Die Finanzierung für Aspekte dieser Arbeit wurde von verschiedenen Quellen, einschließlich des United States Department of Agriculture Spezifische Kooperationsvertrag 58-6408-1-595 und der National Science Foundation (preis 1049911) zur Verfügung gestellt.

Farbmetrische Analyse der extrazellulären Enzymaktivität in Böden und Sedimenten 1. Vorbereitung der Substrat-und Pufferlösungen für farbmetrische Analysen der Enzymaktivität <ol><li> Vorbereitung 50 mM Acetat-Puffer (pH 5,0-5,5), die durch Mischen von 50 ml 0,1 M Essigsäure (2,87 ml Eisessig in 500 ml Wasser), 150 ml 0,1 M Natriumacetat und 200 ml destilliertem H 2 O. PH-Wert auf 5,0-5,5 mit 0,1 M Essigsäure, falls erforderlich. </li><li> Es wird eine Lösung von 1 M Natriumhydroxid (NaOH) in destilliertem H 2 O. </li><li> Vorbereitung p NP-verknüpften Substratlösungen in 50 mM Acetat-Puffer. Um zu testen Phosphatase vorzubereiten 5 mM p NP-Phosphat in 50 mM Acetat-Puffer, dem Test β-Glucosidase vorzubereiten 5 mM p NP-β-glucopyranosid, dem Test vorzubereiten NAGase 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Bereiten Sie alle Substratlösungen in sterilen 15 ml oder 50 ml Zentrifugenröhrchen. Lösungen bei 4 ° C für 2-3 Wochen gelagert werden. </li></ol> 2. Bestimmung der Absorption zu einem Standard zu p NP Konzentration konvertieren <ol><li> Standardlösungen von p-Nitrophenol in 50 mM Acetat-Puffer. Konzentrationen von 0,025 bis 1 mM sollte reichen. </li><li> Über drei Wiederholungen von 100 ul jeder Konzentration zu einer klaren 96-Well-Mikroplatten. In 10 ul 1 M NaOH und 190 ul destilliertem H 2 O in jede Vertiefung. </li><li> Rekord Absorption bei 410 nm mit einem Mikroplatten-Reader. </li><li> Multiply-Konzentrationen in der Standardkurve von 0,3 bis umol p NP pro 300 ul Reaktionsvolumen zu erhalten. Zeichnen Sie eine Kurve der Absorption gegen umol p NP. Die Steigung der Kurve dient als Umrechnungsfaktor (C), die Absorption beziehen wird von p NP in jedem Enzymreaktion umol. </li></ol> 3. Die Durchführung der Enzym-Assay <ol><li> Boden, bereiten eine Aufschlämmung von jeder Probe in einem sterilen 15 ml-Zentrifugenröhrchen auf einer Konzentr untersucht werdenation von etwa 1 g / ml -1 unter Verwendung von 50 mM Acetatpuffer. Für Sedimente, fügen Sie genug Acetatpuffer der Schlamm leicht pipettierbaren zu machen. Das genaue Volumen der Aufschlämmung benötigt wird, gemäß der Anzahl von Enzymen getestet variieren, aber ein Minimum von 5 ml empfohlen. Vortex jeder Brei, bis alle Klumpen von Boden oder Sediment aufgelöst haben und beachten Sie die endgültige Volumen. </li><li> Wiederwirbel jeder Aufschlämmung pipettiert und sofort 150 &amp;mgr; l in jede von sechs Vertiefungen auf einer 96-well Deepwell-Block (1). Es ist wichtig, Vortex gründlich und häufig, um Schmutzpartikel in der Schwebe zu halten. Lassen Sie mindestens zwei Vertiefungen pro Block leer als Substrat Kontrolle dienen. Hinweis: Clip das Ende von Pipettenspitzen mit einer Schere vor dem Pipettieren als Boden Schlämme neigen, um Tipps zu verstopfen. Vorbereitung einer 96-Well-Block für jedes Enzym untersucht werden. </li><li> Pour etwa 5 ml Acetatpuffer in einer Pipettenreservoir und einen 8-Kanal-Pipette 150 ul des Puffers auf den L hinzufügenast zwei Vertiefungen jeder Probe (diese wird Probenpuffer steuert) und die beiden Substrat-Kontrollvertiefungen (Fig. 1) </li><li> Pour etwa 10 ml des geeigneten p NP-Substratlösung in eine Pipettenreservoir und einen 8-Kanal-Pipette 150 ul der Substratlösung zu den ersten vier Vertiefungen für jede Probe und den beiden Substratkontrollvertiefungen hinzu (Abbildung 1). Die verstrichene Zeit, wenn die Reaktion beginnt, wenn die Substratlösung zugegeben. </li><li> Platten bei RT (22 ° C) für 0,5-4 Stunden. Genaue Inkubationszeit variiert je nach Aktivität in den Proben und dem Enzym, die untersucht werden soll, variieren. Für die meisten Böden und Sedimenten, Phosphatase und β-Glucosidase Inkubationszeiten von 0,5-1,5 h, während NAGase und andere Enzyme benötigen Inkubationszeiten von&gt; 2 Stunden. </li><li> Während Tests sind Inkubation vorbereiten klare 96-Well-Mikroplatten, um die Absorption zu lesen. Bereiten Sie eine Mikroplatte für jeden Deepwell-Block (dh für jede Enzyme getestet). Je 10 ul 1 M NaOH und 190 ul destilliertem Wasser in jedes Well der Mikrotiterplatte. Hinweis: NaOH verlangsamt die enzymatische Reaktion