selected strain was carried out with solid-state fermentation (SSF) using rice as a substrate for 14 days. Spores were extracted from the sporulated biomass using 0.1% tween-80, and different formulations of the spores were prepared. Field trials of the formulations for the control of an H. armigera infestation in pigeon peas were carried out by randomized block design. The infestation control levels obtained with oil and aqueous formulations (78.0% and 70.9%, respectively) were better than the 63.4% obtained with chemical pesticide.

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Here, we report the different stages involved in the knowledge-based development of an effective mycoinsecticide, including the isolation, identification, screening, and selection of the "best-fit" entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae, for the control of insect pests in agriculture.

開発<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Mycoinsecticideとして：分離から畑作まで

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

環境学

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

免疫・感染学

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

土壌サンプルからの病原性真菌の単離と選択と昆虫害虫に対する真菌性毒性の評価

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

生物学

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. The increase in pest resistance to chemical insecticides, the growing concerns regarding the negative effects of insecticides on human health, and the environmental pollution from pesticides have led to a global drive to find novel sustainable strategies for crop protection and pest control. Previously, attempts to mass culture such entomopathogenic fungi (EPF) species as Beauveria bassiana have been conducted. However, only limited attempts have been conducted to mass culture Metarhizium robertsii and M. pinghaense for use against insect pests. This study aimed to mass-produce a sufficient number of resilient infective propagules of South African isolates of M. robertsii and M. pinghaense for commercial application. Three agricultural grain products, flaked oats, flaked barley, and rice, were used as the EPF solid fermentation substrates. Two inoculation methods, conidial suspensions and the liquid fungal culture of blastospores were used to inoculate the solid substrates. Inoculation using conidial suspensions was observed to be relatively less effective, as increased levels of contamination were observed on the solid substrates relative to when using the blastospore inoculation method. Flaked oats were found not to be a suitable growth substrate for both M. robertsii and M. pinghaense, as no dry conidia were harvested from the substrate. Flaked barley was found to favor the production of M. robertsii conidia over that of M. pinghaense, and an average of 1.83 g &plusmn; 1.47 g of dry M. robertsii conidia and zero grams of M. pinghaense conidia was harvested from the substrate. Rice grains were found to favor the conidial mass production of both M. pinghaense and M. robertsii isolates, with an average of 8.2 g &plusmn; 4.38 g and 6 g &plusmn; 2 g harvested from the substrate, respectively.

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Entomopathogenic fungi have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. In this study, the mass production of a sufficient number of resilient infective propagules of South African isolates of both Metarhizium robertsii and M. pinghaense for commercial application against insect pests was successfully conducted using agricultural grain products.

昆虫病原性真菌、メタリシウム・ロベルツィイおよびメタリシウム・ピンヘーンセの大量生産、害虫に対する商業利用

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. The soil is a rich habitat for microorganisms, including EPF particularly belonging to the genera Metarhizium and Beauveria, which can regulate arthropod pests. Biological products based on fungi are available in the market mainly for agricultural arthropod pest control. Nevertheless, despite the high endemic biodiversity, only a few strains are used in commercial bioproducts worldwide. In the present study, 524 soil samples were cultured on potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium). The growth of fungal colonies was observed for 3 weeks. All Metarhizium and Beauveria EPF were morphologically identified at the genus level. Additionally, some isolates were molecularly identified at the species level. Twenty-four out of these 524 soil samples were also surveyed for EPF occurrence using the insect bait method (Galleria mellonella and Tenebrio molitor). A total of 51 EPF strains were isolated (41 Metarhizium spp. and 10 Beauveria spp.) from the 524 soil samples. All fungal strains were isolated either from croplands or grasslands. Of the 24 samples selected for comparison, 91.7% were positive for EPF using Galleria bait, 62.5% using Tenebrio bait, and 41.7% using CTC. Our results suggested that using insect baits to isolate the EPF from the soil is more efficient than using the CTC medium. The comparison of isolation methods in addition to the identification and conservation of EPF has a positive impact on the knowledge about biodiversity. The improvement of EPF collection supports scientific development and technological innovation.

