מימון להיבטים של עבודה זו סופק על ידי מקורות שונים, כולל ארצות הברית מחלקת חקלאות ההסכם שיתופי ספציפי 58-6408-1-595 והקרן הלאומית למדע (הפרס 1,049,911).

ניתוח Colorimetric של תאית אנזים פעילות בקרקעות ומשקעים 1. הכנת התשתית ופתרונות הצפת לניתוח Colorimetric של אנזים פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H להכין 50 מ&quot;מ אצטט חיץ (pH 5.0-5.5) על ידי ערבוב חומצת 50 מיליליטר 0.1 M אצטית (2.87 מיליליטר חומצה אצטית קרחונית ב500 מיליליטר מים), 150 מיליליטר 0.1 נתרן אצטט M, ו200 מיליליטר מזוקק 2 O. התאם ל-pH 5.0-5.5 עם 0.1 M חומצה אצטית במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של הידרוקסיד 1 M נתרן (NaOH) במזוקקי H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות מצע צמוד NP p ב50 מ&quot;מ חיץ אצטט. לassay phosphatase להכין NP-פוספט עמ &#39;5 מ&quot;מ ב50 מ&quot;מ אצטט חיץ; לassay β-glucosidase להכין NP-β-glucopyranoside עמ&#39; 5 מ&quot;מ; לassay Nagase להכין 2 מ&quot;מ PNP-β-N-acetylglucosaminide. הכן את כל הפתרונות במצע 15 מיליליטר סטרילי או 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. ניתן לאחסן את הפתרונות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שבועות. </li></ol> 2. קביעת תקן להמרה ספיגת לריכוז NP p <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות סטנדרטיים של p-nitrophenol ב50 מ&quot;מ חיץ אצטט. ריכוזים צריכים לנוע .025-1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה שלושה משכפל של כל ריכוז 100 μl לmicroplate 96, גם ברור. הוסף 10 μl 1 M NaOH ו190 μl מזוקק H 2 O היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא הספיגה ב 410 ננומטר באמצעות קורא microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוזי כפל בעקומת הסטנדרט ידי 0.3 לקבל NP p μmoles ל300 μl עוצמת תגובה. עלילה עקומה של הספיגה לעומת μmole של NP p. שיפוע העקום משמש כמקדם ההמרה (C) שיתייחס לספיגת μmole של NP עמ &#39;בכל תגובת אנזים. </li></ol> 3. ניצוח Assay האנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור קרקע, להכין את התרחיף של כל דגימה להיות assayed בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר סטרילי בconcentration של כ 1 גר &#39;/ מיליליטר -1 באמצעות 50 מ&quot;מ חיץ אצטט. למשקעים, להוסיף מספיק חיץ אצטט לעשות slurry קלות pipettable. נפח תרחיף צורך המדויק ישתנה בהתאם למספר האנזימים assayed, אבל מינימום של 5 מיליליטר מומלץ. ורטקס כל slurry עד שכל הגושים של אדמה או משקעים התפזרו ולב הנפח הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-מערבולת כל slurry ו פיפטה מייד 150 μl לכל אחד משש בארות בגוש 96 היטב deepwell (איור 1). חשוב מערבולת ביסודיות ולעתים קרובות על מנת לשמור על חלקיקי קרקע בהשעיה. להשאיר לפחות שתי בארות לכל בלוק ריקים כדי לשמש שליטת מצע. הערה: קליפ סוף הטיפים פיפטה עם מספריים לפני pipetting כslurries אדמה נוטה לסתום טיפים. הכן את בלוק 96 היטב אחד לכל אנזים להיות assayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 5 מיליליטר של חיץ אצטט לתוך מאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים להוסיף 150 μl של החיץ לליטרAST שתי בארות של כל דגימה (אלה יהיו פקדי חיץ מדגם) ושתי בארות שליטת מצע (איור 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 10 מיליליטר של פתרון NP-מצע p המתאים למאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים להוסיף 150 μl של פתרון המצע לארבע הבארות הראשונות של כל דגימה ושתי בארות שליטת מצע (איור 1). שים לב לזמן כתגובה מתחילה ברגע שפתרון המצע הוא הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב RT (22 מעלות צלזיוס) במשך 