I finanziamenti per gli aspetti di questo lavoro è stato fornito da varie fonti tra cui il Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti specifico Accordo Cooperativo 58-6408-1-595 e la National Science Foundation (premio 1.049.911).

L&#39;analisi colorimetrica di extracellulare Enzyme Activity in terreni e sedimenti 1. Preparazione del substrato e Soluzioni tampone per analisi colorimetriche di Enzyme Activity <ol><li> Preparare H 50 mM tampone acetato (pH 5,0-5,5) mescolando 50 ml di 0,1 M di acido acetico (2,87 ml di acido acetico glaciale in 500 ml di acqua), 150 ml di acetato di sodio 0,1 M, e 200 ml di acqua distillata 2 O. Regolare il pH a 5,0-5,5 con 0.1 M di acido acetico, se necessario. </li><li> Preparare una soluzione di 1 M di idrossido di sodio (NaOH) in H 2 O distillata O. </li><li> Preparare le soluzioni di substrato NP-linked p in 50 mM tampone acetato. Per eseguire il test della fosfatasi preparare 5 mM p NP-fosfato in 50 mM tampone acetato, per saggiare β-glucosidasi preparare 5 mM p NP-β-glucopiranoside, per saggiare NAGase preparare 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Preparare tutte le soluzioni del substrato in sterili da 15 ml o 50 ml provette da centrifuga. Le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C per 2-3 settimane. </li></ol> 2. Determinazione di una standard per convertire assorbanza a p NP Concentrazione <ol><li> Preparare soluzioni standard di p-nitrofenolo in 50 mM tampone acetato. Le concentrazioni dovrebbero spaziare 0,025-1 mm. </li><li> Trasferimento tre repliche di 100 ml di ciascuna concentrazione ad una chiara micropiastra a 96 pozzetti. Aggiungere 10 ml di NaOH 1 M e 190 microlitri distillata H 2 O a ciascun pozzetto. </li><li> Record assorbanza a 410 nm usando un lettore di micropiastre. </li><li> Concentrazioni di moltiplicarsi in curva standard di 0.3 per ottenere μmoles p NP 300 per volume di reazione microlitri. Tracciare una curva di assorbanza vs micromol di p NP. La pendenza della curva serve come fattore di conversione (C) che si riferiranno assorbanza a micromol di p NP in ciascuna reazione enzimatica. </li></ol> 3. Condurre il Enzyme Assay <ol><li> Per il suolo, preparare un impasto di ogni campione da dosare in una sterile provetta da centrifuga da 15 ml a Concentrazionezione di circa 1 g / ml -1 usando 50 mM di tampone acetato. Per i sedimenti, aggiungere tampone acetato sufficiente a rendere l&#39;impasto facilmente pipettable. L&#39;esatto volume di slurry necessaria varierà a seconda del numero di enzimi dosati, ma è consigliato un minimo di 5 ml. Vortex ogni impasto fino a quando tutte zolle di terreno o nel sedimento sono dispersi e notare il volume finale. </li><li> Re-vortice ogni slurry e pipettare immediatamente 150 ml in ciascuna delle sei pozzetti su un blocco 96 pozzetti Deepwell (Figura 1). È importante vortice accuratamente e frequentemente per mantenere in sospensione le particelle del terreno. Lasciare almeno due pozzetti per blocco vuoto per servire come controllo substrato. Nota: ritagliare il fine di punte per pipette con le forbici prima di dispensare come fanghi suolo tendono a intasare punte. Preparare un blocco a 96 pozzetti per ciascun enzima da dosare. </li><li> Versare circa 5 ml di tampone acetato in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per aggiungere 150 ml di buffer alla last due pozzetti di ciascun campione (questi saranno i controlli tampone campione) e le due pozzetti di controllo substrato (Figura 1) </li><li> Versare circa 10 ml della soluzione di NP-substrato p appropriato in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per aggiungere 150 microlitri della soluzione di substrato per i primi quattro pozzetti di ciascun campione e le due pozzetti di controllo substrato (Figura 1). Notare il tempo come la reazione inizia non appena viene aggiunta la soluzione di substrato. </li><li> Incubare le piastre a temperatura ambiente (22 ° C) per 0,5-4 ore. Tempo di incubazione può variare a seconda del livello di attività in campioni e l&#39;enzima da dosare. Per la maggior parte dei terreni e sedimenti, fosfatasi e β-glucosidasi richiedono tempi di incubazione di 0,5-1,5 ore, mentre NAGase e di altri enzimi richiedono tempi di incubazione di&gt; 2 ore. </li><li> Mentre i test sono incubando preparare chiari 96 pozzetti per leggere l&#39;assorbanza. Preparare una micropiastra per ogni blocco Deepwell (vale a dire per ogni enzyme analizzati). Pipettare 10 ml 1 M NaOH e 190 ml di acqua distillata in ciascun pozzetto della micropiastra. Nota: NaOH rallenta la reazione enzimatica e solleva il pH che esalta il colore della NP p rilasciato durante la reazione. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, centrifugare i blocchi da 96 pozzetti a 2,000-5,000 xg per 5 minuti per far sedimentare particelle di terreno. </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale a ritirare 100 microlitri di ogni bene, facendo attenzione ad evitare il pellet, e trasferirlo al corrispondente bene preparata chiaro micropiastra a 96 pozzetti. </li><li> Accendere il lettore per micropiastre e configurare il software necessario. Record assorbanza a 410 nm. Se l&#39;assorbanza di un particolare bene è superiore al limite di rilevazione lineare del lettore di piastre, che ben diluire 1:1 con acqua e ri-misura. Se assorbanza è ancora troppo elevato, il test deve essere ripetuto con un tempo di incubazione più breve. </li></ol> 4. Determinazione della massa a vuoto dei Campioni <ol><li> Pipettare 1 ml di ciascuna sampl<html> e impasto in una teglia di alluminio pre-pesate. </li><li> Secco in un forno di essiccazione a 75 ° C per 48 ore e pesare. Sottrarre il peso della vaschetta da questo valore per ottenere la massa secca di terreno o nel sedimento in 1 ml di slurry. Moltiplicare per un fattore di 0,15 per determinare la massa secca del campione nei 150 microlitri aggiunti a ciascun pozzetto nel saggio enzimatico. </li></ol> 5. Calcolo del Enzyme Activity per lavaggio di massa di terreno o nel sedimento <ol><li> Calcola assorbanza finale di ogni campione sottraendo l&#39;assorbanza di controllo campione dalla assorbanza analisi del campione. Se i controlli substrato hanno un elevato assorbimento (circa&gt; 0.060) quindi sottrarre anche quelli. </li><li> Calcola attività enzimatica in μmoles hr -1 g massa secca -1 dall&#39;equazione: </li></ol> L&#39;attività enzimatica = assorbanza finale / (C x tempo di incubazione x campione secco di massa) Analisi fluorescente di extracellulare Enzyme Activity in acque naturali tle &quot;&gt; 1. Preparazione del substrato, Standard e Soluzioni tampone per le analisi fluorimetrica di Enzyme Activity <ol><li> Preparare 200 pM soluzioni di substrati MUB-collegati (ad esempio 4-MUB-β-glucopiranoside, 4-MUB-fosfato, 4-MUB-N-acetil-β-D-glucosaminide) disciogliendo il substrato adatto in sterile (autoclave) distillata H 2 O in sterili da 15 ml o 50 ml provette da centrifuga. Avvolgere i tubi in alluminio per escludere la luce e conservare in frigorifero prima dell&#39;uso. Substrati devono essere stabili per almeno 1 settimana se conservato in questo modo. </li><li> Preparare uno standard MUB facendo una soluzione stock di 100 micron 4 metilumbelliferone in sterile distillata H 2 O. Conservare in frigorifero in ambra o bottiglia stagnola avvolto. Immediatamente prima dell&#39;uso, diluire la soluzione 100 mM stock di 1/10 in H 2 O sterile per ottenere una soluzione di lavoro di 10 pM per saggi enzimatici. </li><li> Preparare una soluzione stock di 100 mM tampone bicarbonato sciogliendo 8,4 g di NaHCO &lt;sub&gt; 3 in 1 LH 2 O e autoclave. Diluire questa soluzione a 1/20 in H 2 O sterile come necessario per ottenere una soluzione di lavoro di 5 mm per saggi enzimatici. </li></ol> 2. Organizzazione di campioni di acqua su un 96-Well Nero micropiastre <ol><li> Organizzare una micropiastra per ciascun enzima seguendo l&#39;esempio illustrato nella Figura 2. Si noti che consenta replica adeguata, standard e controlli, questa procedura può saggiare l&#39;attività di un singolo enzima fino a nove campioni di acqua su una micropiastra a 96 pozzetti nero. </li><li> Versare circa 5 ml del primo campione in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per pipette200 microlitri in tutti i pozzetti nella colonna 1 della micropiastra (s). Eliminare i puntali delle pipette usate e ripetere se necessario per ogni campione di acqua per riempire le colonne 1-9. </li></ol> 3. Impostazione di Campione, standard, spegnere, e controlli substrato <ol><li> Impostare i controlli per tenere conto di campioni, standards, substrato e tempra sulla stessa micropiastra nero come i campioni (Figura 2). </li><li> Controlli a campione contengono acqua campione e tampone bicarbonato, e non vengono utilizzati nei calcoli di attività, ma dimostreranno la lettura coerenza in tutto il corso dell&#39;esperimento. I controlli quench consistono di acqua campione e una quantità standard del tag fluorescente e sono utilizzati per misurare la