Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patogénesis bacteriana sobre si las bacterias transmitidas por la sangre pueden cruzar la barrera hematoencefálica para infectar el sistema nervioso central y el cerebro. Con esta técnica, los números bacterianos dentro de la sangre y el tejido cerebral de los animales infectados se pueden determinar excluyendo el número de bacterias que residen dentro de los vasos sanguíneos del cerebro. Demostrar el procedimiento será Pallab Ghosh, un investigador asociado de mi laboratorio.
A las 72 horas posteriores a la infección, establezca un sistema de perfusión automatizado a un caudal de cuatro mililitros de PBS complementados con 10 mililitros de EDTA por minuto. Y coloque al animal eutanizado en la posición supina en una sartén de disección. Confirme la eutanasia por falta de respuesta al pellizco de la pata.
Y moja el abdomen con 75% de etanol. Usa tijeras para hacer una incisión en la pared abdominal justo debajo de la caja torácica para exponer el diafragma y los órganos viscerales. Y corta el diafragma para abrir la cavidad torácica.
Corte la jaula de frotar bilateralmente para exponer el ventrículo izquierdo y use fórceps para agarrar suavemente el corazón. Inserte una aguja de mariposa de calibre 21 conectada al sistema de perfusión en el ventrículo izquierdo y corte cuidadosamente la aurícula derecha para recoger alrededor de 200 microlitros de sangre en un tubo de dos mililitros que contenga EDTA de 10 mililitros para evitar la coagulación. Luego perfunde al animal durante cuatro minutos con 15 a 20 mililitros de PBS más EDTA.
Después de la perfusión completa, el cerebro y el hígado aparecerán blanqueados asegurando que las bacterias restantes son de los órganos cosechados y no de la sangre circulante. Después de la perfusión, transfiera cuidadosamente los órganos de interés a tubos cónicos estériles individuales de 15 mililitros que contienen cinco mililitros de PBS estériles de cuatro grados Celsius por tubo. Para cosechar el cerebro después de la decapitación, usa tijeras para cortar la piel del cuero cabelludo por la línea media entre los ojos, manteniendo las puntas presionadas contra el cráneo para recortar cualquier exceso de tejido según sea necesario.
Inserte suavemente una punta de las tijeras en el foramen magnum y corte lateralmente en el cráneo en ambos lados. Corte cuidadosamente el cráneo entre los ojos por la línea media del cráneo, teniendo cuidado de aplicar presión lateral y evitar la perturbación del cerebro. Usando fórceps, abre el cráneo para exponer el cerebro y coloca una espátula entre la parte inferior del cerebro y la base del cráneo para transferir cuidadosamente el cerebro a un tubo de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de cuatro grados Celsius PBS.
En un gabinete de bioseguridad, inserte la punta y ejecute un homogeneizador de tejido durante 10 segundos en soluciones secuenciales de 5%lejía, agua estéril, 75% etanol y agua estéril en tubos cónicos separados de 15 mililitros. Cuando la punta ha sido completamente esterilizada, homogeneizar el cerebro infectado en su tubo. Cuando no queden fragmentos de tejido visible, vuelva a esterilizar la punta para evitar el traspaso bacteriano a la siguiente muestra de órgano, y homogeneice el siguiente órgano.
Cuando todos los órganos hayan sido homogeneizados, prepare diluciones seriales 10 veces de cada órgano homogeneizados en PBS estéril y placa las diluciones en placas de agar de infusión cerebro-corazón. Luego incubar los cultivos de dilución homogeneizada a 37 grados Celsius durante la noche y contar el número de colonias en cada placa para determinar el número total de bacterias por órgano o mililitro de sangre. El cálculo de las cargas bacterianas en los órganos de ratón infectados por L.monocytogenes, como acaba de demostrar, sugiere que la perfusión posterior a la infección no altera significativamente la carga bacteriana en la sangre u órganos de ratones infectados que fueron examinados en este estudio representativo.
Después de este procedimiento, los órganos infectados por Listeria monocytogenes pueden procesarse posteriormente para análisis adicionales, como el procesamiento histopatológico, para responder preguntas adicionales sobre la infiltración de células inflamatorias en órganos de ratón infectados en comparación con animales de control no infectados. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar la perturbación del cerebro y mantener un contacto mínimo entre las tijeras y el tejido cerebral.