0.5-4 שעה. זמן דגירה מדויק משתנה בהתאם לרמת פעילות בדגימות והאנזים להיות assayed. עבור רוב הקרקעות ומשקעים, phosphatase וβ-glucosidase דורשים פעמים דגירה של 0.5-1.5 שעה, ואילו Nagase ואנזימים אחרים דורשים פעמים דגירה של&gt; 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מבחני דוגרים להכין 96 היטב ברור microplates לקרוא הספיגה. הכן microplate אחד עבור כל בלוק deepwell (כלומר עבור כל דוארnzyme assayed). פיפטה 10 μl 1 M NaOH ו190 μl של מים מזוקקים לתוך באר כל microplate. הערה: NaOH מאט את התגובה האנזימטית ומעלה את רמת החומציות אשר משפרת את הצבע של NP p שוחרר במהלך התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, צנטריפוגות בלוקים 96 היטב ב2,000-5,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה חלקיקי קרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה רבה לסגת 100 μl מכל באר, להיות זהיר, כדי למנוע את הכדור, ולהעביר אותו למתאים גם בmicroplate 96, גם ברור שהוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את קורא microplate ולהגדיר כל תוכנה נחוצה. שיא הספיגה ב 410 ננומטר. אם הספיגה טובה במיוחד היא מעל לגבול גילוי ליניארי של קורא הצלחת, לדלל היטב כי 01:01 עם מים ומחדש מידה. אם הספיגה היא עדיין גבוהה מדי, assay יש לחזור עם זמן דגירה קצר יותר. </li></ol> 4. קביעת יבש ההמונית של דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מיליליטר של כל sampl<html> תרחיף דואר לתוך מחבת אלומיניום preweighed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש בתנור ייבוש 75 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ולשקול. הפחת את המשקל של את המחבת מהערך הזה כדי להשיג את המסה היבשה של אדמה או משקעים ב 1 מיליליטר של התרחיף. תכפיל בפקטור של 0.15 כדי לקבוע את המסה היבשה של מדגם בμl 150 מתווסף גם כל בassay האנזים. </li></ol> 5. חישוב פעילות אנזים ליבש המוני של קרקע או משקעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הספיגה סופית של כל דגימה על ידי הפחתת ספיגת שליטת מדגם מספיגת assay המדגם. אם יש לי פקדי מצע גבוהה הספיגה (בערך&gt; 0.060) אחר כך להפחית אותם גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב פעילות אנזים במסה יבשה μmoles גרם -1 שעה -1 מהמשוואה: </li></ol> פעילות אנזים = הספיגה סופית / (מסת x C מדגם x זמן דגירה יבשה) ניתוח של פלורסנט התאי אנזים פעילות בטבע ווטרס פתרונות TLE &quot;&gt; 1. הכנת המצע, רגיל, והצפה לניתוח fluorometric של אנזים פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 200 מיקרומטר פתרונות של מצעי MUB צמודים (למשל 4-MUB-β-glucopyranoside, 4-MUB פוספט, 4-MUB-N-אצטיל-β-D-glucosaminide) על ידי המסת המצע המתאים בסטרילי (autoclaved) מזוקק H 2 O ב15 מיליליטר סטרילי או 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. לעטוף את הצינורות בנייר אלומיניום, כדי להוציא לאור ולאחסן במקרר לפני השימוש. מצעים צריכים להיות יציבים במשך שבוע לפחות 1 אם מאוחסנים בדרך זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סטנדרטי MUB על ידי ביצוע פתרון מניות של 100 מיקרומטר 4-methylumbelliferone בסטרילי H מזוקק 2 O. חנות בקירור בענבר או בקבוק עטוף בנייר אלומיניום. מייד לפני השימוש, לדלל את פתרון 100 המניה מיקרומטר ידי 1/10 לסטרילי H 2 O כדי להפוך את פתרון עבודה של 10 מיקרומטר עבור מבחני אנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של 100 חיץ ביקרבונט מ&quot;מ על ידי המסת 8.4 גרם של NaHCO &lt;תת&gt; 3 לתוך 1 LH 2 O ומעוקר. לדלל פתרון מניות זה 1/20 לסטרילי H 2 O לפי צורך כדי להפוך את פתרון עבודה של 5 מ&quot;מ עבור מבחני אנזים. </li></ol> 2. דגימות מים ארגון על 96, גם השחורה