diffrazione di fluorescenza in acqua campione. Substrato e controlli standard sono costituiti da tampone o-substrato collegato o l&#39;etichetta fluorescente norma, rispettivamente, e bicarbonato. </li><li> Versare circa 5 ml di 5 mM tampone bicarbonato in un serbatoio pipetta pulita. Pipettare 50 ml di tampone nei pozzetti da 1 a 9 nelle righe D ed E per formare due replicare pozzetti di controlli a campione per campione. Ha Cambia pipette poi trasferire 200 ml di tampone bicarbonato per pozzi da 10 a 12 nelle righe A e H. </li><li> Ridurre l&#39;illuminazione ambiente attenuando o spegnendo lillum na come standard fluorescente è sensibile alla luce. </li><li> Versare circa 5 ml di 10 mM 4-metilumbelliferone in un serbatoio pipetta pulita. Dispensare 50 ml nei pozzetti da 1 a 12 in fila H, e in pozzi da 1 a 9 in righe G e F per formare tre repliche di controlli tempra per campione e controlli generali standard. O mettere la micropiastra al buio o coprire con un coperchio opaco per ridurre il degrado luce del MUB. </li><li> Accendere il fluorimetro e set-up tutti i software necessari per essere pronto a leggere prima di aggiungere il substrato. Nota: alcuni bulbi fluorometro possono richiedere un tempo di warm-up di 3 minuti o più. </li><li> Versare circa 5 ml di substrato appropriato MUB-linked (ad esempio 4-MUB-fosfato) in un serbatoio pipetta pulita. Utilizzare una pipetta a 12 canali per pipettare 50 ml in pozzetti da 1 a 12 nella riga A, e in pozzi da 1 a 9 nelle righe B e C per formare tre test ripetuti per ogni campione e tre controlli substrato. IMMEDIATAMENTEy passare al punto 4.1, fluorescenza registrazione. </li></ol> 4. Fluorescenza di registrazione <ol><li> Leggere la fluorescenza iniziale subito dopo l&#39;aggiunta del substrato alla micropiastra. Dopo la lettura di fluorescenza, incubare la micropiastra a temperatura ambiente (22 ° C) o al buio o coperto con un coperchio opaco per ridurre il degrado luce di MUB. </li><li> Il tempo di incubazione richiesta per misurare il potenziale massima dell&#39;attività enzimatica in un campione di acqua dipenderà dalla concentrazione dell&#39;enzima all&#39;interno del campione. Poiché questo è sconosciuto prima della analisi è stata completata, la micropiastra dovrà essere letto a diversi intervalli di tempo. Tipicamente, lettura a intervalli di 10-15 minuti nel corso di 1 ora è accettabile per molti enzimi, anche se i campioni con attività molto alta per alcuni enzimi possono picco prima 10 min. </li><li> Continua a leggere la fluorescenza nella micropiastra agli intervalli indicati per almeno 1 ora. Essere sicuri di mantenere la micropiastra coperto o al buio tra la letturas. </li></ol> 5. Calcolo del Enzyme Activity per volume di acqua <ol><li> Per ogni campione in ciascun intervallo di tempo calcolare i: significa fluorescenza campione iniziale (pozzetti D ed E), la fluorescenza del campione finale medio (pozzi AC), la fluorescenza media standard (pozzetti H10-11), e la media estinto controllo fluorescenza (pozzi FG). </li><li> Per ogni intervallo di tempo, calcolare l&#39;attività enzimatica in nmoli hr -1 ml -1 dall&#39;equazione: </li></ol> L&#39;attività enzimatica = (media del campione fluorescenza - media di fluorescenza del campione iniziale) / ((media fluorescenza / 0,5 mol) x forfettari (media placare il controllo di fluorescenza / dire fluorescenza) x forfettari (0,2 ml) x (tempo in ore)) <ol start="3"><li> Esaminare i valori di attività calcolati per ogni passo temporale. Determinare l&#39;attività potenziale finale dal passo temporale con la più alta attività. Se i valori delle attività continuano ad aumentare poi successive fasi temporali possono essere richiesti, se i valori di attività rientrano througHout il corso della corsa, quindi eseguire nuovamente con intervalli di tempo più brevi. Attività Finale è in nmoli di substrato consumato hr -1 ml -1, ma può essere scalata fino a esprimere come μmoles hr -1 L -1. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Determinazione delle attività di una varietà di enzimi extracellulari microbiche in suoli e sedimenti può fornire indicazioni utili in tassi di mineralizzazione dei nutrienti e trasformazione di materia organica 17. Tuttavia, i suoli possono variare nei loro livelli di umidità, quindi è importante standardizzare l&#39;attività di suolo peso secco. Ciò richiede una fase di asciugatura addizionale (tipicamente di due giorni) oltre la semplice misurazione dell&#39;attività enzimatica. Pertanto, a differe...

