La produzione e il lavoro sperimentale qui presentato riflette l&#39;aiuto devoto ed entusiasta di Reynaldo Pareja. Finanziato dal Dipartimento amministrativo della Colombia della Scienza, tecnologia e innovazione (Colciencias) e da una borsa di studio dalla Fondazione Bill &amp; Melinda Gates Foundation attraverso il Grand Challenges Explorations iniziativa.

1. Piante <ol><li> Surface-sterilizzare semi di fagiolo (cv. Calima) immergendole per due minuti in ipoclorito di sodio allo 0,5% e due minuti in etanolo al 70%. Sciacquare i semi tre volte in acqua distillata sterile. </li><li> Valutare il successo della vostra sterilizzazione con placcatura 100 pl di l&#39;ultima acqua di risciacquo per patate dextroxe agar (PDA) media, e incubando la piastra per 10 giorni a 25 ° C. Terminare e riavviare l&#39;esperimento se la crescita è visto sul piatto. </li><li> Piantare i semi in gruppi di tre in vasi contenenti una miscela sterile di terra e sabbia con un rapporto 2:1. Trasferire i vasi ad una camera di crescita a 25 ° C, ca. 50% UR e 12 ore fotoperiodo. Una settimana dopo la germinazione, eliminare le due piantine meno vigorose. Acqua, ogni 2-3 giorni con acqua distillata sterile e fertilizzare 10 e 20 giorni dopo la semina con un g / L 6 soluzione acquosa di concime NPK 15-15-15. </li></ol> 2. Fungo <ol><li> Ottenere un commerformulazione finanziaria di Beauveria bassiana ceppo GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombia). </li><li> Per generare una singola spora coltura madre, sospendere ca. uno inoculo anello pieno di conidi in 1 ml di una soluzione acquosa al 0,1% di Triton X-100 e vortex per 10 sec. Poi, piastra 100 microlitri della sospensione sul 2,5% agar Noble e incubare per 24 ore a 25 ° C. Trasferire un singolo conidio germinando in un PDA 100 millimetri piatto contenente e crescere fino a coprire l&#39;intera piastra (circa 3-4 settimane). </li><li> In condizioni di sterilità, raschiare la crescita fungina dalla superficie del terreno e sospendere in 10 ml sterile 0,1% Triton X-100. Vortex per un minuto. Poi, filtrare la sospensione attraverso una garza sterile per rimuovere ife e ottenere la sospensione stock. </li><li> Utilizzare un emocitometro di valutare la concentrazione conidi della sospensione stock. Per facilitare i conteggi conidi, preparare un 10.000 volte diluizione seriale del magazzino, ogni volta che il trasferimento di 100 pl of sospensione di conidi in 900 pl di 0,1% Triton X-100, e di vortex per 10 secondi prima della successiva diluizione. </li><li> Per generare l&#39;inoculo, regolare la sospensione magazzino ad una concentrazione finale di 10 8 conidi / ml, usando la formula: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="equazione 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Per valutare la redditività conidi, piastra 100 microlitri della 10.000 volte diluizione sul 2,5% agar Nobile e incubare per 24 ore a 25 ° C. Quindi, controllare tre gruppi casuali di 100 conidi per stimare la germinazione per cento. Considerare un conidio germinato quando un tubo germe visibile più di metà del diametro dei progetti conidio da esso. Utilizzare solo la sospensione quando la germinazione percentuale media superiore al 90%. </li></ol> 3. Inoculazione <ol><li> Seminare piante quando raggiungono la loro prima fase foglie vere (circa 14 giorni dopo la semina). Le piante acquatiche alla capacità del suolo con sterile distillareed acqua 24 ore prima di vaccinazioni. </li><li> Per il metodo spray fogliare, utilizzare un atomizzatore manuale per applicare la sospensione di conidi (trattamento) o 0,1% Triton X-100 (controllo) al adaxial (superiore) superficie delle foglie fino a raggiungere la saturazione. Coprire la parte superiore del vaso con un foglio di alluminio per evitare il deflusso conidi al suolo. Dopo la spruzzatura, coprire le piante con un sacchetto di plastica per 24 ore per mantenere un elevato livello di umidità facilitare invasione fungina. </li><li> Per il metodo del suolo drench, utilizzare un cilindro graduato da applicare 10 ml di sospensione di conidi (trattamento) o 0,1% Triton X-100 (controllo) alla superficie del terreno alla base della pianta. </li><li> Dopo vaccinazioni, tornare impianti alle camere di crescita organizzare in un disegno randomizzato blocco completo. Non meno di quattro blocchi aggiuntivi sperimentali deve essere installato per consentire valutazioni di crescita delle piante, oltre a valutazioni di colonizzazione endofitica, nello stesso esperimento. </li></ol> 4. Evalgenza <ol><li> Valutare l&#39;esperimento un blocco alla volta, selezionando i blocchi in ordine casuale. Ciò è particolarmente importante per gli esperimenti di grandi dimensioni che non possono essere valutati in un solo giorno. </li><li> Prima di elaborare una pianta, misurare e registrare la sua altezza dalla base al meristema apicale. Poi, sradicare con attenzione e lavare accuratamente in acqua corrente. </li><li> Da ogni campione vegetale, due foglioline, due pezzi di radice e due pezzi di stelo. Selezionare casualmente campioni foglietto dalla prima foglia vera della pianta. Quindi, ottenere due campioni staminali, 3 cm di lunghezza ciascuno, dal centro della pianta e dalla prossimità della superficie del terreno. Infine, ottenere due campioni Taproot, anche 3 cm di lunghezza ciascuno, a partire dalla metà della radice e da 1 cm dietro la punta della radice. Porre i campioni in tre sacchetti di carta separati e di etichette in modo appropriato. </li><li> Dopo il lavaggio e campionamento tutte le piante in un blocco, iniziare lavorazione delle foglie, poi le radici, e, infine, i gambi. </li><li> Surface sterilizzare tproblemi in una cappa a flusso laminare sterile come in 1.1, di cui sopra. Lavare ogni campione tre volte per immersione in acqua distillata sterile e lasciare asciugare in un tovagliolo di carta sterile. Poi, sezionare e scartare i suoi bordi esterni, dove endofiti potrebbe essere stato eliminato a causa del contatto con disinfettanti. </li><li> Tagliare il campione tagliato in sei sezioni, con una media 6x6 millimetri per le foglie e 6 mm di lunghezza per steli e radici. Tavola delle sei sezioni su un piatto 60 millimetri Petri con i media PDA integrato con la tetraciclina antibiotici, streptomicina e penicillina a 2 mg / L ciascuno. Sigillare la piastra con parafilm e incubare al buio a 25 ° C. Ogni pianta produce sei piatti, due parti per impianti. </li><li> Cambiare l&#39;acqua di risciacquo dopo l&#39;elaborazione di ogni blocco di una parte dato impianto. Prima di eliminare l&#39;usato acqua di risciacquo, piatto un campione di 100 microlitri su supporti PDA e incubare per 10 giorni a 25 ° C per valutare il successo di sterilizzazione. Se la crescita fungina ne consegue, non considerano i campioni corrispondenti per le analisi. </li><li> Ispezionare le piastre ogni 2-3 giorni per 20 giorni per osservare e registrare la crescita di funghi. Sezioni d&#39;impianto accise e il trasferimento espone presenza di endofiti fungini alle piastre contenenti PDA fresco. Ciò consente di evitare la contaminazione delle sezioni d&#39;impianto connessi applicabili alla piastra originale. </li><li> Record B. crescita bassiana da sezioni dell&#39;impianto. Beauveria bassiana può essere identificato dal caratteristico miceli bianco denso diventando crema a giallo pallido al bordo. In caso di dubbio, montare il campione in una goccia d&#39;acqua e controllare al microscopio, alla ricerca di conidi globosi e zig-zag a forma di conidiofori, caratteristica della specie. </li><li> Utilizzare ulteriori blocchi sperimentali per valutare l&#39;impatto dei trattamenti sulla biomassa vegetale. Primo, misurare l&#39;altezza dalla base alla sommità del meristema apicale. Poi, con attenzione sradicare le piante e lavare in acqua corrente e lasciarli asciugare a 45 ° C per tre giorni per determinare il loro peso secco. </li></ol>