Microplate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לארגן microplate לכל אנזים בעקבות הדוגמא שמוצגת באיור 2. שים לב שמאפשר שכפול נאות, סטנדרטים, ופקדים, הליך זה יכול assay את פעילותו של אנזים בודד לתקופה של עד תשע דגימות מים על microplate השחור 96 היטב אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 5 מיליליטר של המדגם הראשון לתוך מאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים לpipette200 μl לכל הבארות בטור 1 של microplate (ים). מחק טיפים פיפטה משומשים וחזור לפי צורך עבור כל דגימת מים כדי למלא עמודי 1-9. </li></ol> 3. הגדרה לדוגמא, תקן, להרוות, ובקרת תשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת בקרות לחשבון עבור דגימות, סטנדרטיותים, מצע ומרווה באותו microplate השחור כמו הדגימות (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פקדים לדוגמא מכילים מים מדגם חיץ ביקרבונט, ואינם משמשים בחישובי הפעילות אבל ידגימו קריאת עקביות לאורך כל תקופת הניסוי. הפקדים להרוות מורכבים ממי מדגם וכמות סטנדרטית של תג הניאון ומשמשים למדידה העקיפה של הקרינה במים לדוגמא. מצע ופקדים סטנדרטיים מורכבים מחיץ או צמוד מצע או תג הניאון הסטנדרטי, בהתאמה, וסודה לשתייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 5 מיליליטר של 5 מ&quot;מ חיץ ביקרבונט למאגר פיפטה נקי. פיפטה 50 μl של חיץ לתוך בארות microplate 1 עד 9 בשורות D ו-E ליצירת שני לשכפל בארות מדגם פקדים לדגימה. הטיפים פיפטה השינוי לאחר מכן להעביר 200 μl של חיץ ביקרבונט לבארות 10 דרך 12 בשורות וה &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית תאורה מפוזרת על ידי עמעום או כיבוי lights כתקן הניאון הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 5 מיליליטר של 10 מיקרומטר 4 methylumbelliferone-לתוך מאגר פיפטה נקי. פיפטה 50 μl לתוך בארות microplate 1 עד 12 בשורה H, ולתוך בארות 1 עד 9 לתוך שורות G ו F כדי ליצור שלושה משכפל של בקרות להרוות לדגימה ופקדים סטנדרטיים הכלליים. כך או למקם microplate בחושך או לכסות עם מכסה אטום כדי להפחית השפלה אור MUB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את fluorometer והגדרה כל תוכנה נחוצה כדי להיות מוכן לקריאה לפני הוספת המצע. שים לב: כמה נורות fluorometer עשויות לדרוש זמן חימום של 3 דקות או יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 5 מיליליטר של המצע המתאים MUB הצמוד (למשל 4-MUB פוספט) לתוך מאגר פיפטה נקי. השתמש pipettor 12 ערוצי פיפטה 50 μl לתוך בארות microplate 1 עד 12 בשורה, ולתוך בארות 1 עד 9 בשורות B ו-C כדי ליצור שלושה מבחני לשכפל עבור כל דגימה ושלושה פקדי מצע. Immediately המשך לשלב 4.1, הקרינה הקלטה. </li></ol> 4. הקרינה הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הקרינה הראשונית מייד לאחר בנוסף מצע לmicroplate. אחרי שקראתי את הקרינה, דגירה microplate ב RT (22 מעלות צלזיוס) או בחושך או מכוסה במכסה אטומה כדי להפחית השפלה אור MUB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן הדגירה הנדרש כדי למדוד את פעילות האנזים הפוטנציאלית המרבית בדגימת מים יהיה תלוי בריכוז האנזים בתוך המדגם. מכיוון שזו אינה ידועה לפני assay הושלם, microplate יצטרך לקרוא בצעדי זמן מרובים. בדרך כלל, קריאה במרווחים של 10-15 דקות במשך 1 שעות מקובלת לאנזימים רבים, אם כי דגימות עם פעילות גבוהה מאוד על אנזימים מסוימים עשויות להגיע לשיא לפני 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך קריאת הקרינה בmicroplate במרווחי הזמן המיועד שלך במשך שעה לפחות 1. הקפד לשמור מכוסה microplate או בחושך בין הקריאהs. </li></ol> 5. חישוב פעילות האנזים לנפח מים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה בכל מרווח זמן לחשב את: אומר הקרינה מדגם