Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (AI079442 y AI091918) otorgados a SEFD

1. Preparación de medios de agar selectivos (BHI / L + G) para inhibir la microbiota intestinal <ol><li> Pesar 26 g de cerebro y corazón Infusion Agar (Difco), 7,5 g de LiCl y 5,0 g de glicina y colocar en un matraz de 1 litro. Añadir 500 ml de agua desionizada. </li><li> Calentar en un agitador magnético hasta que hierva el agar, agitando continuamente. Tome el frasco del fuego, deje que las burbujas se establecen brevemente y, a continuación, llevar de nuevo a hervir de nuevo. </li><li> . Autoclave durante 30 minutos a 121 ° C en 16 a 19 psi en un ciclo de líquido Nota: deje la barra de agitación en matraz. </li><li> Equilibrar los medios de comunicación a 55 ° C en un baño de agua o deje que se enfríe a temperatura ambiente. No permita que la solución para llegar más fresco a 55 ° C o los cristales se forman en el agar. Los cristales no inhiben L. monocytogenes o afecta a las propiedades selectivas de los medios de comunicación. Sin embargo, los cristales serán similares en apariencia a las pequeñas colonias y hará que sea difícil para contar UFC bacteriana. </li><li> Mezclar suavemente elagar durante 1 min utilizando un agitador magnético. Evite la formación de burbujas de aire. Vierta el agar en placas de Petri (~ 25 ml / placa). Nota: Este soporte no es compatible con el crecimiento de toda L. cepas monocytogenes. Por ejemplo, L. monocytogenes EGDe crece bien en este agar, con colonias visibles dentro de 36-48 horas, pero 10403S no crece en este medio. </li></ol> 2. Preparación del Inóculo <ol><li> Cortar el pan blanco en rodajas (Kroger) en pequeñas (2-3 mm) cubos con tijeras ora bisturí estéril estéril. No utilice las costras. La tienda de piezas individuales en tubos de microcentrífuga a -20 ° C hasta el día de la infección. </li><li> Usando un bisturí estéril, cortar pequeños (0.5-1 cm) trozos de mantequilla salada (Kroger) y coloque cada uno en un tubo estéril de microcentrífuga. Cada tubo contendrá mantequilla suficiente para preparar 50 a 60 piezas de pan. Almacenar a -20 ° C hasta que se necesite. </li><li> Crecer L. monocytogenes en caldo BHI agitación a 30 y°; C hasta que el cultivo alcanza una DO 600 de ~ 0,8-1,0. Preparar 500 ml de alícuotas en tubos de microcentrífuga, teniendo cuidado de vórtice de la muestra con frecuencia por lo que todos los tubos contienen el mismo número de bacterias. Almacenar a -80 ° C. </li><li> A título de las alícuotas bacterianas, descongelar un tubo en hielo y añadir 500 l de 9,5 ml de caldo BHI. Incubar durante 1,5 horas de pie a 30 ° C. Diluciones en serie de placas de agar BHI. Esperar un título de ~ 1-5 x 10 8 UFC / ml Nota:. Si se preparan alícuotas homogéneos, pueden esperar cada uno de los tubos para rendir este título cuando se preparan de una manera similar con una varianza de 2 a 4 veces. </li><li> Para infectar ratones, preparar una alícuota de L. monocytogenes como se describe en el paso 2.4. Acerca de 20 minutos antes de la L. cultura monocytogenes está listo, descongelar los trozos de pan a temperatura ambiente. Derrita una alícuota de mantequilla a 55 ° C y precalentar un pequeño volumen de PBS a 55 ° C. Preparar trozos lo suficientemente pan de manera que hay al menos una por ratónde estar infectados y al menos una pieza adicional para la determinación del título de la inóculo real. </li><li> Basado en el título predeterminado de la alícuota bacteriana, calcular el volumen total de L. cultura monocytogenes necesario para preparar los inóculos para el número requerido de piezas de pan. Pellet las bacterias