und erhöht den pH-Wert, der die Farbe des p NP während der Reaktion frei verbessert. </li><li> Nach der Inkubation zentrifugiert, die 96-Well-Blocks bei 2000-5000 × g für 5 min pelletiert Bodenteilchen. </li><li> Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette zu 100 ul von jedem gut zurückziehen, wobei darauf geachtet, um das Pellet zu vermeiden, und übertragen sie an die entsprechende gut vorbereitet klare 96-Well-Mikroplatten. </li><li> Schalten Sie den Mikroplatten-Reader und die Einsetzung von Software notwendig. Rekord Absorption bei 410 nm auf. Wenn die Absorption einer bestimmten auch über dem linearen Nachweisgrenze des Plattenlesegerät, verdünnen, dass auch 1:1 mit Wasser und Re-Maßnahme. Wenn die Absorption noch zu hoch ist, sollte der Test mit einer kürzeren Inkubationszeit wiederholt werden. </li></ol> 4. Bestimmung der Trockenmasse der Proben <ol><li> Je 1 ml jeder sampl<html> E Aufschlämmung in eine vorher gewogene Aluminiumschale. </li><li> Trocken in einem 75 ° C Trockenschrank für 48 Stunden und wiegen. Subtrahieren Sie das Gewicht der Pfanne von diesem Wert um die Trockenmasse an Boden oder Sediment in 1 ml der Suspension zu erhalten. Multiplizieren mit einem Faktor von 0,15, die Trockenmasse der Probe in 150 ul zu jedem im Enzymtest zugesetzt gut bestimmen. </li></ol> 5. Berechnung der Enzymaktivität pro Trockenmasse Boden oder Sediment <ol><li> Berechnen endgültige Extinktion jeder Probe durch Subtraktion des Proben-Kontrolle Extinktion der Probe Assay Absorption. Wenn Substrat Kontrollen haben eine hohe Absorption (ca.&gt; 0.060) subtrahiert dann die auch. </li><li> Berechnen Enzymaktivität in umol h -1 g -1 Trockenmasse aus der Gleichung: </li></ol> Die Enzymaktivität = Schluss Absorption / (C x Inkubationszeit x Probentrockenmasse) Leuchtstoff-Analyse der extrazellulären Enzymaktivität in natürlichen Gewässern tle &quot;&gt; 1. Herstellung des Substrats, Standard und Pufferlösungen für Fluorometric Analysen der Enzymaktivität <ol><li> Planen 200 uM Lösungen der MUB-verknüpften Substraten (z. B. 4-MUB-β-glucopyranosid, 4-MUB-phosphat, 4-MUB-N-Acetyl-β-D-glucosaminid) durch Auflösen des geeigneten Substrats in sterile (autoklaviert) destilliert H 2 O in 15 ml sterile oder 50 ml Zentrifugenröhrchen. Wickeln Sie Rohre in Aluminiumfolie, um Licht auszuschließen und lagern im Kühlschrank vor der Verwendung. Grund sollte stabil sein, für mindestens 1 Woche, wenn auf diese Weise gespeichert. </li><li> Bereiten Sie eine MUB Standard, indem sie eine Stammlösung von 100 uM 4-Methylumbelliferon in sterilem destilliertem H 2 O. Kühl lagern, in Bernstein oder Folie umwickelt Flasche. Unmittelbar vor der Verwendung, verdünnen das 100 uM Stammlösung von 1/10 in sterilem H 2 O, um eine Arbeitslösung von 10 uM für Enzymtests zu machen. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 mM Bicarbonat-Puffer durch Auflösen von 8,4 g NaHCO &lt;sub&gt; 3 in 1 LH 2 O und Autoklavieren. Verdünnen dieser Stammlösung 1/20 in sterilem H 2 O als erforderlich, um eine Arbeitslösung von 5 mM für Enzymtests zu machen. </li></ol> 2. Organisieren von Wasserproben auf einer 96-Well Mikroplatten-Schwarz <ol><li> Organisation einer Mikrotiterplatte für jedes Enzym nach dem in 2 gezeigten Beispiel. Beachten Sie, dass damit eine ausreichende Replikation, Standards und Kontrollen, kann dieses Verfahren die Aktivität eines einzelnen Enzyms bis zu neun Wasserproben auf einer 96-Well-Mikroplatte schwarz testen. </li><li> Pour etwa 5 ml der ersten Probe in einer Pipettenreservoir und einen 8-Kanal-Pipette auf ul in alle Vertiefungen in Spalte 1 der Mikrotiterplatte (n) pipette200. Entsorgen Sie gebrauchte Pipettenspitzen und wiederholen Sie so für jede Probe benötigt, um Spalten 1-9 zu füllen. </li></ol> 3. Einrichten Probe, Standard, Quench und Substrat Kontrollen <ol><li> Stellen Sie die Kontrollen, für Proben, Standardkontos, Substrat und Abschrecken auf der gleichen schwarzen Mikroplatte wie die Proben (Abb. 2). </li><li> Probenkontrollen enthalten Beispiel Wasser und Bikarbonat-Puffer und werden nicht in den Tätigkeits Berechnungen verwendet, aber wird zeigen, Lesen Konsistenz im gesamten Verlauf des Experiments. Die Quench-Kontrollen bestehen aus Wasser und einer Probe Standardmenge des Fluoreszenzmarkierung und werden verwendet, um die Beugung der Fluoreszenz-in-Wasser-Probe zu messen. Substrat-und