ראשונית (בארות D ו-E), הקרינה הממוצעת הסופית המדגם (בארות AC), הקרינה הממוצעת סטנדרטית (בארות H10-11), ומתכוונים להרוות את הקרינה שליטה (הבארות FG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מרווח זמן, לחשב פעילות אנזים בשעת nmoles -1 מיליליטר -1 מהמשוואה: </li></ol> פעילות אנזים = (כלומר הקרינה מדגם - כלומר הקרינה מדגם ראשונית) / ((x אומר הקרינה / 0.5 mol הסטנדרטי) (מתכוון להרוות את הקרינה שליטה / אומר x הקרינה הסטנדרטי) (0.2 מיליליטר) x (פעם בשעה)) <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ערכי הפעילות מחושבים לכל שלב זמן. קבע פעילות פוטנציאל סופית מהצעד הזמן עם הפעילות הגבוהה ביותר. אם ערכי פעילות ימשיכו לעלות ולאחר מכן צעדי מועד מאוחר יותר ייתכן שיידרשו, אם ערכי פעילות ליפול througהאוט במהלך הריצה, ולאחר מכן להפעיל שוב עם צעדי זמן קצרים יותר. הפעילות האחרונה היא בnmoles של מצע נצרך שעה -1 מיליליטר -1 אך ניתן לשנותם עד כדי להביע כμmoles שעה -1 L -1. </li></ol>

<ol>
	<li>Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+microbial+cellulose+degradation.">Ecology of microbial cellulose degradation.</a> Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).</li><li>Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood+decomposition+over+a+first-order+watershed:+mass+loss+as+a+function+of+lignocellulase+activity.">Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).</li><li>Dalal, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+organic+phosphorus.">Soil organic phosphorus.</a> Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).</li><li>Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+allocation+to+extracellular+enzyme+production:+a+model+for+nitrogen+and+phosphorus+control+of+litter+decomposition.">Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).</li><li>Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+p-nitrophenyl+phosphate+for+assay+of+soil+phosphatase+activity.">Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).</li><li>Parham, J. A., Deng, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+quantification+and+characterization+of+&#946;-glucosaminidase+activity+in+soil.">Detection, quantification and characterization of &#946;-glucosaminidase activity in soil.</a> Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).</li><li>Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+heavy+metal+concentrations,+microbial+biomass+and+enzyme+activities+in+a+contaminated+grassland+ecosystem.">Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem.</a> Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).</li><li>Olander, L. P., Vitousek, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+soil+phosphatase+and+chitinase+activity+by+N+and+P+availability.">Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability.</a> Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).</li><li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+salinity+and+nutrient+enrichment+on+microbial+assemblages+in+Louisiana+wetland+sediments.">Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments.</a> Wetlands. 29, 277-287 (2009).</li><li>Hoppe, H. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+exoenzymatic+activities+in+the+ecology+of+brackish+water:+measurements+by+means+of+methylumbelliferyl-substrates.">Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates.</a> Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).