La financiación de los aspectos de este trabajo fue proporcionada por diversas fuentes, incluyendo el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos del Acuerdo de Cooperación Específico 58-6408-1-595 y la Fundación Nacional de Ciencia (premio 1.049.911).

Análisis colorimétrica de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos 1. Preparación del substrato y Soluciones tampón para análisis colorimétricos de actividad enzimática <ol><li> H Preparar 50 mM de tampón de acetato (pH 5.0-5.5) mediante la mezcla de 50 ml de 0.1 M de ácido acético (2,87 ml de ácido acético glacial en 500 ml de agua), 150 ml de acetato de sodio 0,1 M, y 200 ml de agua destilada 2 O. Ajustar el pH a 5,0-5,5 con ácido acético 0,1 M si es necesario. </li><li> Preparar una solución de 1 M de hidróxido de sodio (NaOH) en H2O destilada </li><li> Preparar soluciones de sustrato NP-linked p en 50 mM de tampón acetato. Para ensayo de fosfatasa preparar 5 mM p NP-fosfato en 50 mM de tampón acetato; para ensayar la β-glucosidasa preparar 5 mM p NP-β-glucopiranósido; para someter a ensayo la NAGase preparar 2 mM de PNP-β-N-acetylglucosaminide. Preparar todas las soluciones de sustrato en estériles de 15 ml o 50 ml tubos de centrífuga. Las soluciones pueden ser almacenadas a 4 ° C durante 2-3 semanas. </li></ol> 2. Determinación de un estándar para convertir Absorbancia Concentración de p NP <ol><li> Preparar soluciones estándar de p-nitrofenol en 50 mM de tampón acetato. Las concentraciones deben variar desde 0,025 hasta 1 mM. </li><li> Transferencia tres repeticiones de 100 l de cada concentración a una clara microplaca de 96 pocillos. Añadir 10 l de NaOH 1 M y 190 l de H2O destilada a cada pocillo. </li><li> Absorbancia Récord en 410 nm utilizando un lector de microplacas. </li><li> Concentraciones se multiplican en la curva estándar de 0,3 para obtener moles p NP por cada 300 l de volumen de reacción. Trazar una curva de absorbancia frente micromoles de p NP. La pendiente de la curva sirve como el factor de conversión (C) que se relacionan la absorbancia a micromoles de p NP en cada reacción de la enzima. </li></ol> 3. Realizar el ensayo enzimático <ol><li> Para suelos, preparar una suspensión de cada muestra a ensayar en un tubo de centrífuga de 15 ml estéril a una Concentrción de aproximadamente 1 g / ml -1 utilizando 50 mM de tampón acetato. Para los sedimentos, añadir tampón de acetato suficiente para hacer la pasta fácilmente pipettable. El volumen exacto de suspensión necesaria variará de acuerdo con el número de enzimas ensayadas, pero se recomienda un mínimo de 5 ml. Vortex cada suspensión hasta que todos los grumos de suelo o los sedimentos se han dispersado y anote el volumen final. </li><li> Re-vórtice cada suspensión y pipeta de inmediato 150 l en cada uno de los seis pozos en un bloque de 96 pocillos para pozos profundos (Figura 1). Es importante mezclar bien y con frecuencia con el fin de mantener a las partículas del suelo en suspensión. Deje por lo menos dos pozos por bloque vacías para servir como control de sustrato. Nota: el clip final de puntas de pipeta con tijeras antes de pipetear como suelos fangosos tienden a obstruir las propinas. Preparar un bloque de 96 pocillos para cada enzima a ensayar. </li><li> Verter aproximadamente 5 ml de tampón de acetato en un depósito pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a añadir 150 l de la memoria intermedia a la LAST dos pozos de cada muestra (estos serán controles de tampón de muestra) y los dos pocillos de control sustrato (Figura 1) </li><li> Vierta aproximadamente 10 ml de la solución apropiada NP-sustrato p en un depósito pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a añadir 150 l de la solución de sustrato a las primeras cuatro pocillos de cada muestra y los dos pocillos de control sustrato (Figura 1). Tenga en cuenta el tiempo que la reacción se inicia tan pronto como se añade la solución de sustrato. </li><li> Incubar las placas a temperatura ambiente (22 ° C) durante 0,5-4 h. Tiempo de incubación exacta variará dependiendo del nivel de actividad en las muestras y la enzima a ensayar. Para la mayoría de los suelos y sedimentos, fosfatasa y β-glucosidasa requieren tiempos de incubación de 0,5 a 1,5 horas, mientras que la NAGase y otras enzimas requieren tiempos de incubación de&gt; 2 h. </li><li> Mientras que los ensayos están incubando preparar clara microplacas de 96 pocillos a interpretar la extinción. Preparar una microplaca para cada bloque de pozos profundos (es decir, para cada direcciónnzyme ensayada). Pipetear 10 l 1 M NaOH y 190 l de agua destilada en cada pocillo de la microplaca. Nota: NaOH ralentiza la reacción enzimática y eleva el pH que mejora el color de la p NP liberado durante la reacción. </li><li> Después de la incubación, centrifugar los bloques de 96 pocillos a 2.000-5.000 g durante 5 min para sedimentar las partículas del suelo. </li><li> Use una pipeta multicanal a retirar 100 l de cada pocillo, teniendo cuidado de evitar la pastilla, y la transferencia a las correspondientes bien en claro microplaca de 96 pocillos preparados. </li><li> Encienda el lector de microplacas y configurar el software necesario. Absorbancia Récord en los 410 nm. Si la absorbancia de un pozo en particular está por encima del límite de detección lineal de la lector de placas, diluir así que 1:01 con agua y volver a medir. Si la absorbancia es todavía demasiado alta, el ensayo debe repetirse con un tiempo de incubación más corto. </li></ol> 4. Determinación de la masa seca de las muestras <ol><li> Pipetear 1 ml de cada sampl<html> e mezcla en una cacerola de aluminio previamente pesado. </li><li> Secar en una estufa de secado 75 ° C durante 48 horas y pesar. Reste el peso de la cacerola de este valor para obtener la masa seca del suelo o sedimento en 1 ml de la suspensión. Multiplicar por un factor de 0,15 para determinar la masa seca de la muestra en los 150 l añadidos a cada pocillo en el ensayo enzimático. </li></ol> 5. Cálculo de la actividad enzimática por la masa seca del suelo o sedimento <ol><li> Cálculo de absorbancia final de cada muestra sustrayendo la absorbancia de la muestra de control a partir de la absorbancia de la muestra de ensayo. Si los controles de sustrato tienen alta absorbencia (aproximadamente&gt; 0.060) luego restar esos también. </li><li> Cálculo de la actividad enzimática en moles h -1 g de masa seca -1 partir de la ecuación: </li></ol> La actividad enzimática = / (masa C x tiempo de incubación x muestra seca) absorbancia final Análisis fluorescente de la enzima extracelular Actividad en Natural Aguas tle &quot;&gt; 1. Preparación de sustrato, Standard y Soluciones tampón para análisis fluorométricos de actividad enzimática <ol><li> Preparar 200 M soluciones de sustratos MUB enlaces-(por ejemplo, 4-MUB-β-glucopiranósido, 4-MUB-fosfato, 4-MUB-N-acetil-β-D-glucosaminida) disolviendo el sustrato apropiado en estéril (autoclave) destilada H2O en 15 ml estériles o tubos de 50 ml de centrífuga. Envuelva los tubos de papel de aluminio para evitar la luz y almacenar en el refrigerador antes de su uso. Los sustratos deben ser estables durante al menos 1 semana si se almacena de esta manera. </li><li> Preparar un estándar MUB haciendo una solución madre de 100 mM 4-metilumbeliferona en agua destilada estéril 2 O. Almacene refrigerado en ámbar o botella envueltas en papel aluminio. Inmediatamente antes de su uso, diluir la solución 100 mM de stock de 1/10 en H2O estéril para hacer una solución de trabajo de 10 m para los ensayos enzimáticos. </li><li> Preparar una solución madre de tampón de bicarbonato 100 mM disolviendo 8,4 g de NaHCO &lt;sub&gt; 3 en 1 LH 2 O y autoclave. Diluir esta solución madre 1/20 en H2O estéril según sea necesario para hacer una solución de trabajo de 5 mM para los ensayos enzimáticos. </li></ol> 2. La organización de muestras de agua en un 96 pocillos de microplacas Negro <ol><li> Organizar una microplaca para cada enzima siguiendo el ejemplo mostrado en la Figura 2. Tenga en cuenta que lo que permite la replicación adecuada, estándares, y los controles, este procedimiento puede ensayar la actividad de una única enzima para un máximo de nueve muestras de agua en uno de 96 pocillos de microplacas negro. </li><li> Verter aproximadamente 5 ml de la primera muestra en un depósito de pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a pipette200 l en todos los pocillos de la columna 1 de la microplaca (s). Deseche las puntas de pipeta usadas y repetir según sea necesario para cada muestra de agua para llenar las columnas 1-9. </li></ol> 3. Configuración de la Muestra, Standard, Quench, y controles de sustrato <ol><li> Establecer controles para dar cuenta de las muestras, estándars, sustrato y enfriamiento en la misma microplaca negro como las muestras (Figura 2). </li><li> Controles de muestra contienen agua de muestra y tampón de bicarbonato, y no se utilizan en los cálculos de actividad pero demostrarán la lectura de la consistencia a lo largo del curso del experimento. Los controles de enfriamiento consisten en agua de la muestra y una cantidad estándar de la etiqueta fluorescente y se utilizan para medir la difracción de la fluorescencia en la muestra de agua. Substrato y controles estándar se componen de