Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, tales como, cómo un producto genético que es difícil de expresar en E. coli purifica. Las principales ventajas de esta técnica son que ninguna reacción enzimática, aparte de la PCR, es el portador, y se pueden utilizar aplicaciones comunes para la purificación de proteínas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la purificación de proteínas en estreptococos mutanos, también puede ser un informado de otras especies de microbiota.
Demostrando el procedimiento estará el Dr.Mamiko Yamashita, un estudiante de posgrado de nuestro laboratorio. Después del diseño de imprimación y la extracción de ADN genómico de estreptococos mutans, realice la primera PCR utilizando el estreptococo mutans de tipo salvaje y GFC interrumpió el estreptococo mutan genoma como las plantillas de PCR. Amplificar las regiones que albergan la parte aguas abajo del gen gtfC y las que albergan el gen de resistencia a la espectinomicina utilizando la imprimación gtfC hacia adelante y hacia atrás preparada y la imprimación r-forward y reverse de 200.
A continuación, electrofores y cada producto PCR en gel de 1% de agarosa. Utilice un cortador de bandas de gel para extirpar los fragmentos de ADN deseados de aproximadamente 1.000 pares de bases y 2.000 pares de bases del gel en tubos de microcentrífuga. Añadir 500 microlitros de tampón solubilizante en cada tubo e incubarlos durante 10 minutos a 56 grados Celsius para disolver las rodajas de gel.
Purificar los fragmentos utilizando el método de extracción de gel a base de membrana de sílice. Realice un segundo PCR utilizando los productos del primer PCR como plantillas de PCR con las imprimaciones anidadas hacia adelante y anóteles.reverse. Cuando el segundo producto PCR no puede ser confirmado por electroforesis, se debe diseñar otro par de imprimación anidada.
electroforos cinco microlitros de la mezcla de PCR en el gel de agarosa. Confirme la generación del amplicon adecuado de aproximadamente 3.000 pares base mediante la imagen de tinción de gel de bromuro de etidio y proceda según el manuscrito. Ahora, mezcle cinco microlitros del segundo producto PCR concentrado en la aloculinación de 50 microlitros de células de estreptococo mutan de tipo silvestre competentes, congeladas previamente.
Agregue la mezcla en una cubeta de electroporación y coloque la cubeta en la cámara de la cubeta del aparato de electroporación. Dar un solo pulso eléctrico de 1,8 kilovoltas, 600 ohmios y 10 microfaradios durante 2,5 milisegundos a las células. Agregue 500 microlitros de caldo de infusión cerebro-corazón en la cubeta.
Extienda inmediatamente de 10 a 100 microlitros de la suspensión sobre placas de sinfín de infusión cerebral-corazón que contienen espectinomicina. Incubar las placas durante dos a seis días a 37 grados centígrados hasta que las colonias hayan crecido lo suficiente como para ser recogidas. Después de la generación de secuencia de codificación de polihistidina estreptococo muta incorporada cepa y inoculación durante la noche sin espectinomicina según el manuscrito, centrifugar la suspensión de cultivo bacteriano durante 20 minutos a 10.000 veces g a cuatro grados centígrados.
Transfiera el sobrenadante de cultivo en un vaso de vidrio de tres litros. Para concentrar las proteínas del sobrenadante de cultivo, coloque el sobrenadante de dos litros en un agitador magnético y comience a agitar vigorosamente. Añadir 1, 122 gramos de sulfato de amonio y dejar que el precipitado se forme con agitación vigorosa a cuatro grados centígrados durante un período de cuatro horas o durante la noche. próximo.
centrifugar la solución precipitada de sulfato de amonio a 15.000 veces g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante. Con una espátula, recoger el precipitado y transferirlo a un vaso de vidrio de 200 mililitros.
Resuspender los pellets en 35 mililitros de tampón de unión. A continuación, transfiera cada uno aproximadamente 25 mililitros de la suspensión a un tubo de diálisis de celulosa regenerado. Coloque el tubo de diálisis en 2,5 litros del tampón de unión de agitación en un agitador a cuatro grados centígrados para marcar la suspensión.
Reemplace la solución de diálisis después de dos horas y continúe la diálisis durante la noche. A continuación, transfiera la suspensión dializada del tubo a los tubos centrífugos y coloque los tubos en la centrífuga a 20.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Con el equipo de filtración de sección, vierta el sobrenadante sobre un filtro de membrana de 0,2 micrómetros para filtrar.
Transfiera el filtrado a un matraz de 75 mililitros. Para fraccionar el gtfSI con etiqueta de polihistidina de la suspensión filtrada, primero prepare una cromatografía de afinidad metálica inmovilizada. Después de equilibrar la resina según el manuscrito, cierre la polla de pellizcar Hoffman.
Agregue cinco mililitros de la suspensión filtrada en la columna para hacer una suspensión. A continuación, transfiera toda la suspensión a la suspensión filtrada restante y gire suavemente la mezcla durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a cargar la mezcla en la columna.
Abra la polla de pellizcar Hoffman para quitar la suspensión por el flujo de gravedad. Lave la resina IMAC con 20 mililitros de tampón de unión y luego, elulice 20 mililitros de tampón de elución para obtener el gtfSI recombinante. Después de eso, cargue el eluido en un tubo de ultrafiltración centrífuga y centrifugar la solución a 2.000 veces g durante uno a cinco minutos para concentrar la solución.
Vacíe el envase del filtrado y agregue 15 mililitros de tampón de almacenamiento en el tubo. Centrifugar la muestra de nuevo y repita el proceso dos veces adicionales. La solución gtfSI recombinante finalmente se concentra en aproximadamente un mililitro.
Transfiera el concentrado a un tubo de microcentrífuga y guárdelo a cuatro grados centígrados. Continúe con el protocolo de restauración funcional del resto. En este protocolo, la electroforesis de gel de agarosa muestra que el tamaño de cada amplicon del primer PCR y el segundo PCR correspondía con el tamaño previsto.
Las colonias de Streptococcus mutans se transformaron con el segundo producto PCR y se encasinaron en las placas de sinfín de infusión cerebro-corazón que contienen espectinomicina. Los productos de PCR de colonia se ejecutan en el gel de agarosa muestra que cada amplicon era del tamaño pronosticado. La proteína purificada con cromatografía de afinidad de metal inmovilizado se observó como una sola banda por SDS-PAGE.
Western blot, realizada con el anticuerpo anti-polihistidina, confirmó que la banda observada era la proteína etiquetada con polihistidina esperada de 160 kilodaltons. La capacidad de formación de biopelículas derivada de la sacarosa sólo se vio con estreptococos mutans de tipo salvaje y estreptococo muta Su-gtfC, que formó una biopelícula adherente en la pared del tubo en presencia de 1%sacarosa. Esto no se observó en estreptococo mutans delta gtfC.
Sin embargo, la adición de 25 microgramos del gtfSI recombinante restauró la capacidad de formación de biopelículas adherentes en estreptococo mutans delta gtfC. Dado que el éxito de este método depende de la segunda amplificación de PCR, el segundo producto PCR debe ser confirmado por electroforesis. Ya, la proteína de tipo histidina obtenida por este método también se está reuniendo a los ácidos funcionales, como las interacciones proteína-proteína.
Después de su desarrollo, esta técnica, en combinación con la alteración de genes, allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploraran la función génica.