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(15), e683 (2008).</li><li>Parsa, S., Sotelo, G., Cardona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+herbivore+resistance+mechanisms:+spittlebugs+on+Brachiaria+spp.+as+an+example.">Characterizing herbivore resistance mechanisms: spittlebugs on Brachiaria spp. as an example.</a> J. Vis. Exp. (52), e3047 (2011).</li><li>Atamian, H., Roberts, P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+throughput+screens+with+root-knot+nematodes+Meloidogyne+spp.">High and low throughput screens with root-knot nematodes Meloidogyne spp.</a> J. Vis. Exp. (61), e3629 (2012).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Molti fattori possono influenzare il risultato di un esperimento specifico per stabilire una entomopathogen fungina come endophyte. I nostri risultati dimostrano il metodo di inoculazione è uno di loro. Fattori biologici di sperimentare sono il raccolto specie o cultivar selezionata e il ceppo fungina entomopathogen specie o isolare utilizzati. Altri fattori da considerare includono manipolare la concentrazione dell&#39;inoculo, l&#39;età della pianta durante inoculazioni, e condizioni di crescita della pianta. Sarebbe ideale per un metodo di inoculazione di provocare colonizzazione vegetale sistemica da un fungo 14,17,18,21 entomopathogen. Invece, sembra che i metodi di inoculazione tendono a favorire un modello specifico di colonizzazione locale. Nel caffè, per esempio, spray fogliari favorire la colonizzazione foglia mentre inzuppa suolo favorire colonizzazione delle radici 17. Abbiamo trovato lo stesso modello nel fagiolo comune. In definitiva, la scelta del metodo di inoculazione dovrebbe essereguidati dalla posizione prevista del endofiti all&#39;interno di un impianto, presumibilmente corrispondente alla nicchia del erbivoro di destinazione o patogeno per le piante. Anche se comunemente usato, il rilevamento e la quantificazione endofiti basata sulle culture dei media può essere costoso, difficile e soggetto a errori. Ad esempio, un totale di 10.800 sezioni di impianto (piastrate su piastre Petri 1800) sono stati valutati in un esperimento per ottimizzare B. vaccinazioni bassiana su Banana 16. Di questi, 4.496 sezioni sono state colonizzate da un putativo B. bassiana, come individuate principalmente dalla morfologia delle colonie. Chiaramente, una verifica microscopica delle specie per ogni colonia sarebbe stato un passo auspicabile, ma inaccessibile. D&#39;altra parte, 1.176 sezioni sono state colonizzate da funghi e altri sono stati scartati e trattati come dati mancanti 16. La probabilità esiste, tuttavia, che B. bassiana era un concorrente povero o più lento a crescere, e avrebbe potuto eventualmente emerse da queste parti se unllowed tempo sufficiente. Di conseguenza, i metodi di rilevamento endofiti basati sulle culture dei media sono soggetti a falsi positivi e falsi negativi. Di conseguenza, lo sviluppo di un rilevamento più affidabile e quantificazione metodi, ad esempio quelle basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) saggi 20,21,24, è ben giustificata. L&#39;obiettivo finale per esperimenti di inoculazione dovrebbe essere quello di sviluppare un trattamento efficace che fornisce duratura resistenza sistemica contro erbivori e / o malattia. Una plausibile, ma ancora non testato, l&#39;ipotesi è che l&#39;entità della colonizzazione endofitica dovrebbe correlata positivamente con il grado di endofiti resistenza mediata. Un naturale passo successivo dopo la rifinitura metodi di inoculazione, quindi, potrebbe essere quello di esaminare la correlazione. Diversi protocolli video può aiutare i ricercatori a progettare un dosaggio adeguato di resistenza per un parassita o patogeno bersaglio 29-31. In definitiva, questo saggio è quello che determina il successo della inoculizione metodo, e il potenziale associato per endofitica controllo biologico.