</li><li>Somville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+study+of+substrate+specificity+of+exoglucosidase+activity+in+eutrophic+water.">Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water.</a> Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).</li><li>Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorogenic+substrates+for+measuring+enzyme+activity+in+peatlands.">The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands.</a> Plant and soil. 175, 147-152 (1995).</li><li>Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+analysis+of+riverine+bacterioplankton+production.">Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production.</a> Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).</li><li>Marx, M. -. C., Wood, M., Jarvis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microplate+fluorometric+assay+for+the+study+of+enzyme+diversity+in+soils.">A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils.</a> Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).</li><li>Jackson, C. R., Weeks, A. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+bacterial+community+structure+in+aquatic+sediments+as+revealed+by+16S+rRNA+gene+sequence+analysis.">Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).</li><li>Canion, A. K., Ochs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+population+dynamics+of+freshwater+armored+dinoflagellates+in+a+small+lake+in+Mississippi.">The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi.</a> Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).</li><li>Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+soil+enzyme+activity+at+global+scale.">Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale.</a> Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).</li><li>Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+enzyme+activities+as+indicators+of+organic+matter+processing+rates+in+a+Lake+Erie+coastal+wetland.">Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland.</a> Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).</li><li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+activity+and+decomposition+of+fine+particulate+organic+matter+in+a+Louisiana+cypress+swamp.">Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp.</a> Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).</li><li>Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+changes+with+depth+in+microbial+communities+in+a+tropical+Malaysian+peat+swamp+forest.">Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest.</a> Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).</li><li>Rietl, A. J., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+ecological+restoration+practices+of+prescribed+burning+and+mechanical+thinning+on+soil+microbial+enzyme+activities+and+leaf+litter+decomposition.">Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).</li><li>Smart, K. A., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+scale+patterns+in+microbial+extracellular+enzyme+activity+during+leaf+litter+decomposition+in+a+stream+and+its+floodplain.">Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain.</a> Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