Entomopathogenic fungal colonies are isolated from tropical soil samples using Tenebrio bait, Galleria bait, as well as selective artificial medium, i.e., potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium).

土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as any other vital resource, the fungi with which these plants intimately associate are essential for them. Hence, some of the most relevant techniques in studying mycoheterotrophic species are the ones that enable the investigation of associated fungi, especially those inhabiting roots and subterranean organs. In this context, techniques for identifying culture-dependent and culture-independent endophytic fungi are commonly applied. Isolating fungal endophytes provides a means for morphologically identifying them, analyzing their diversity, and maintaining inocula for applications in the symbiotic germination of orchid seeds. However, it is known that there is a large variety of non-culturable fungi inhabiting plant tissues. Thus, culture-independent molecular identification techniques offer a broader cover of species diversity and abundance. This article aims to provide the methodological support necessary for starting two investigation procedures: a culture-dependent and an independent one. Regarding the culture-dependent protocol, the processes of collecting and maintaining plant samples from collection sites to laboratory facilities are detailed, along with isolating filamentous fungi from subterranean and aerial organs of mycoheterotrophic plants, keeping a collection of isolates, morphologically characterizing hyphae by slide culture methodology, and molecular identification of fungi by total DNA extraction. Encompassing culture-independent methodologies, the detailed procedures include collecting plant samples for metagenomic analyses and total DNA extraction from achlorophyllous plant organs using a commercial kit. Finally, continuity protocols (e.g., polymerase chain reaction [PCR], sequencing) are also suggested for analyses, and techniques are presented here.

The current article aims to provide detailed and adequate protocols for the isolation of plant-associated endophytic fungi, long-term preservation of isolates, morphological characterization, and total DNA extraction for subsequent molecular identification and metagenomic analyses.

菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

マスタードアブラムシに対する昆虫病原性真菌の最適化されたバイオアッセイ

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, entomopathogenic fungi (EPF) are potential microbial control agents for controlling this pest. Therefore, virulence screening of EPF isolates under Petri dish conditions is necessary before field application. However, the mustard aphid is a parthenogenetic insect, making it difficult to record data during Petri dish experiments. A modified system for detached-leaf bioassays was developed to address this issue, using a micro-sprayer to inoculate conidia onto aphids and prevent drowning by facilitating air-drying after spore suspension. The system maintained high relative humidity throughout the observation period, and the leaf disc remained fresh for over ten days, allowing parthenogenetic reproduction of the aphids. To prevent offspring buildup, a process of daily removal using a painting brush was implemented. This protocol demonstrates a stable system for evaluating the virulence of EPF isolates against mustard aphids or other aphids, enabling the selection of potential isolates for aphid control.

著者スポットライト:マスタードアブラムシに対する昆虫病原性真菌を使用した環境に優しい害虫管理 

This protocol presents an optimized detached-leaf bioassay system for evaluating the effectiveness of entomopathogenic fungi (EPF) against the mustard aphid (Lipaphis erysimi (Kalt.)), a parthenogenetic insect. The method outlines the data collection process during Petri dish experiments, enabling researchers to consistently measure the virulence of EPF against mustard aphids and other parthenogenetic insects.

単為生殖昆虫、カラショウアブラムシ、 Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, ...

エンドファイトのような真菌Entomopathogensの確立：内生生物制御に向けて

要約

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拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

開発

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

土壌サンプルからの病原性真菌の単離と選択と昆虫害虫に対する真菌性毒性の評価

昆虫病原性真菌、メタリシウム・ロベルツィイおよびメタリシウム・ピンヘーンセの大量生産、害虫に対する商業利用

土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較

菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出

単為生殖昆虫、カラショウアブラムシ、 Lipaphis erysimi (Kalt.)

単為生殖昆虫、カラショウアブラムシ、 Lipaphis erysimi (Kalt.)