Standard-Steuerelemente werden entweder aus Substrat-gebundenen oder die Standard-Fluoreszenzmarkierung sind, und Bicarbonat-Puffer hergestellt. </li><li> Gießen Sie ca. 5 ml 5 mM Bicarbonat-Puffer in eine saubere Pipettenreservoir. Je 50 ul Puffer in Mikrotitervertiefungen 1 bis 9 in Zeilen D und E, um zwei replizieren Vertiefungen der Probenkontrollen pro Probe. Pipettenspitzen wechseln übertragen dann 200 ul von Bikarbonat-Puffer in Vertiefungen 10 bis 12 in den Reihen A und H. </li><li> Reduzieren Umgebungslicht durch Dimmen oder Ausschalten lights als Fluoreszenzstandard ist lichtempfindlich. </li><li> Gießen Sie ca. 5 ml 10 uM 4-Methylumbelliferon in eine saubere Pipettenreservoir. Je 50 ul in Mikrotitervertiefungen 1 bis 12 in Reihe H, und in die Vertiefungen 1 bis 9 in Zeilen G und F bis drei Wiederholungen der Quench-Kontrollen pro Probe und insgesamt Standardkontrollen bilden. Entweder legen Sie die Mikrotiterplatte in der Dunkelheit oder Abdeckung mit einem undurchsichtigen Deckel, Licht Abbau von MUB reduzieren. </li><li> Schalten Sie das Fluorometer und Set-up notwendige Software bereit, vor der Zugabe des Substrats zu lesen sein. Hinweis: Einige Fluorometer Glühbirnen kann eine Aufwärmzeit von 3 Minuten oder mehr benötigen. </li><li> Gießen ca. 5 ml der entsprechenden MUB vernetzt Substrat (z. B. 4-MUB-phosphat) in eine saubere Pipettenreservoir. Verwenden Sie ein 12-Kanal-Pipette auf 50 ul in Mikrotitervertiefungen 1 bis 9 in Zeilen B und C pipettieren 1 bis 12 in Reihe A, und in die Vertiefungen zu drei Wiederholungstests für jede Probe und drei Substrat Kontrollen bilden. SOFORTy fahren Sie mit 4.1, Aufnahme Fluoreszenz Schritt. </li></ol> 4. Aufnahme Fluoreszenz <ol><li> Lesen Sie die Anfangsfluoreszenz unmittelbar nach Substrat Neben der Mikro. Nach der Lektüre Fluoreszenz, inkubieren Sie die Platte bei RT (22 ° C) entweder in der Dunkelheit oder mit einem undurchsichtigen Deckel, Licht Abbau von MUB reduzieren bedeckt. </li><li> Die Inkubationszeit, um den maximal möglichen Enzymaktivität in einer Probe zu messen muss, hängt von der Enzymkonzentration in der Probe abhängt. Da dies bekannt ist, bevor der Test abgeschlossen ist, wird die Mikroplatte müssen an mehreren Zeitschritten gelesen werden. Typischerweise liest in Intervallen von 10-15 Minuten über den Verlauf von 1 Stunde ist für viele Enzyme akzeptabel, obwohl Proben mit sehr hoher Aktivität bestimmter Enzyme können vor 10 min Peak. </li><li> Lesen Fluoreszenz in der Mikroplatte an Ihrer gekennzeichneten Abständen für mindestens 1 h weiter. Achten Sie darauf, halten die Mikroplatte abgedeckt oder in der Dunkelheit zwischen Lesens. </li></ol> 5. Berechnung der Enzymaktivität pro Volumen Wasser <ol><li> Für jede Probe in jedem Zeitintervall berechnen: meine erste Probenfluoreszenz (Brunnen D und E), die mittlere endgültige Probe Fluoreszenz (Brunnen AC), die mittlere Standard Fluoreszenz (Brunnen H10-11), und die mittlere Steuer löschen Fluoreszenz (Brunnen FG). </li><li> Für jedes Zeitintervall berechnet Enzymaktivität in nmol h -1 ml -1 aus der Gleichung: </li></ol> Die Enzymaktivität = (mittlere Probenfluoreszenz - meine erste Probenfluoreszenz) / ((mittlere Standard Fluoreszenz / 0,5 mol) x (Mittelwert stillen Steuer Fluoreszenz / mittlere Standard Fluoreszenz) x (0,2 ml) x (Zeit in Stunden)) <ol start="3"><li> Prüft die Aktivitätswerte für jeden Zeitschritt berechnet. Bestimmen Endpotential Aktivität aus der Zeitstufe mit der höchsten Aktivität. Wenn Aktivitätswerte weiter zunehmen, dann kann später Schritte erforderlich; wenn Aktivitätswerte throug fallenhout der Verlauf der Flucht, dann wieder laufen mit kürzeren Zeitschritten. Schluss Aktivität in nmol Substrat verbraucht h -1 ml -1 kann aber bis skaliert werden, um auszudrücken, wie umol h -1 L -1. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die Bestimmung der Aktivität einer Vielzahl von mikrobiellen extrazelluläre Enzyme in Böden und Sedimenten können nützliche Einblicke in Raten von Nährstoffmineralisierung und organische Stoffe Verarbeitung 17 vorzusehen. Allerdings können Böden in ihren Feuchtigkeitsgehalt variieren, so ist es wichtig, den Boden Trockengewicht standardisieren Aktivität. Dies erfordert einen zusätzlichen Trocknungsschritt (typischerweise von zwei Tagen), über die einfache Messung der Enzymaktivität. Somit im Gegen...

Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen zu erhalten Nährstoffe und Kohlenstoff von komplexen organischen Verbindungen, durch die Produktion von extrazellulären Enzymen. Diese Enzyme hydrolysieren typischerweise Polymere in kleinere Untereinheiten, die in die Zelle aufgenommen werden können. Daher wird bei einer ökologischen Ebene sind diese mikrobiellen extrazelluläre Enzyme, die für einen Großteil der Nährstoffmineralisierung und den Abbau organischer Materie, die in natürlichen Umgebungen auftritt verantwortlich. Enzyme wie Cellobiohydrolase (CBH) und β-Glucosidase sind für Celluloseabbau und arbeiten gemeinsam, um die Hydrolyse von Cellulose zu Glucose 1,2, das eine verwertbare Kohlenstoffsubstrat zur Aufnahme und mikrobielle Assimilierung bietet katalysieren. Das Enzym Phosphatase Mitteilungen löslichen anorganischen Phosphatgruppen von Organophosphaten wesentlichen Mineralisierung Phosphat und macht es für die Verwendung durch die meisten Organismen 3 verfügbar. Andere Enzyme, wie N-Acetylglucosaminidase (NAGase), sind important in Chitin-Abbau und kann sowohl Kohlenstoff und Stickstoff für die mikrobielle Erwerb 4 verfügbar zu machen. Eines der Verfahren zur Bestimmung von mikrobiellen extrazelluläre Enzymaktivität in natürlichen Umgebungen ist die Verwendung von künstlichen p-Nitrophenyl (p NP) verbunden Substrate, ein Ansatz, der ursprünglich entwickelt wurde, um Boden-5-Phosphatase-Aktivität zu erkennen. Dieser Ansatz beruht auf dem Nachweis einer farbigen Endprodukt, p-Nitrophenol, die freigesetzt wird, wenn das künstliche Substrat durch das geeignete Enzym hydrolysiert. Das p-Nitrophenol kann anschließend kolorimetrisch durch Messung der Absorption bei etwa 400-410 nm quantifiziert werden. Dieses Verfahren ist seit angewandt, um andere Enzyme, wie NAGase 6 zu erfassen, und wurde in verschiedenen Studien verwendet worden betrachten mikrobielle extrazelluläre Enzymaktivität in Böden und Sedimenten 7-9. Ein alternativer Ansatz, die originall wary entwickelt, um extrazelluläre Glucosidase-Aktivität zu beurteilen in Gewässern 10,11 macht Gebrauch von 4-Methylumbelliferon (MUB) verbunden Substraten. Das Endprodukt freigesetzt (4-Methylumbelliferon) ist stark fluoreszierend und können mit einem Fluorometer bei einer Anregungs / Emissionseinstellung um 360/460 nm detektiert werden. Eine Vielzahl von MUB vernetzt künstlichen Substrate zur Verfügung stehen, wodurch die fluorometrische Messung der Aktivität mindestens so viele Enzyme (z. B. β-Glucosidase, Cellobiohydrolase, Nagase Phosphatase) wie mit dem p-Substrat NP kolorimetrischen Verfahren analysiert werden. Andere mikrobielle extrazelluläre Enzyme, wie das Protein abbau Leucin-Aminopeptidase kann fluorometrisch unter Verwendung von 7-Amino-4-methyl (COU) verbunden Substrate getestet werden. Sowohl MUB-und COU-verknüpften Substraten wurden verwendet, um die Enzymaktivität in verschiedenen terrestrischen und aquatischen 12,13 Proben zu bestimmen. Während frühere Studien haben described fluorometrischer oder farbmetrischen Mikro Ansätze zur extrazellulären Enzymaktivität 14 zu bestimmen, es gibt eine Notwendigkeit für eine klare Darstellung, wie solche Tests durchzuführen. Hier zeigen wir, Verfahren für eine Hochdurchsatz-Mikrotechniken für die Analyse von extrazellulären Enzymaktivität in Böden und Sedimenten unter Verwendung des kolorimetrischen p-NP verbunden Substrate Ansatz und in natürlichen Gewässern mit Hilfe der Fluoreszenz MUB-verknüpfte Substrate Technik. Wir konzentrieren uns auf die Messung der Aktivitäten der β-Glucosidase, NAGase und Phosphatase als diese Enzyme an Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor und Radfahren gebunden sind. Jedoch können die hier beschriebenen Verfahren auf die Messung anderer extrazellulärer Enzyme mit verschiedenen künstlichen Substrate aufgebracht werden.