por centrifugación a 14.000 xg durante 10 min Aspirar todo el caldo BHI y resuspender las bacterias en un pequeño volumen de PBS precalentado (2 l / pan pieza). </li><li> Vortex la mantequilla derretida, añadir a las bacterias (con un volumen total igual a 3 l / pedazo de pan) y mezclar bien Nota:. No trate de preparar más de 10 a 15 piezas de pan en un momento o la mantequilla se solidifique. </li><li> Trabajando rápidamente, pipeta de 5 l de la suspensión bacteriana en un único trozo de pan en un tubo de microcentrífuga. La solución debe ser completamente absorbida por la pieza de pan. </li><li> Para determinar el título real del inóculo, añadir 1 ml de PBS estéril a una de las piec panes. Vórtice vigorosamente durante 1 min. Preparar diluciones en serie y la placa tanto BHI y BHI / L + g de agar. </li><li> Procedimiento alternativo para la alta concentración (&gt; 10 9 CFU) inóculos. Si el sedimento bacteriano es demasiado grande, puede ser difícil a suspender en un volumen tan pequeño, y el material resultante es muy viscosa, como una pasta, y algunos de los inóculo puede pegarse a las paredes del tubo de microcentrífuga. En este caso, es mejor para inocular el pan en una placa de cultivo mm estéril 60, y para ofrecer todo el plato (sin la tapa) en el ratón (véase más adelante). Cualquier exceso de inóculo que no es absorbida por el pan, entonces puede ser consumido directamente por el ratón. En general, se necesita más tiempo para que los ratones a comer todo el pan y lamer el plato limpio que el protocolo estándar que se describe a continuación, por lo que esto sólo es el método preferido cuando se trata de muy alto inóculos título. </li></ol> 3. La infección de ratones <ol><li> Compra hembra BALB / c / A / J (de stock # 0010026) y C57BL/6/J (acción# 000644) de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y el uso de 6-9 semanas de edad. </li><li> Rápida a los ratones un día (24 horas) antes de la infección mediante la eliminación de la comida y la colocación de los ratones en elevada (1 pulgada) de suelos de alambre (# 3 malla; Allentown) para prevenir coprofagia. Deja sólo lo suficiente ropa de cama en la jaula para absorber la orina, pero no lo suficiente como para elevar las heces derramadas. Permitir el acceso restringido al agua. </li><li> Infect los ratones en el inicio del ciclo de oscuridad, de trabajo en una campana de flujo laminar equipada con una bombilla de luz roja. Transferencia de un solo ratón a una jaula vacía (sin ropa de cama). Usando unas pinzas esterilizadas, transferir la pieza de pan contaminado a la parte inferior de la jaula vacía. Por lo general, el ratón coger el trozo de pan y consumir por completo dentro de 2-10 min. Si el ratón no come el pan de inmediato, volver a la jaula para acumular y dejar mouse en reposo durante 20-30 min. La mayoría de los animales se comen el pan dentro de este plazo, sin embargo, los ratones se pueden dejar sin tocar, sin acceso a otla comida o el agua durante un máximo de 2 horas. </li><li> Después de la infección, devuelva el ratón a su jaula original y reponer la comida para ratones. Continuar para alojar a los ratones en los suelos de alambre elevado para la duración del experimento. </li></ol> 4. Controlar el nivel de bacterias en las heces <ol><li> Tubos de la etiqueta y pre-pesaje microcentrífuga para ser utilizados para la recogida de las heces. </li><li> Trabajando rápidamente después de recuperar la jaula de los ratones, coloque cada ratón en un vaso de 500 ml de plástico. Normalmente los ratones expulsar 1-4 pastillas de heces dentro de los 5 min. </li><li> Utilice unas