Entomopatogeni fungine sono importanti regolatori di popolazioni di insetti con un notevole potenziale come mycopesticides 1. Solo recentemente, tuttavia, hanno entomopatogeni fungine stato verificato come endofiti, naturalmente o in risposta a vari metodi di inoculazione 2. La funzione ecologica di endofiti fungini entomopatogeni rimane in gran parte sconosciuta, ma alcuni studi li hanno implicato nella crescita delle piante 3,4, resistenza erbivoro 5-8, e la resistenza alle malattie 9,10. L&#39;obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di introdurre un entomopathogen fungina come endophyte, in preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) è il più studiato entomopathogen endofitica fungine 5-9,11-19, ed è disponibile come mycopesticide commerciale. Metodi di inoculazione testato per stabilire <em&gt; B. bassiana come endofiti includono inzuppa suolo 14,17, rivestimenti di semi 18 e immersioni 14, condimenti radichetta 13,15, radici e rizoma immersioni 11,16,18, iniezioni stelo 17, spray fogliari 14,17,20 e spruzzi di fiori 19. Usando questi metodi, i ricercatori hanno introdotto B. bassiana in banane 11, fagiolo 7, cacao 13, caffè 17, mais 7, cotone 7, della palma da datteri 12, iuta 21, papavero da oppio 20, zucca 7, radiata pino 18, sorgo 14, pomodoro 7 e grano 7. Recenti evidenze suggeriscono che endofitica B. bassiana ha il potenziale per proteggere le piante non solo dai parassiti artropodi 5-7,22-27, ma anche da alcuni agenti patogeni delle piante 9. Il fagiolo comune (Phaseolus vulgaris), si classifica tra le colture più vulnerabili ai parassitie malattie. Esso può essere influenzata da più di 400 e 200 parassiti patogeni, la cui attacco è pensato per essere il più fattore limitante produzione di fagioli tra le regioni 28. Di conseguenza, il fagiolo comune può essere una coltura eccellente modello per esaminare l&#39;intero spettro di endofitica controllo biologico di B. bassiana. Come primo passo in questa direzione, in questo articolo viene descritto spray fogliari e inzuppa suolo come metodi di inoculazione di introdurre B.bassiana come endophyte nel fagiolo comune.