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		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS AND MATERIALS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP612-1</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3234</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7006</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9376</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Clear 96-well microplates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-563-301</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96-well deep well blocks</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3958</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Aluminum weigh pans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 15 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8883</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3633</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2133</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96-well microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3792</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-81</td>
			<td>For microplates/deep-well blocks</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate fluorometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>FLx 800</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>8-channel pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of microbial extracellular enzyme activity in waters, soils, and sediments using high throughput microplate assays

Ein Großteil der Nährstoffkreislauf-und Kohlenstoffverarbeitung in natürlichen Umgebungen erfolgt durch die Aktivität extrazellulärer Enzyme, die von Mikroorganismen freigesetzt. So kann die Messung der Aktivität der extrazellulären Enzyme Einblicke in den Sätzen der Ökosystemebene Prozesse, wie den Abbau organischer Materie oder Stickstoff-und Phosphor-Mineralisierung geben. Assays der extrazellulären Enzymaktivität in Umweltproben beinhalten typischerweise das Aussetzen der Proben gegenüber künstlicher kolorimetrische oder fluorometrische Verfolgung Substrate und die Geschwindigkeit der Substrathydrolyse. Hier beschreiben wir auf Mikrotiterplatte Methoden für diese Verfahren, die die Analyse einer großen Anzahl von Proben innerhalb eines kurzen Zeitrahmens zu ermöglichen. Die Proben dürfen mit künstlichen Substraten innerhalb von 96-Well-Mikroplatten oder tiefe Well-Mikroblöcke reagieren, und die Enzymaktivität wird anschließend durch Absorption oder Fluoreszenz der resultierende Endprodukt unter Verwendung eines typischen Mikro reade bestimmtr oder Fluorometer. Solche hohen Durchsatzverfahren erleichtern nicht nur Vergleiche zwischen den räumlich getrennten Stellen oder Ökosysteme, sondern auch die Kosten für solche Tests wesentlich zu reduzieren, indem Gesamtreagenzienvolumina pro Probe benötigt.