pinzas estériles para transferir heces de tubos etiquetados adecuadamente. </li><li> Pesar cada tubo y calcular el peso de las heces restando el peso del tubo de vacío. Pesos típicos de los pellets fecales van desde 10-30 mg. </li><li> Añadir PBS a cada tubo (200 mg μl/30 heces) y usar un palillo de dientes estéril para triturar las partículas fecales. </li><li> Vortex cada tubo durante 30 segundos, a continuación, preparar diluciones en serie y la placa de BHI / L+ G de agar. Contar el número de colonias y calcular UFC / mg heces. </li></ol> 5. Procesamiento de los tejidos intestinales infectadas <ol><li> La eutanasia a los ratones, asépticamente cosechar el estómago y los intestinos de cada ratón como un único tejido y recoger en vacío 100 mm placas de Petri. </li><li> Separe el intestino delgado, el ciego y el colon y el lugar en platos separados 60 mm almacenados en hielo. El intestino delgado se pueden dividir aún más por la longitud en tres partes iguales se aproximan el duodeno, yeyuno, íleon y para facilitar la eliminación de los contenidos del lumen. Las terceras partes de tejido se pueden procesar ya sea juntos (por UFC por intestino delgado enteras) o por separado. Tejidos húmedos con ~ 0,5 ml de PBS estéril para mantener flexible y evitar las lágrimas durante la manipulación. </li><li> Llene una jeringa de 10 ml con 8 ml de PBS estéril y adjuntar una aguja de calibre 25. El uso de fórceps estériles para exprimir los contenidos luminales en un vaso de precipitados de residuos (o un tubo de 50 ml estéril si la recogida de los bacterias luminales). Gripesh 4 ml de PBS a través de uno de los extremos del tejido, utilice las pinzas para exprimir el contenido, y luego darle la vuelta al tejido una y repetir en el otro extremo. </li><li> Para cuantificar el número de Listeria en los contenidos luminales, centrifugar los rubores agrupados de 20 min a 12.000 xg, suspender el precipitado en 0,5 a 1,0 ml de agua estéril. </li><li> Para cuantificar el número total de cantidad asociada a las células de Listeria, abrir cada tejido lavado cortando longitudinalmente con hoja de bisturí estéril, y luego hacer varios cortes laterales para cortar el tejido en fragmentos más pequeños Nota:. Este paso es esencial para asegurar que el tejido intestinal no se ajusta alrededor de la hoja homogeneizador. Transferir las piezas intestinales a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 2 ml de agua estéril. </li><li> Esterilizar un homogeneizador de tejidos (Fisher PowerGen 1000) mediante la colocación de la sonda en etanol al 70% a la potencia 60% durante 30 s. Esperar a que el etanol se seque al aire, o proceso en agua estéril durante 10 segundos. Homogeneizar cada tiN ú mero de 1 min. Repita el tratamiento con agua estéril entre cada muestra, y el uso de etanol al 70% entre los grupos de muestra. </li><li> Preparar diluciones seriadas de cada muestra en agua estéril y placa en BHI / L + g de agar. </li></ol> 6. Procesamiento de infectados ganglios linfáticos mesentéricos <ol><li> Ganglios linfáticos Harvest asépticamente, colocar en una placa estéril de 60 mm en el hielo, y el uso de pinzas estériles para eliminar toda la grasa adjunta. Espera encontrar 3-6 nudos por ratón. </li><li> Preparar pantallas de tela metálica cortando pedazos de 1.5-2 pulgadas cuadradas de acero inoxidable # 80 mesh. Hacer un pequeño corte en cada esquina, y abatir los cuatro lados, creando una cama elevada. Sumerja en el 95% de etanol y luego llama para esterilizar, y colocar en una placa de Petri de 60 mm que contiene 0,75 ml de agua estéril. Después de cada uso, las pantallas pueden