קביעת הפעילות של מגוון רחב של אנזימים תאיים של חיידקים בקרקעות ומשקעים יכולות לספק תובנות שימושיות לשיעורים של מינרליזציה התזונתית ועיבוד חומר אורגני 17. עם זאת, קרקעות יכולות להשתנות ברמות הלחות שלהם, ולכן חשוב לבצע סטנדרטיזציה של פעילות למשקל יבש אדמה. זה דורש צעד נוסף ייבוש (בדרך כלל של שני ימים) מעבר פשוט מדידת פעילות אנזים. לפיכך, בניגוד למבחנים של פעילות אנזים בדגימות מים המספקות ליד תוצאות מיידיים, מבחני אמינים של פעילות אנזים באדמה ומשקעים לקחת כמה ימים. עבור חלק מקרקעות, זה עשוי אפילו להיות מתאים יותר להביע את הפעילות לגרם של חומר אורגני או מסה יבשה אפר חופשי, דורש צעד נוסף ashing (בדרך כלל שעה 2 ב 500 מעלות צלזיוס) מעבר להליך הייבוש. בכל מקרה, השלב הקריטי ביותר בassay colorimetric של פעילות אנזים קרקע או משקע הוא הנסיגה של supernatant מF הבלוק העמוק היטבollowing צנטריפוגה בתום תקופת הדגירה. מכיוון שהליך זה מסתמך על מדידת הספיגה, גם את נוכחותם של כמה חלקיקי אדמה תועים בmicroplate הסופי יכולה להוביל לתוצאות מזויפות. מהירויות גבוהות יותר צנטריפוגה (XG&gt; 5,000) עשוי לעזור להפחית את הבעיה הזו, אבל ברוטורים צנטריפוגות הניסיון שלנו שקבלו microplates בדרך כלל יש מגבלות סיבוב מתחת לסף זה, וחוסם את עצמם לא יכול לסבול את מהירויות גבוהות בהרבה. בעיקרו של דבר, צעד pipetting מסוים זה דורש שילוב של טיפול ומהירות להשתמש pipettor מרובים ערוצים להעביר במהירות את הכמות הנדרשת של supernatant מהגוש העמוק היטב לmicroplate. יש מבחני של פעילות אנזים תאית בדגימות מים לא את הצורך בתקופת ייבוש ולא צעד צנטריפוגה, האפשרות השנייה, כי שניהם תגובת אנזים-המצע והמדידה של הקרינה של המוצר הסופי מתרחשים באותו microplate. כאמור, אלהssays הם בדרך כלל מהיר יותר וייתכן שבתחילה נראה קל יותר להפעלה. עם זאת, יש להם המגבלות שלהם בזה, בכל ההזדמנות אפשרית, סטנדרטי MUB ומצעי MUB צמודים לא צריכים להיות חשופים לאור. מניסיוננו, לעמעם את האורות ככל האפשר במהלך pipetting ודוגר microplates בחושך (או מכוסה במכסה אטומה) הוא הכרח. מכיוון שמבחנים אלה דורשים גם צלחות יש לקרוא בנקודות זמן רבות, זה לעתים קרובות תוצאות הצורך במיתוג מהיר מאוד בין הצלחות כשמנסים לאמוד אנזימים מרובים באותו הזמן. לדוגמא, כדי assay תשע דגימות מים לפעילותם של שישה אנזימים בו זמנית (כלומר, באמצעות שישה microplates שונה), הוא הופך להיות נחוץ כדי לקרוא את לוחית כל 2 דקות לשעה 1 על מנת להבטיח שכל צלחת אדם לקרוא כל 10 -15 דקות (במקרה זה, כל 12 דקות). יש להקפיד לעקוב אחר צלחת המסוימת להיות לקרוא, כמו גם כדי לוודא ששום נוזל שנשפך לכאן ולכאןמ &#39;את הצלחת כפי שהוא מועבר לתוך ומחוץ לfluorometer microplate. כשמנסים לאמוד אנזימים מרובים בבת אחת, חשוב גם לזכור את הזמן שלוקח לקורא microplate כדי באמת לקרוא את הצלחת ולהתנודד קריאת מרווחים בהתאם. דאגה סופית עם assay הניאון של פעילות אנזים תאית בדגימות מים היא בעבודה עם דגימות כי הם עכורים. דגימות מים המכילות חלקיקים מרחפים צריכים להיות מזועזעים בתחילה לפני ששופכים לתוך מאגר פיפטה וערבבו שוב על ידי נסיגה ולהוציא עם pipettor לפני שהועמס על microplate. מספרים גבוהים יותר של חלקיקים במדגם גם בדרך כלל תוצאות מרווה גדולה יותר של אות הניאון, ואת החשיבות של בקרות להרוות עבור כל דגימה לא יכולה להדגיש מספיק. אמנם בדרך כלל מצעי MUB וp NP צמודים מראים ערכי מקסימום V הדומה לאנזימים סביבתיים, הערכים מ &#39;Kיכול להיות שונה, ואנזימים כגון β-glucosidases וphosphatases ייתכן שיש זיקה גבוהה יותר עבור מצעי MUB צמודים מאשר אנלוגים צמודים NP p שלהם 14. לכן, מצעי MUB צמודים צפויים להיות רגיש יותר מצמודי NP עמ &#39;, אשר טוען כי הם יהיו בחירה טובה יותר לשימוש בעת מדידת פעילות אנזים בקרקעות ומשקעים. עם זאת המוצר הסופי fluorogenic שנמדד במהלך מבחני MUB כפוף למרווה פוטנציאלית בכמה תמציות אדמה, וקריאות הקרינה יכולות להיות יציבה