tampón o bien-sustrato vinculado o la etiqueta fluorescente estándar, respectivamente, y bicarbonato. </li><li> Vierta aproximadamente 5 ml de 5 mM de tampón de bicarbonato en un depósito de pipeta limpia. Pipetear 50 l de tampón en los pocillos de la microplaca 1 a 9 en filas D y E para formar dos pocillos replicados de controles de la muestra por muestra. Puntas de pipeta Cambio luego se transfieren 200 l de tampón de bicarbonato para pozos de 10 a 12 en las filas A y H. </li><li> Reducir la iluminación ambiental por atenuar o apagar las lilos dere como el estándar fluorescente es sensible a la luz. </li><li> Verter aproximadamente 5 ml de 10 mM 4-metilumbeliferona en un depósito de pipeta limpia. Pipetear 50 l en los pocillos de la microplaca de 1 a 12 en la fila H, y en los pozos 1 al 9 en filas G y F para formar tres réplicas de los controles de enfriamiento por muestra y los controles generales estándar. O coloque la microplaca en la oscuridad o cubrir con una tapa opaca para reducir la degradación de la luz de MUB. </li><li> Encienda el fluorómetro y puesta en marcha cualquier software necesario para estar listo para leer antes de añadir el sustrato. Nota: algunas bombillas fluorómetro pueden requerir un tiempo de calentamiento de 3 minutos o más. </li><li> Verter aproximadamente 5 ml de sustrato MUB vinculado-apropiado (por ejemplo 4-MUB-fosfato) en un depósito de pipeta limpia. Utilice una pipeta de 12 canales para pipetear 50 l en los pozos de la microplaca de 1 a 12 en la fila A, y en los pozos 1 a 9 en las líneas B y C para formar tres ensayos replicados de cada muestra y tres controles de sustrato. INMEDIATAMy vaya al paso 4.1, la fluorescencia de grabación. </li></ol> 4. Fluorescencia de grabación <ol><li> Leer la fluorescencia inicial inmediatamente después de la adición de sustrato a la microplaca. Después de leer la fluorescencia, se incuba la microplaca a temperatura ambiente (22 ° C) o bien en la oscuridad o cubierta con una tapa opaca para reducir la degradación de la luz MUB. </li><li> El tiempo de incubación requerido para medir la actividad máxima de la enzima potencial en una muestra de agua dependerá de la concentración de la enzima dentro de la muestra. Dado que este es desconocida antes de que se completó el ensayo, la microplaca se tendrá que leer en múltiples pasos de tiempo. Típicamente, la lectura a intervalos de 10-15 minutos en el transcurso de 1 h es aceptable para muchas enzimas, aunque las muestras con actividad muy alta para ciertas enzimas pueden alcanzar su punto máximo antes de 10 min. </li><li> Seguir leyendo la fluorescencia en microplacas a sus intervalos designados durante al menos 1 hora. Asegúrese de mantener la microplaca cubierta o en la oscuridad entre la lecturas. </li></ol> 5. Cálculo de la actividad enzimática por volumen de agua <ol><li> Para cada muestra en cada intervalo de tiempo de cálculo de las: fluorescencia media de la muestra inicial (pozos D y E), la fluorescencia de la muestra final media (pozos AC), la media de fluorescencia estándar (pozos H10-11), y la media apagan la fluorescencia de control (pozos FG). </li><li> Para cada intervalo de tiempo, calcular la actividad enzimática en nmoles hr -1 ml-1 a partir de la ecuación: </li></ol> La actividad enzimática = (media fluorescencia de la muestra - significará la fluorescencia de la muestra inicial) / ((media de fluorescencia / 0,5 mol) x estándar (media saciar la fluorescencia de control / media de fluorescencia) x estándar (0,2 ml) x (tiempo en horas)) <ol start="3"><li> Examine los valores de actividad calculados para cada paso de tiempo. Determinar la actividad potencial final a partir de la etapa de tiempo con la actividad más alta. Si los valores de actividad siguen aumentando entonces pueden ser necesarias medidas de tiempo posteriores, si los valores de actividad caen througHout el transcurso de la carrera, a continuación, ejecute de nuevo con pasos de tiempo más cortos. Actividad final es en nmoles de sustrato consumido hr -1 ml -1, pero se puede escalar hasta expresar como micromoles hr -1 L -1. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La determinación de la actividad de una variedad de enzimas extracelulares microbianas en suelos y sedimentos puede proporcionar información útil sobre las tasas de mineralización de nutrientes y de procesamiento de materia orgánica 17. Sin embargo, los suelos pueden varían en sus niveles de humedad, por lo que es importante normalizar la actividad de peso en seco del suelo. Esto requiere una etapa de secado adicional (normalmente dos días) más allá de la simple medición de la actividad enzimática....