Microrganismi come batteri e funghi ottengono nutrienti e il carbonio di composti organici complessi attraverso la produzione di enzimi extracellulari. Questi enzimi idrolizzano tipicamente polimeri in subunità più piccole che possono essere presi in cella. Pertanto, a livello ecologico, questi enzimi extracellulari microbici sono responsabili di gran parte della mineralizzazione dei nutrienti e la decomposizione della materia organica che si verifica in ambienti naturali. Enzimi come cellobioidrolasi (CBH) e β-glucosidasi sono importanti per la degradazione della cellulosa e lavorare all&#39;unisono per catalizzare l&#39;idrolisi di cellulosa in glucosio 1,2, che fornisce un substrato di carbonio utilizzabile per l&#39;assorbimento e l&#39;assimilazione microbica. L&#39;enzima fosfatasi rilascia gruppi fosfati inorganici solubili da organofosfati, essenzialmente mineralizzanti fosfato e renderlo disponibile per l&#39;uso da maggior parte degli organismi 3. Altri enzimi, come N-acetilglucosaminidasi (NAGase), sono important in degrado chitina e può fare sia il carbonio e l&#39;azoto disponibile per acquisizione microbica 4. Una delle procedure per il saggio di attività enzimatica extracellulare microbica in ambienti naturali è l&#39;uso di p-nitrofenil artificiale (p NP) substrati collegati, un approccio che è stato originariamente sviluppato per rilevare l&#39;attività della fosfatasi terreno 5. Questo approccio si basa sul rilevamento di un prodotto finale colorato, p-nitrofenolo, che viene rilasciato quando il substrato artificiale viene idrolizzato dall&#39;enzima appropriato. Il p-nitrofenolo può essere successivamente quantificato colorimetro misurando la sua assorbanza a circa 400-410 nm. Questo metodo è stato poi applicato a rilevare altri enzimi come NAGase 6, ed è stato utilizzato in vari studi guardando microbica attività enzimatica extracellulare in terreni e sedimenti 7-9. Un approccio alternativo che era originally sviluppato per valutare l&#39;attività glucosidasi extracellulare in ambienti acquatici 10,11 fa uso di 4-metilumbelliferone (MUB) substrati collegati. Il prodotto finale rilasciato (4-metilumbelliferone) è altamente fluorescente e può essere rilevato utilizzando un fluorimetro con un&#39;impostazione eccitazione / emissione intorno a 360/460 nm. Una varietà di substrati artificiali MUB-legati sono disponibili, permettendo la misurazione fluorimetrica dell&#39;attività di almeno tanti enzimi (ad esempio β-glucosidasi, cellobioidrolasi, Nagase, fosfatasi) come può essere dosati utilizzando la procedura colorimetrica p NP-substrato. Altri enzimi extracellulari microbici, quali la leucina aminopeptidasi proteina-degradanti, possono essere dosati fluorometrically usando 7-ammino-4-metil (COU) substrati collegati. Sia MUB-e substrati COU-legati sono stati utilizzati per determinare l&#39;attività enzimatica in vari campioni terrestri e acquatici 12,13. Mentre gli studi precedenti hanno described micropiastra fluorometrico o colorimetrico approcci per determinare l&#39;attività enzimatica extracellulare 14, c&#39;è la necessità di una chiara presentazione di come condurre tali analisi. Qui mostriamo le procedure per lo svolgimento di tecniche ad alta velocità micropiastra per l&#39;analisi dell&#39;attività enzimatica extracellulare in suoli e sedimenti che utilizzano l&#39;approccio substrati NP-linked p colorimetrica e nelle acque naturali, utilizzando la tecnica di fluorescenza substrati MUB-linked. Ci concentriamo sulla misurazione delle attività di β-glucosidasi, NAGase, e fosfatasi come questi enzimi possono essere legati al carbonio, azoto, fosforo e ciclismo, rispettivamente. Tuttavia, le procedure qui descritte possono essere applicate alla misurazione di altri enzimi extracellulari usando differenti substrati artificiali.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS AND MATERIALS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP612-1</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3234</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7006</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9376</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Clear 96-well microplates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-563-301</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96-well deep well blocks</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3958</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Aluminum weigh pans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 15 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8883</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3633</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2133</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96-well microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3792</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-81</td>
			<td>For microplates/deep-well blocks</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate fluorometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>FLx 800</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>8-channel pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of microbial extracellular enzyme activity in waters, soils, and sediments using high throughput microplate assays