ser reciclados por inmersión en etanol al 70% durante 20 min, lavado con un cepillo para eliminar los tejidos incrustados, ebullición durante 20-30 min en NaOH 2N, y luego lavado extensivamente con agua. </li><li> Utilice el émbolode un ml jeringa estéril 3 a puré los nodos a través de la pantalla de malla. Asegúrese de empujar hacia abajo en la pantalla a la parte inferior del plato por lo que hace contacto con el agua en el plato. </li><li> Pasar 0,75 ml de agua estéril a través de la pantalla y, a continuación pipetear arriba y abajo varias veces para aclarar la pantalla. Transferir la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga. </li><li> Vortex cada muestra vigorosamente durante 30 segundos para lisar las células. Prepare diluciones en serie y la placa a cada + g de agar BHI / L. </li></ol> 7. Procesamiento de bazos infectados, hígados y vesículas biliares <ol><li> Agarre bazo con pinzas estériles y liberar haciendo dos cortes, uno en cada extremo. Colocar en un tubo de 15 ml que contiene 2,5 ml de agua estéril. (Nota: los tubos con fondos redondos pueden ser más fáciles de usar con el homogeneizador.) </li><li> Busque la vesícula biliar (un pequeño saco lleno de líquido amarillo conectado al hígado) y recorte cuidadosamente con tijeras estériles se desprenda de hígado sin estallar. Transfer a un tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de agua estéril. </li><li> Asépticamente quitar el hígado, y asegúrese de eliminar todos los lóbulos, y transferir a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 2,5 ml de agua estéril. </li><li> Homogeneizar bazos e hígados como se describió anteriormente durante 30 segundos en 60% de potencia. Vejigas Forgall, utilizan unas tijeras estériles para desgarrar en el tubo de microcentrífuga, y luego agitar vigorosamente durante 30 segundos. </li><li> Prepare diluciones en serie y la placa cada muestra a cada BHI o BHI / L + g de agar. </li></ol> 8. Procesamiento de cerebros infectados <ol><li> Trabajando desde el lado posterior del ratón, cortar la piel y el tejido por encima del cuello, y a través de ambas orejas en un ángulo de 45 °. Utilice un fórceps estériles que se despeguen la solapa en forma de U de la piel tirando hacia la nariz y exponer el cráneo y los huesos faciales. </li><li> Inmovilizar el cráneo por la celebración de la cresta ósea entre los ojos con unas pinzas, y utilizar tijeras para hacer cortes superficiales a través de los bordes laterales del cráneo. Sercuidado de cortar sólo el hueso y no del tejido cerebral. A continuación, cortar la cresta ósea entre los ojos. Use una pinza para sujetar la parte superior del cráneo y tire hacia atrás (hacia el cuello) para exponer el cerebro. </li><li> Levante con cuidado el cerebro de su cavidad utilizando una pinza estéril y colocar en un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 1,5 ml de agua estéril. </li><li> Homogeneizar durante 20 seg en el poder 60% como se describió anteriormente. Prepare diluciones en serie y la placa a cada BHI o BHI / L + g de agar. </li></ol> 9. Procedimiento de consulta: Fraccionamiento de tejidos intestinales 9.1 Aislamiento de bacterias en la Fracción Moco <ol><li> Para cada tejido intestinal, preparar 3 tubos que contenían 3 ml de 6 mM de N-acetilcisteína (NAC, Sigma # A-9165). </li><li> Coloque el enrojecida y longitudinalmente cortar el tejido en el primer tubo durante 1-2 minutos, girando vigorosamente cada 20-30 segundos. Usando una pinza estéril, coger el tejido y apretar suavemente contra el borde del tubo para eliminar el exceso de jabón lIdentificación. </li><li> Repita el paso 