Los microorganismos tales como bacterias y hongos obtienen los nutrientes y de carbono a partir de compuestos orgánicos complejos a través de la producción de enzimas extracelulares. Estas enzimas hidrolizan típicamente polímeros en subunidades más pequeñas que se pueden tomar en la célula. Por lo tanto, a nivel ecológico, estas enzimas extracelulares microbianos son responsables de gran parte de la mineralización de nutrientes y la descomposición de la materia orgánica que se produce en entornos naturales. Las enzimas tales como celobiohidrolasa (CBH) y β-glucosidasa son importantes para la degradación de la celulosa y el trabajo al unísono para catalizar la hidrólisis de la celulosa a glucosa 1,2, que proporciona un sustrato de carbono utilizable para la absorción y asimilación microbiana. La enzima fosfatasa libera grupos fosfatos inorgánicos solubles de organofosfatos, esencialmente mineralizantes fosfato y su puesta a disposición para su uso por la mayoría de los organismos 3. Otras enzimas, tales como N-acetilglucosaminidasa (la NAGase), son IMPORTANTESt en la degradación de la quitina y puede hacer tanto el carbono y el nitrógeno disponible para la adquisición microbiana 4. Uno de los procedimientos para el ensayo de actividad de la enzima microbiana extracelular en ambientes naturales es el uso de p-nitrofenil artificial de sustratos enlazados (p NP), un enfoque que se desarrolló originalmente para detectar la actividad fosfatasa de suelo 5. Este enfoque se basa en la detección de un producto final coloreado, p-nitrofenol, que se libera cuando el sustrato artificial es hidrolizado por la enzima apropiada. El p-nitrofenol puede posteriormente cuantificar colorimétricamente midiendo su absorbancia a alrededor de 400-410 nm. Este método ya se ha aplicado para detectar otras enzimas tales como la NAGase 6, y se ha utilizado en varios estudios en busca de actividad de la enzima microbiana extracelular en los suelos y sedimentos 7-9. Un enfoque alternativo que era originally desarrollado para evaluar la actividad glucosidasa extracelular en ambientes acuáticos 10,11 hace uso de (MUB) sustratos ligados 4 metilumbeliferona. El producto final liberado (4-metilumbeliferona) es altamente fluorescente y puede detectarse utilizando un fluorómetro con un ajuste de excitación / emisión de alrededor de 360/460 nm. Una variedad de sustratos artificiales MUB enlaces-están disponibles, permitiendo la medición fluorométrica de la actividad de al menos el mayor número de enzimas (por ejemplo, β-glucosidasa, celobiohidrolasa, Nagase, fosfatasa) como puede ensayarse usando el procedimiento colorimétrico-NP sustrato p. Otras enzimas extracelulares microbianos, tales como la aminopeptidasa de leucina en proteínas degradantes, se pueden ensayar fluorométricamente utilizando 7-amino-4-metil-cumarina (COU) sustratos enlazados. Tanto MUB-y sustratos COU vinculados se han utilizado para determinar la actividad de la enzima en varias muestras terrestres y acuáticos 12,13. Mientras que los estudios anteriores han described microplaca fluorométrico o colorimétrico se acerca para determinar la actividad enzimática extracelular 14, hay una necesidad de una presentación clara de cómo llevar a cabo dichos ensayos. Aquí se demuestra los procedimientos para la realización de técnicas de alto rendimiento de la microplaca para el análisis de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos, utilizando el enfoque sustratos NP-linked p colorimétrico y en aguas naturales mediante la técnica fluorescente sustratos MUB enlazada. Nos centramos en la medición de las actividades de β-glucosidasa, la NAGase, y fosfatasa como estas enzimas pueden estar vinculados a carbono, de nitrógeno, de fósforo y el ciclismo, respectivamente. Sin embargo, los procedimientos descritos aquí se pueden aplicar a la medición de otros enzimas extracelulares utilizando diferentes sustratos artificiales.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS AND MATERIALS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP612-1</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3234</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7006</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9376</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Clear 96-well microplates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-563-301</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96-well deep well blocks</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3958</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Aluminum weigh pans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 15 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8883</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3633</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2133</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96-well microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3792</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-81</td>
			<td>For microplates/deep-well blocks</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate fluorometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>FLx 800</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>8-channel pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of microbial extracellular enzyme activity in waters, soils, and sediments using high throughput microplate assays