<table border="1">
<tbody>
	<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Mycotrol SE	</td>
 <td>Laverlam</td>
 <td>4167</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Noble agar</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A5431-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Penicillin G sodium salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3032-25MU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (100 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (60 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-13A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Potato dextrose agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>213400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Regular bleach (NaOCl)</td>
 <td>CLOROX</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Streptomycin sulfate salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S6501-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Tetracycline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T3258-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triple quince (NPK)</td>
 <td>ABOCOL</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>X-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Biological safety cabinet</td>
 <td>NuAire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Hemocytometer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-671-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Leica DM LB microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control

Beauveria bassiana è un entomopathogen fungina con la capacità di colonizzare piante endophytically. Come endophyte, B. bassiana può giocare un ruolo nel proteggere le piante da herbivory e malattia. Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per stabilire B. bassiana endophytically nel fagiolo comune (Phaseolus vulgaris), in preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico. Le piante sono cresciute da semi sterilizzati in superficie per due settimane prima di ricevere una B. trattamento bassiana di 10 8 conidi / ml (o acqua) applicati sia come spray fogliare o inzuppare suolo. Due settimane più tardi, le piante vengono raccolte e le loro foglie, steli e radici vengono campionati a valutare endofitica colonizzazione fungina. Per questo, i campioni sono individualmente superficie sterilizzati, tagliato in più sezioni, e incubate in media patata destrosio agar per 20 giorni. Il supporto viene controllato ogni 2-3 giorni per osservare la crescita di funghi comesociated con sezioni dell&#39;impianto e registrare il verificarsi di B. bassiana per stimare l&#39;estensione della sua colonizzazione endofitica. Analisi di successo inoculazione confronta il verificarsi di B. bassiana all&#39;interno di una parte dato impianto (cioè le foglie, steli o radici) attraverso trattamenti e controlli. In aggiunta al metodo di inoculazione, l&#39;esito specifico dell&#39;esperimento può dipendere coltura di destinazione o varietà, le specie fungine entomopathogen ceppo o isolare utilizzati, e condizioni di crescita della pianta.

B. bassiana è stato in grado di colonizzare endophytically-P. vulgaris in risposta ai trattamenti inoculazione dimostrato (Figura 1). Sia spray fogliari e inzuppa del suolo ha determinato la colonizzazione endofitica da B. bassiana in oltre l&#39;80% delle piante trattate (Figura 2). Tuttavia, il grado di colonizzazione dipendeva da parte dell&#39;impianto valutata e il metodo di inoculazione utilizzato. Foglie risposto meglio per vaccinazioni a spruzzo. Roots, invece, risposto solo a inoculazioni bagnarsi. Infine, steli risposto analogamente a entrambi i metodi di inoculazione. B. bassiana non è stata rilevata in nessuna delle sezioni dell&#39;impianto di controllo. Indipendentemente dalle endofiti, di trattamento di B. bassiana è cresciuto dal 15% delle sezioni d&#39;impianto valutate, ma sono stati sezionati fuori dalle piastre di supporto prima che potessero invadere sezioni confinanti e influenzare i risultati. Gli impianti di trattamento e di controllo sono visibilmente distinguibili due settimane dopo vaccinazioni. Nessuna differenza è stata rilevata nel loro peso secco e la loro altezza. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. I risultati rappresentativi dei trattamenti inoculazione sulla colonizzazione endofitica di piante di fagiolo (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Da Beauveria bassiana alto a sinistra:. Controllo lamiere senza crescita. In alto a destra: funghi endofiti da una sezione di impianto di contaminare l&#39;intera piastra. In basso a sinistra: B. bassiana crescente da due sezioni di impianto. In basso a destra: endofiti B. bassiana conidi e conidiofori come si è visto al microscopio. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Figura 2. Effetto di trattamenti inoculazione sulla colonizzazione endofitica di beaimpianti n (Phaseolus vulgaris cv. Calima) di Beauveria bassiana, due settimane dopo l&#39;inoculazione con GHA ceppo. colonizzazione Percent rappresenta il numero di sezioni di impianto colonizzati diviso per il numero di sezioni di coltura.