9.1.2 dos veces más utilizando los tubos de NAC restantes. Retire el tejido intestinal y dejar de lado para su posterior procesamiento. </li><li> Piscina la NAC se lava (total de 9 ml), y se centrifuga durante 20 min a 12.000 x g. </li><li> Resuspender el precipitado en agua estéril y agitar durante 30 segundos, se preparan diluciones en serie y la placa de BHI / L + G. </li></ol> 9.2 Aislamiento de bacterias en el teléfono (CE) fracción epitelial <ol><li> Cortar cada tejido en trozos pequeños con tijeras estériles y colocar en un tubo de 50 ml que contiene 5 ml de medio RPMI (Invitrogen # 21870) suplementado con 5% de FBS (RP-5), EDTA 5 mM, y DTT 1 mM. Incubar con agitación a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Transferir las piezas intestinales a un tubo fresco que contenía 5 ml RP5/EDTA/DTT e incubar con agitación a 37 ° C durante 20 min. Guarde los medios de comunicación desde el primer tubo y dejar de lado a 37 ° C. Repita este proceso una vez más para un total de tres incubaciones de 20 min en RP5/EDTA/DTT. Si proceder a la lámina propia isopaso ción, transferir las piezas intestinal restantes en vacío tubo de 50 ml. </li><li> Combinar las tres lavados RP5/EDTA/DTT (volumen total de 15 ml) y centrifugar a baja velocidad (1.200 x g) para sedimentar las células. </li><li> Para cuantificar las bacterias extracelulares, recoger el sobrenadante y se centrifuga durante 20 min a 12.000 x g. Resuspender el precipitado en 0,5 a 1,0 ml de agua estéril y diluciones en serie de placas de BHI / L + g de agar. </li><li> Para enumerar las bacterias intracelulares, resuspender el precipitado CE en 5 ml de RP-5, que contiene 25 mg / ml de gentamicina. Se incuba la suspensión de células individuales durante 30 min a 37 ° C más 7% de CO 2 para matar cualquier L. extracelular restante monocytogenes. Lavar las células dos veces en PBS, suspender en 0,5 ml de agua estéril, y agitar durante 30 segundos para lisar las células. Preparar diluciones seriadas en agua y plato en BHI / L + G. Nota: Las células recogidas en esta etapa también contendrán las células de los parches de Peyer subyacente. Si se desea, la Peyer es visibleLos parches pueden ser retirados de los tejidos intestinales antes de su salida y cortar longitudinalmente. </li></ol> 9.3 Aislamiento de bacterias en la propia (LP) Fracción Lamina <ol><li> Enjuague el exceso de TDT / EDTA a partir de las piezas intestinales mediante la adición de 25 ml de PBS estéril al tubo. Agitar enérgicamente, transferir a un tubo nuevo y repetir dos veces. </li><li> Transferir las piezas intestinales a un tubo de 50 ml que contenía 4 ml de solución de digestión que consiste en RP-5 suplementado con 1 mg / ml de colagenasa tipo IV y 40 mg / ml de DNAsa I. Se incuba con agitación a 37 ° C durante 40 min. </li><li> Transferencia de las piezas no digeridas en un tubo fresco que contenía 4 ml de solución de digestión y repetir una o dos veces hasta que las piezas de tejido se digirieron completamente. Guardar cada una de las soluciones de digestión, que contienen células LP liberadas, a 37 ° C. </li><li> Centrifugar las soluciones de digestión agrupados a baja velocidad (1.200 x g) para sedimentar las células. Procesar el sobrenadante y el sedimento de células por separado como el descrIBED arriba para enumerar las bacterias extracelulares e intracelulares, respectivamente. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Todos los experimentos descritos aquí se han realizado en cumplimiento de la Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio (OLAW) con la aprobación de la ICAUC en la Universidad de Kentucky.