Gran parte de la ciclo de los nutrientes y el procesamiento de carbono en ambientes naturales se produce a través de la actividad de las enzimas extracelulares liberados por microorganismos. Por lo tanto, la medición de la actividad de estas enzimas extracelulares puede dar una visión de los tipos de procesos a nivel de ecosistema, como la descomposición de la materia orgánica o mineralización del nitrógeno y el fósforo. Los ensayos de actividad de la enzima extracelular en muestras ambientales normalmente implican la exposición de las muestras a sustratos colorimétricos o fluorométricos artificiales y el seguimiento de la tasa de hidrólisis del sustrato. Aquí se describen los métodos de microplacas basado para estos procedimientos que permiten el análisis de un gran número de muestras dentro de un corto período de tiempo. Las muestras se dejan reaccionar con sustratos artificiales dentro de microplacas de 96 pocillos o de pozo profundo bloques de la microplaca, y la actividad enzimática se determina posteriormente por absorción o fluorescencia del producto final resultante usando un Reade típica de microplacasr o fluorómetro. Tales procedimientos de alto rendimiento no sólo facilitan las comparaciones entre sitios espacialmente separados o ecosistemas, sino que también reducen sustancialmente el coste de dichos ensayos, reduciendo los volúmenes totales de reactivos necesarios por muestra.