Böden und Gewässern Sedimente haben typischerweise merkliche Mengen an extrazellulären Enzymaktivität als Folge der beigefügten Mikrobengemeinschaften (Biofilme) wachsen auf der Oberfläche der Teilchen. Fig. 3 zeigt, wie diese Aktivität sich in Abhängigkeit von der Größe der Partikel von der Oberfläche Sediment eines dritten erhaltene Ordnung im nördlichen Mississippi, USA. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die bakteriellen Gemeinschaften auf Sedimentpartikel aus diesem Strom kann in dr...

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Mikroplatten-basierten Verfahren werden für die farbmetrische oder fluorimetrische Analyse der extrazellulären Enzymaktivität beschrieben. Diese Verfahren ermöglichen die Schnelltest an einer solchen Tätigkeit in großer Zahl von Umweltproben in einem überschaubaren Zeitrahmen.

Bestimmung mikrobieller extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser, Böden und Sedimente mit hohem Durchsatz Mikrotiterplatten-Assays

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

JoVE Journal

Environment

38.8K Aufrufe.  The University of Mississippi.  Mikroplatten-basierten Verfahren werden für die farbmetrische oder fluorimetrische Analyse der extrazellulären Enzymaktivität beschrieben. Diese Verfahren ermöglichen die Schnelltest an einer solchen Tätigkeit in großer Zahl von Umweltproben in einem überschaubaren Zeitrahmen. 

Serie: Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

Hochdurchsatz-Fluorometric Messung der Boden Mögliche Extrazelluläre Enzymaktivitäten

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Forschung

Umwelt

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

Messung der Treibhausgas-Flux aus landwirtschaftlichen Böden mit statischer Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate reduction is used in industrial wastewater treatment to remove large concentrations of sulfate along with the chemical oxygen demand (COD) and heavy metals. The most common approach to the process is with anaerobic bioreactors in which sulfidogenic sludge is obtained through adaptation of predominantly methanogenic granular sludge to sulfidogenesis. This process may take a long time and does not always eliminate the competition for substrate due to the presence of methanogens in the sludge. In this work, we propose a novel approach to obtain sulfidogenic sludge in which hydrothermal vents sediments are the original source of microorganisms. The microbial community developed in the presence of sulfate and volatile fatty acids is wide enough to sustain sulfate reduction over a long period of time without exhibiting inhibition due to sulfide. 
This protocol describes the procedure to generate the sludge from the sediments in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) type of reactor. Furthermore, the protocol presents the procedure to demonstrate the capability of the sludge to remove by reductive dechlorination a model of a highly toxic organic pollutant such as trichloroethylene (TCE). The protocol is divided in three stages: (1) the formation of the sludge and the determination of its sulfate reducing activity in the UASB, (2) the experiment to remove the TCE by the sludge, and (3) the identification of microorganisms in the sludge after the TCE reduction. Although in this case the sediments were taken from a site located in Mexico, the generation of a sulfidogenic sludge by using this procedure may work if a different source of sediments is taken since marine sediments are a natural pool of microorganisms that may be enriched in sulfate reducing bacteria.

Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

Entwicklung sulfidogenen Schlamm aus marinen Sedimenten und Trichlorethylen Reduction in einer Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Sediment Core Sectioning and Extraction of Pore Waters under Anoxic Conditions

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is built and can be transported to a temporary work space close to field sampling site(s) to facilitate rapid analysis. Cores are extruded into a portable glove bag, where they are sectioned and each 1-3 cm thick section (depending on core diameter) is sealed into 50 ml centrifuge tubes. Pore waters are separated with centrifugation outside of the glove bag and then returned to the glove bag for separation from the sediment. These extracted pore water samples can be analyzed immediately. Immediate analyses of redox sensitive species, such as sulfide, iron speciation, and arsenic speciation indicate that oxidation of pore waters is minimal; some samples show approximately 100% of the reduced species, e.g. 100% Fe(II) with no detectable Fe(III). Both sediment and pore water samples can be preserved to maintain chemical species for further analysis upon return to the laboratory.

A protocol for sectioning sediment cores and extracting pore waters under anoxic conditions in order to permit analysis of redox sensitive species in both solids and fluids is presented.

Bohrkern Sectioning und Gewinnung von Porenwasser unter anoxischen Bedingungen

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

Saubere Probenahme und Analyse von River und Estuarine Waters für Spurenmetallforschung

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

Ein Biegetest zur Bestimmung der Atterberg Ausrollgrenze in Böden

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and organiclastic sulfate reduction (OSR) in marine sediments. However, unravelling the complex pyritization sequence is a challenge because of the coexistence of different sequentially formed pyrite phases. This manuscript describes a sample preparation procedure that enables the use of secondary ion mass spectroscopy (SIMS) to obtain in situ &#948;34S values of various pyrite generations. This allows researchers to constrain how SO4-AOM affects pyritization in methane-bearing sediments. SIMS analysis revealed an extreme range in &#948;34S values, spanning from -41.6 to +114.8&#8240;, which is much wider than the range of &#948;34S values obtained by the traditional bulk sulfur isotope analysis of the same samples. Pyrite in the shallow sediment mainly consists of 34S-depleted framboids, suggesting early diagenetic formation by OSR. Deeper in the sediment, more pyrite occurs as overgrowths and euhedral crystals, which display much higher SIMS &#948;34S values than the framboids. Such 34S-enriched pyrite is related to enhanced SO4-AOM at the sulfate-methane transition zone, postdating OSR. High-resolution in situ SIMS sulfur isotope analyses allow for the reconstruction of the pyritization processes, which cannot be resolved by bulk sulfur isotope analysis.

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Analyses of the sulfur isotopic composition (&#948;34S) of pyrite from methane-bearing sediments have typically focused on bulk samples. Here, we applied secondary ion mass spectroscopy to analyze the &#948;34S values of various pyrite generations to understand the diagenetic history of pyritization.

Vorbereitung der Authigenic Pyrit aus Methan-Bearing Sedimenten In Situ Schwefel Isotopenanalyse mit SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolierung und Analyse der mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Boden, Rhizosphäre und Wurzeln in mehrjährige Grass Experimente

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the associated accuracy is unknown. Here, we present a detailed protocol for efficient and clustered soil sampling in a research plot and, relying on a pilot sampling using this design, for demonstrating soil spatial heterogeneity and informing reasonable sample sizes and associated accuracy for future study. The protocol mainly comprises four steps: sampling design, field collection, soil analysis, and geostatistical analysis. The step-by-step procedure is modified according to former publications. Two examples will be presented to demonstrate contrasting spatial distributions of soil organic carbon (SOC) and soil microbial biomass carbon (MBC) under different management practices. In addition, we present a strategy to determine the sample size requirement (SSR) given a certain level of accuracy based on the plot-level coefficient of variation (CV). The field sampling protocol and the quantitative determination of the sample size will assist researchers in seeking feasible sampling strategies to meet research needs and resources' availability.

The traditional soil-sampling procedure determines the number of soil samples arbitrarily. Here, we provide a simple yet efficient clustered soil-sampling design to demonstrate soil spatial heterogeneity and quantitatively determine the number of soil samples required and the associated sampling accuracy.