Ratones consanguíneos no son uniformemente receptiva a la alimentación en todo momento del día, y su disposición a comer el pan contaminado dependerán tanto de la cepa de tipo y la edad de los ratones 17. En nuestra experiencia, 6-9 semanas de edad ratones B6 son receptivos a la alimentación en cualquier momento del día, pero los ratones BALB no comen constantemente la pieza de pan a menos que se ofrece durante su ciclo oscuro. El ciclo de luz de la habitación se utiliza para albergar a los animales p...

Listeria monocytogenes son facultativos patógenos bacterianos intracelulares que causan las infecciones transmitidas por los alimentos en los seres humanos. Las bacterias son resistentes a muchos de los procesos que se utilizan para proteger nuestro suministro de alimentos, tales como el secado, la salazón, o 1,2 refrigeración y las infecciones son generalmente vinculados a los alimentos procesados ​​y &quot;listos para comer&quot; que no son calentados antes de su consumo . En varios brotes anteriores, la fuente de L. alimentos monocytogenes-contaminada se identificó, y el grupo restringido de los individuos expuestos se controló estrechamente 3-6. En estos ejemplos, la enfermedad clínica en individuos por lo demás sanos varió desde una leve gastroenteritis autolimitada a las infecciones intestinales y sistémicas más graves que requirieron hospitalización. L. infecciones monocytogenes en los individuos inmunocomprometidos, incluyendo tanto los recién nacidos y los ancianos, se han asociado con una alta tasa de mortalidad (25-30%), a pesar del tratamiento antibiótico <shasta&gt; 7,8. Poco se sabe sobre la dosis infecciosa de L. monocytogenes, o los factores del huésped que rigen la susceptibilidad a la infección después de la transmisión oral, debido principalmente a la falta de un modelo animal pequeño que recapitula esta amplia gama de los resultados de infección. El modelo más ampliamente utilizado de la listeriosis es la inoculación intravenosa (iv) de los ratones. El modelo IV es altamente reproducible, y ha sido extremadamente útil para estudiar las respuestas de células T, tanto naïve y de memoria durante la infección 9,10. El inconveniente del modelo IV es que se evita por completo la fase intestinal de la infección. Después de la transmisión transmitidas por los alimentos, la mucosa intestinal proporciona una barrera que, presumiblemente, se ralentiza y limita el número de bacterias que pueden difundir continuamente a los tejidos periféricos. Por el contrario, todo el inóculo se puede encontrar en el bazo y el hígado en cuestión de minutos de la administración iv, y esta gran bolo de organismos puede abrumar d inmune innatoefenses en estos tejidos. La infección oral de los ratones por sonda se utiliza con menor frecuencia, ya que las dosis grandes (10 9 -10 11 CFU) suelen ser necesarios para lograr la colonización intestinal 10. Además, la inoculación intragástrica (IG) con una aguja de alimentación no genera un período reproducible de infección gastrointestinal antes de la diseminación sistémica. Algunos laboratorios han informado de que L. monocytogenes alcanzan el bazo y el hígado dentro de 4-12 horas después de la infección (hpi), mientras que otros no mostraron diseminación sistémica hasta 48 hpi 11-15. Esta variación de laboratorio a laboratorio puede ser una consecuencia de la naturaleza invasiva de la inoculación ig, lo cual puede resultar en menor trauma en el revestimiento del esófago, y promover la circulación sanguínea invasión directa de las bacterias. Recientemente hemos desarrollado un modelo de ratón de la novela oral de L. infección monocytogenes que imita muy de cerca todas las fases de la enfermedad humana 16. La infección se produce cuando los ratones ingieren trozos de contaminado alimentos, un proceso que es no traumática, y no requiere de habilidades especiales por los investigadores de laboratorio. Durante un período discreto de tiempo (36-48 horas), L. monocytogenes reproducible sólo colonizan el tracto gastrointestinal, permitiendo de este modo la investigación de los mecanismos utilizados por patógena Listeria a trasladar a través de la mucosa intestinal y difundir a los tejidos periféricos. Es importante destacar que, el modelo se puede utilizar para estudiar las diferencias en la resistencia innata huésped a la infección. En un estudio anterior, hemos demostrado que BALB / c / A / J ratones fueron altamente susceptibles a la listeriosis transmitida por los alimentos, con la replicación exponencial de L. monocytogenes que ocurren en el intestino, el bazo, el hígado, la vesícula biliar y 16. En contraste, los ratones C57BL / 6 fueron resistentes a la infección transmitida por alimentos, con sólo la colonización transitoria de L. monocytogenes se producen en cada uno de estos tejidos. Una característica adicional del modelo transmitidas por los alimentos que imita la enfermedad humana es que la difusión naturalesal cerebro se produjo durante las últimas etapas de la infección (dpi 5-7).