Los suelos y sedimentos acuáticos suelen tener niveles apreciables de actividad enzimática extracelular como resultado de las comunidades microbianas adjuntos (biofilms) que crecen en la superficie de las partículas. Figura 3 muestra cómo esta actividad cambia en función del tamaño de las partículas obtenidas del sedimento superficial de un tercer corriente de orden en el norte de Mississippi, EE.UU.. Un estudio previo ha demostrado que las comunidades bacterianas en las partículas de sedimento ...

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Procedimientos basado en una microplaca se describen para el análisis colorimétrico o fluorométrico de la actividad enzimática extracelular. Estos procedimientos permiten el rápido ensayo de tal actividad en un gran número de muestras del medio ambiente dentro de un marco de tiempo manejable.

Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

JoVE Journal

Environment

38.4K vistas.  The University of Mississippi.  Procedimientos basado en una microplaca se describen para el análisis colorimétrico o fluorométrico de la actividad enzimática extracelular. Estos procedimientos permiten el rápido ensayo de tal actividad en un gran número de muestras del medio ambiente dentro de un marco de tiempo manejable. 

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High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

De Alto Rendimiento Fluorometric Medición de Potencial del Suelo extracelulares enzimáticos Actividades

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Investigación

Medio ambiente

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

Medición de Flujo de Gas de efecto invernadero procedentes de los suelos agrícolas Usando cámaras estáticas

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate reduction is used in industrial wastewater treatment to remove large concentrations of sulfate along with the chemical oxygen demand (COD) and heavy metals. The most common approach to the process is with anaerobic bioreactors in which sulfidogenic sludge is obtained through adaptation of predominantly methanogenic granular sludge to sulfidogenesis. This process may take a long time and does not always eliminate the competition for substrate due to the presence of methanogens in the sludge. In this work, we propose a novel approach to obtain sulfidogenic sludge in which hydrothermal vents sediments are the original source of microorganisms. The microbial community developed in the presence of sulfate and volatile fatty acids is wide enough to sustain sulfate reduction over a long period of time without exhibiting inhibition due to sulfide. 
This protocol describes the procedure to generate the sludge from the sediments in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) type of reactor. Furthermore, the protocol presents the procedure to demonstrate the capability of the sludge to remove by reductive dechlorination a model of a highly toxic organic pollutant such as trichloroethylene (TCE). The protocol is divided in three stages: (1) the formation of the sludge and the determination of its sulfate reducing activity in the UASB, (2) the experiment to remove the TCE by the sludge, and (3) the identification of microorganisms in the sludge after the TCE reduction. Although in this case the sediments were taken from a site located in Mexico, the generation of a sulfidogenic sludge by using this procedure may work if a different source of sediments is taken since marine sediments are a natural pool of microorganisms that may be enriched in sulfate reducing bacteria.

Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

Desarrollo de sulfidogénicos lodos de sedimentos marinos y tricloroetileno Reducción en un reactor anaerobio de flujo ascendente Manta lodos

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Sediment Core Sectioning and Extraction of Pore Waters under Anoxic Conditions

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is built and can be transported to a temporary work space close to field sampling site(s) to facilitate rapid analysis. Cores are extruded into a portable glove bag, where they are sectioned and each 1-3 cm thick section (depending on core diameter) is sealed into 50 ml centrifuge tubes. Pore waters are separated with centrifugation outside of the glove bag and then returned to the glove bag for separation from the sediment. These extracted pore water samples can be analyzed immediately. Immediate analyses of redox sensitive species, such as sulfide, iron speciation, and arsenic speciation indicate that oxidation of pore waters is minimal; some samples show approximately 100% of the reduced species, e.g. 100% Fe(II) with no detectable Fe(III). Both sediment and pore water samples can be preserved to maintain chemical species for further analysis upon return to the laboratory.

A protocol for sectioning sediment cores and extracting pore waters under anoxic conditions in order to permit analysis of redox sensitive species in both solids and fluids is presented.

Sedimentos Core y Secciones Extracción de Pore aguas bajo condiciones anóxicas

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

Limpia Muestreo y Análisis de río y estuarios, aguas de trazas metálicas Estudios

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

Un ensayo de flexión para determinar el límite de Atterberg plástico en Suelos

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extracción y análisis de ácidos grasos de fosfolípidos microbiana en suelos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

Los métodos de remuestreo del suelo para controlar los cambios en las concentraciones químicas de los suelos forestales

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and organiclastic sulfate reduction (OSR) in marine sediments. However, unravelling the complex pyritization sequence is a challenge because of the coexistence of different sequentially formed pyrite phases. This manuscript describes a sample preparation procedure that enables the use of secondary ion mass spectroscopy (SIMS) to obtain in situ &#948;34S values of various pyrite generations. This allows researchers to constrain how SO4-AOM affects pyritization in methane-bearing sediments. SIMS analysis revealed an extreme range in &#948;34S values, spanning from -41.6 to +114.8&#8240;, which is much wider than the range of &#948;34S values obtained by the traditional bulk sulfur isotope analysis of the same samples. Pyrite in the shallow sediment mainly consists of 34S-depleted framboids, suggesting early diagenetic formation by OSR. Deeper in the sediment, more pyrite occurs as overgrowths and euhedral crystals, which display much higher SIMS &#948;34S values than the framboids. Such 34S-enriched pyrite is related to enhanced SO4-AOM at the sulfate-methane transition zone, postdating OSR. High-resolution in situ SIMS sulfur isotope analyses allow for the reconstruction of the pyritization processes, which cannot be resolved by bulk sulfur isotope analysis.

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Analyses of the sulfur isotopic composition (&#948;34S) of pyrite from methane-bearing sediments have typically focused on bulk samples. Here, we applied secondary ion mass spectroscopy to analyze the &#948;34S values of various pyrite generations to understand the diagenetic history of pyritization.