Gran parte del ciclo dei nutrienti e lavorazione del carbonio in ambienti naturali avviene attraverso l&#39;attività degli enzimi extracellulari rilasciati da microrganismi. Così, misurazione dell&#39;attività di questi enzimi extracellulari può dare intuizioni aliquote di processi livello dell&#39;ecosistema, quali la decomposizione della materia organica o azoto e fosforo mineralizzazione. I saggi di attività enzimatica extracellulare nei campioni ambientali tipicamente coinvolgono esponendo i campioni a substrati colorimetrici o fluorimetrici artificiali e il monitoraggio del tasso di idrolisi del substrato. Qui si descrivono i metodi su micropiastra per queste procedure che consentano l&#39;analisi di un gran numero di campioni in un breve lasso di tempo. I campioni vengono lasciati reagire con substrati artificiali entro 96 pozzetti o pozzo profondo blocchi micropiastre, e l&#39;attività enzimatica viene successivamente determinati mediante assorbimento o fluorescenza del prodotto finale risultante utilizzando un tipico Reade micropiastrar o fluorimetro. Tali procedure ad alto rendimento facilitare non solo i confronti tra siti o ecosistemi spazialmente separati, ma anche di ridurre sostanzialmente il costo di tali dosaggi, riducendo i volumi complessivi dei reagenti necessari per campione.