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Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per introdurre il entomopathogen fungina<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; Come endophyte nel fagiolo comune (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), In preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico.

Stabilire funghi entomopatogeni come endofiti: Verso endofiti Controllo Biologico

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

34.5K Views.  International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia. Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per introdurre il entomopathogen fungina Beauveria bassiana Come endophyte nel fagiolo comune ( Phaseolus vulgaris), In preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico.

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Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in vivo. An area of research that holds promise in regenerative medicine is the combinatorial use of novel biomaterials and stem cells. A fundamental strategy in the field of tissue engineering is the use of three-dimensional scaffold (e.g., decellularized extracellular matrix, hydrogels, micro/nano particles) for directing cell function. This technology has evolved from the discovery that cells need a substrate upon which they can adhere, proliferate, and express their differentiated cellular phenotype and function 2-3. More recently, it has also been determined that cells not only use these substrates for adherence, but also interact and take cues from the matrix substrate (e.g., extracellular matrix, ECM)4. Therefore, the cells and scaffolds have a reciprocal connection that serves to control tissue development, organization, and ultimate function. Adipose-derived stem cells (ASCs) are mesenchymal, non-hematopoetic stem cells present in adipose tissue that can exhibit multi-lineage differentiation and serve as a readily available source of cells (i.e. pre-vascular endothelia and pericytes). Our hypothesis is that adipose-derived stem cells can be directed toward differing phenotypes simultaneously by simply co-culturing them in bilayered matrices1. Our laboratory is focused on dermal wound healing. To this end, we created a single composite matrix from the natural biomaterials, fibrin, collagen, and chitosan that can mimic the characteristics and functions of a dermal-specific wound healing ECM environment.

This protocol focuses on utilizing the inherent ability of stem cells to take cue from their surrounding extracellular matrix and be induced to differentiate into multiple phenotypes. This methods manuscript extends our description and characterization of a model utilizing a bilayered hydrogel, composed of PEG-fibrin and collagen, to simultaneously co-differentiate adipose-derived stem cells1.

Progettazione di un Hydrogel doppo strato di controllo differenziazione ASC

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Ricerca

Bioingegneria

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imaging dei tessuti biologici per desorbimento Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM di assemblee biologiche in liquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Sintesi di idrogel con proprietà antivegetative come membrane per la purificazione dell&#39;acqua

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Sintesi di biocompatibili a cristalli liquidi in elastomero Schiume come impalcature cellulari per 3D spaziali colture cellulari

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

Controllo del Cluster iniziale delle cellule 3D in un ibrido Gel cubo dispositivo per reticolo ripetibile formazioni

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Experimental Methods to Study Human Postural Control

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied by appropriate mathematical methods are needed to understand the role of the different sub-systems involved in human postural control. This article describes a protocol for performing perturbed standing experiments, acquiring experimental data, and carrying out the subsequent mathematical analysis, with the aim of understanding the role of musculoskeletal system and central control in human upright posture. The results generated by these methods are important, because they provide insight into the healthy balance control, form the basis for understanding the etiology of impaired balance in patients and the elderly, and aid in the design of interventions to improve postural control and stability. These methods can be used to study the role of somatosensory system, intrinsic stiffness of ankle joint, and visual system in postural control, and may also be extended to investigate the role of vestibular system. The methods are to be used in the case of an ankle strategy, where the body moves primarily about the ankle joint and is considered a single-link inverted pendulum.

This article presents an experimental/analytic framework to study human postural control. The protocol provides step-by-step procedures for performing standing experiments, measuring body kinematics and kinetics signals, and analyzing the results to provide insight into the mechanisms underlying human postural control.

Metodi sperimentali per studiare il controllo posturale umano

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

Sintesi di nanocluster d'oro a emissione di infrarossi nel vicino infrarosso per applicazioni biologiche

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositivi elettrici e a campo magnetico per la stimolazione dei tessuti biologici

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...