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brain Heart Infusion Agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>BD-241830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9650</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>Omnipur</td>
 <td>4840</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15575-038</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D5545</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase, type IV</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS004089</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS002007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Diff-Quik</td>
 <td>Dade-Behring</td>
 <td>B4132-1A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PowerGen 1000 homogenizer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-261-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stainless steel type 304 mesh #80</td>
 <td>Small Parts, Inc.</td>
 <td>CX-0080-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytospin</td>
 <td>Statspin</td>
 <td>M801-22</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

oral transmission of listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food

L. monocytogenes son facultativos patógenos bacterianos intracelulares que causan las infecciones transmitidas por los alimentos en los seres humanos. Muy poco se sabe acerca de la fase gastrointestinal de listeriosis debido a la falta de un modelo animal pequeño que imita la enfermedad humana. Este documento describe un modelo de ratón novedoso para la transmisión oral de L. monocytogenes. Usando este modelo, los ratones alimentados con L. monocytogenes-contaminada pan tiene una fase discreta de infección gastrointestinal, seguido por diversos grados de propagación sistémica en cepas de ratones susceptibles (BALB / c / Por / J) o resistentes (C57BL / 6). Durante las últimas etapas de la infección, se observa la difusión de la vesícula biliar y el cerebro. El modelo transmitidas por los alimentos de la listeriosis es altamente reproducible, no requiere habilidades especializadas, y se puede utilizar con una amplia variedad de cepas bacterianas y las cepas de ratón de laboratorio. Como tal, es el modelo ideal para estudiar tanto las estrategias de virulencia utilizados por L. monocytogenes </em&gt; para promover la colonización intestinal, así como la respuesta del huésped a la alimentación dado infección bacteriana invasiva.

L. monocytogenes colonias serán visibles en BHI / L + G placas después de 36 a 48 h de incubación a 37 ° C. Las colonias tienen un aspecto liso, con forma de cúpula de color blanco cremoso (Figura 1A). El crecimiento se inhibe durante la mayoría de la microbiota intestinal, pero es común para ver algunas colonias que no son L. monocytogenes, particularmente cuando placas intestino delgado o el colon directamente sin dilución significativa (Figura 1B). Colonias ...

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Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Este documento describe un nuevo método para la infección oral de ratones utilizando<em&gt; Listeria monocytogenes</emAlimentación&gt; contaminados. El protocolo puede adaptarse fácilmente para su uso con alimentos otros patógenos bacterianos transmitidas.

La transmisión oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En ratones a través de la ingestión de alimentos contaminados

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

oral-transmission-listeria-monocytogenes-mice-via-ingestion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

19.1K vistas.  University of Kentucky. Este documento describe un nuevo método para la infección oral de ratones utilizando Listeria monocytogenes contaminados. El protocolo puede adaptarse fácilmente para su uso con alimentos otros patógenos bacterianos transmitidas.

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

La purificación del ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En los macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseosa Ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

Listeria monocytogenes Infección del cerebro

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imagen de la producción de interferón gamma in situ en el bazo de ratón después de la infección por Listeria monocytogenes

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Inducing Meningococcal Meningitis Serogroup C in Mice via Intracisternal Delivery

Neisseria meningitidis (meningococcus) is a narrow-host-range microorganism, globally recognized as the leading cause of bacterial meningitis. Meningococcus is a transient colonizer of human nasopharynx of approximately 10% of healthy subject. In particular circumstances, it acquires an invasive ability to penetrate the mucosal barrier and invades the bloodstream causing septicaemia. In the latest case, fulminating sepsis could arise even without the consequent development of meningitis. Conversely, bacteria could poorly multiply in the bloodstream, cross the blood brain barrier, reach the central nervous system, leading to fulminant meningitis. The murine models of bacterial meningitis represent a useful tool to investigate the host-pathogen interactions and to analyze the pathogenetic mechanisms responsible for this lethal disease. Although, several experimental model systems have been evaluated over the last decades, none of these were able to reproduce the characteristic pathological events of meningococcal disease. In this experimental protocol, we describe a detailed procedure for the induction of meningococcal meningitis in a mouse model based on the intracisternal inoculation of bacteria. The peculiar signs of human meningitis were recorded in the murine host through the assessment of clinical parameters (e.g., temperature, body weight), evaluation of survival rate, microbiological analysis and histological examination of brain injury. When using intracisternal (i.cist.) inoculum, meningococci complete delivery directly into cisterna magna, leading to a very efficient meningococcal replication in the brain tissue. A 1,000-fold increase of viable count of bacteria is observed in about 18 h. Moreover, meningococci are also found in the spleen, and liver of infected mice, suggesting that the liver may represent a target organ for meningococcal replication.

Here, we describe a method to induce meningococcal meningitis through an intracisternal route of infection in adult mice. We present a step by step protocol of meningococcal infection from the preparation of inoculum to the intracisternal infection; then record the animal survival and evaluate the bacterial loads in murine tissues.