Suoli e sedimenti acquatici in genere hanno apprezzabili livelli di attività enzimatica extracellulare come risultato di comunità microbiche allegate (biofilm) cresce sulla superficie delle particelle. Figura 3 mostra come questa attività cambia a seconda delle dimensioni delle particelle ottenute dal sedimento superficie di un terzo Flusso ordine nel nord del Mississippi, USA. Un precedente studio ha dimostrato che le comunità batteriche sulle particelle di sedimenti da questo flusso possono essere...

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Procedure su micropiastra sono descritte per l&#39;analisi colorimetrica o fluorimetrica dell&#39;attività enzimatica extracellulare. Tali procedure consentono la rapida saggio di tale attività in un gran numero di campioni ambientali in tempi gestibile.

Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

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Environment

38.8K Views.  The University of Mississippi.  Procedure su micropiastra sono descritte per l'analisi colorimetrica o fluorimetrica dell'attività enzimatica extracellulare. Tali procedure consentono la rapida saggio di tale attività in un gran numero di campioni ambientali in tempi gestibile. 

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High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

High-throughput fluorometrica misura del potenziale di suolo extracellulari enzimi Attività

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Ricerca

Ambiente

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

Misura del flusso di gas serra da terreni agricoli Uso statici Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate reduction is used in industrial wastewater treatment to remove large concentrations of sulfate along with the chemical oxygen demand (COD) and heavy metals. The most common approach to the process is with anaerobic bioreactors in which sulfidogenic sludge is obtained through adaptation of predominantly methanogenic granular sludge to sulfidogenesis. This process may take a long time and does not always eliminate the competition for substrate due to the presence of methanogens in the sludge. In this work, we propose a novel approach to obtain sulfidogenic sludge in which hydrothermal vents sediments are the original source of microorganisms. The microbial community developed in the presence of sulfate and volatile fatty acids is wide enough to sustain sulfate reduction over a long period of time without exhibiting inhibition due to sulfide. 
This protocol describes the procedure to generate the sludge from the sediments in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) type of reactor. Furthermore, the protocol presents the procedure to demonstrate the capability of the sludge to remove by reductive dechlorination a model of a highly toxic organic pollutant such as trichloroethylene (TCE). The protocol is divided in three stages: (1) the formation of the sludge and the determination of its sulfate reducing activity in the UASB, (2) the experiment to remove the TCE by the sludge, and (3) the identification of microorganisms in the sludge after the TCE reduction. Although in this case the sediments were taken from a site located in Mexico, the generation of a sulfidogenic sludge by using this procedure may work if a different source of sediments is taken since marine sediments are a natural pool of microorganisms that may be enriched in sulfate reducing bacteria.

Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

Sviluppo di Sulfidogenic fanghi da Marine Sedimenti e Tricloroetilene Riduzione in una coperta reattore Upflow anaerobica dei fanghi

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Sediment Core Sectioning and Extraction of Pore Waters under Anoxic Conditions

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is built and can be transported to a temporary work space close to field sampling site(s) to facilitate rapid analysis. Cores are extruded into a portable glove bag, where they are sectioned and each 1-3 cm thick section (depending on core diameter) is sealed into 50 ml centrifuge tubes. Pore waters are separated with centrifugation outside of the glove bag and then returned to the glove bag for separation from the sediment. These extracted pore water samples can be analyzed immediately. Immediate analyses of redox sensitive species, such as sulfide, iron speciation, and arsenic speciation indicate that oxidation of pore waters is minimal; some samples show approximately 100% of the reduced species, e.g. 100% Fe(II) with no detectable Fe(III). Both sediment and pore water samples can be preserved to maintain chemical species for further analysis upon return to the laboratory.

A protocol for sectioning sediment cores and extracting pore waters under anoxic conditions in order to permit analysis of redox sensitive species in both solids and fluids is presented.

Sedimenti Nucleo sezionamento ed estrazione di Pore acque sotto anossiche condizioni

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

Pulire campionamento e analisi del fiume e di estuario Acque per Trace Studi di metallo

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

Una prova di flessione per la determinazione del limite di plastica Atterberg in terreni

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Estrazione e l&#39;analisi delle microbica fosfolipidi acidi grassi nei terreni

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and organiclastic sulfate reduction (OSR) in marine sediments. However, unravelling the complex pyritization sequence is a challenge because of the coexistence of different sequentially formed pyrite phases. This manuscript describes a sample preparation procedure that enables the use of secondary ion mass spectroscopy (SIMS) to obtain in situ &#948;34S values of various pyrite generations. This allows researchers to constrain how SO4-AOM affects pyritization in methane-bearing sediments. SIMS analysis revealed an extreme range in &#948;34S values, spanning from -41.6 to +114.8&#8240;, which is much wider than the range of &#948;34S values obtained by the traditional bulk sulfur isotope analysis of the same samples. Pyrite in the shallow sediment mainly consists of 34S-depleted framboids, suggesting early diagenetic formation by OSR. Deeper in the sediment, more pyrite occurs as overgrowths and euhedral crystals, which display much higher SIMS &#948;34S values than the framboids. Such 34S-enriched pyrite is related to enhanced SO4-AOM at the sulfate-methane transition zone, postdating OSR. High-resolution in situ SIMS sulfur isotope analyses allow for the reconstruction of the pyritization processes, which cannot be resolved by bulk sulfur isotope analysis.

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Analyses of the sulfur isotopic composition (&#948;34S) of pyrite from methane-bearing sediments have typically focused on bulk samples. Here, we applied secondary ion mass spectroscopy to analyze the &#948;34S values of various pyrite generations to understand the diagenetic history of pyritization.

Preparazione di pirite Autigenesi da sedimenti di metano-cuscinetto per In Situ l'analisi di isotopi di zolfo utilizzando SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolamento ed analisi di comunità microbiche nel suolo, rizosfera e radici negli esperimenti di erba perenne

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the associated accuracy is unknown. Here, we present a detailed protocol for efficient and clustered soil sampling in a research plot and, relying on a pilot sampling using this design, for demonstrating soil spatial heterogeneity and informing reasonable sample sizes and associated accuracy for future study. The protocol mainly comprises four steps: sampling design, field collection, soil analysis, and geostatistical analysis. The step-by-step procedure is modified according to former publications. Two examples will be presented to demonstrate contrasting spatial distributions of soil organic carbon (SOC) and soil microbial biomass carbon (MBC) under different management practices. In addition, we present a strategy to determine the sample size requirement (SSR) given a certain level of accuracy based on the plot-level coefficient of variation (CV). The field sampling protocol and the quantitative determination of the sample size will assist researchers in seeking feasible sampling strategies to meet research needs and resources' availability.

The traditional soil-sampling procedure determines the number of soil samples arbitrarily. Here, we provide a simple yet efficient clustered soil-sampling design to demonstrate soil spatial heterogeneity and quantitatively determine the number of soil samples required and the associated sampling accuracy.

Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi

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