לאורך זמן 12. קרקעות ומשקעים גם נוטים להיות פעילות אנזים תאית גבוהה יותר ממים הטבעיים, ולכן הרגישות המוגברת של מבחני MUB צמודי fluorometric עשויה להציע יתרון קטן על פני שיטות NP p colorimetric נתון בעיות הפוטנציאליות עם מרווה בעת ניתוח קרקעות מסוימות. בתור הערה צדדית, מצעים צמודים NP p והסטנדרטי NP p עצמו הוא בדרך כלל יותר affordable מאשר עמיתי MUB; סיבה נוספת לשימוש שלהם אם מגבלות תקציביות ליישם. אולי ההיבט החשוב ביותר של יכולת assay פעילות אנזים תאית של חיידקים בסביבות ימיות ויבשתיות הוא שבעוד שטכניקות אלה למדוד תהליכים פיסיולוגיים של חיידקים, יש תהליכים אלה השפעה ישירה על שינויים ברמת המערכת האקולוגית של פחמן וחומרים מזינים. מחירים של פירוק חומר אורגני נקשרו ישירות לפעילות של cellulases תאי במשקעים 18,19, כך שמדידות מהירה של פעילות אנזים שעלול להקל על הקביעה מיידית בשיעורי פירוק אתר בדגימות סביבתיות. תוך שימוש בגישות microplate תפוקה גבוהות מאפשרת המדידה בו זמנית של פעילות אנזים במספרים גדולים יותר של דגימות מאשר גישות צינור יחיד טיפוסיות יותר, כך תרגיל שבפעילות אנזים (ובהרחבה בתהליכים ברמת המערכת האקולוגית) בשו&quot;תonse לגורמים כגון עומק 20 או הפרעות סביבתיות 9,21 יכול להיבחן. בדומה לכך, מבחני של אנזימים מעורבים ברכיבה על אופניים מזינים, כגון phosphatase וNagase, יכולים לספק תובנות על הגבלה תזונתית בסביבה מסוימת, למשל, את החשיבות היחסית של זרחן האורגני לחנקן אורגני במהלך פיתוח קרקע 8. בגלל פעילות האנזים נמדדה בדגימות סביבתיות במשך למעלה משלושים שנים, השוואות בין מחקרים באמצעות meta-ניתוחים מתקדמים נמצאות כעת הופכות אפשריות. מחקרים אלה מראים כי, בשיעורים בקנה מידה הגלובלית, פעילות אנזים, ולכן פירוק של חומר אורגני ומינרליזציה התזונתית, קשורים לחומציות, זמינות מצע, והרכב תזונתי 17. במקביל, השימוש בפרוטוקול המבוסס על microplate החל להתיר ניתוח דפוסים בקנה מידה בסדר בפעילות אנזים באמצעות טכניקות מיפוי geostatistical 22 </sup&gt;. טכניקות כאלה יכולות לבחון דפוסים בשונות מרחבית, והתפתחויות עתידיות יכולה לכלול את השימוש של-384 גם מבוסס microplates להתיר הניתוח המיידי של אפילו יותר דגימות והרזולוציה של תבניות המרחביות עדינה.

מיקרואורגניזמים כגון חיידקים ופטריות להשיג חומרים מזינים ופחמן מתרכובות אורגניות מורכבות באמצעות הייצור של אנזימים תאיים. אנזימים אלה בדרך כלל hydrolyze פולימרים ליחידות משנה קטנה יותר שאפשר לקחת אל תוך התא. לכן, ברמה אקולוגית, אנזימים תאיים של חיידקים אלו אחראים לחלק גדול ממינרליזציה התזונתית ופירוק חומר אורגני המתרחש בסביבות טבעיות. אנזימים כגון cellobiohydrolase (CBH) וβ-glucosidase חשובים לפירוק תאית ועבודה ביחד כדי לזרז הידרוליזה של תאית לגלוקוז 1,2, המספקת מצע פחמן לניצול לספיגה והטמעה של חיידקים. Phosphatase האנזים משחרר מסיסי קבוצות אורגניות פוספט מזרחנים אורגניים, במהות mineralizing פוספט והופך אותו זמין לשימוש על ידי רוב האורגניזמים 3. אנזימים אחרים, כגון N-acetylglucosaminidase (Nagase), הם importanלא בשפלת כיטין והוא יכול לעשות את שני פחמן וחנקן זמין לרכישת חיידקים 4. אחד מההליכים עבור assay של פעילות אנזים תאית של חיידקים בסביבות טבעיות הוא השימוש בp-nitrophenyl המלאכותי מצעים (NP עמ &#39;) מקושרים, גישה שפותחה במקור כדי לזהות פעילות phosphatase אדמת 5. גישה זו מסתמכת על זיהוי של מוצר בצבע תום, p-nitrophenol, המשתחרר כאשר המצע מלאכותי הידרוליזה על ידי האנזים המתאים. P-nitrophenol ניתן לכמת בהמשך colorimetrically ידי מדידת הספיגה שלה בסביבות 400-410 ננומטר. שיטה זו מאז הוחל לזהות אנזימים אחרים כגון Nagase 6, וכבר נעשה שימוש במחקרים שונים מסתכלת על פעילות אנזים תאית של חיידקים בקרקעות ומשקעים 7-9. גישה חלופית שהייתה originally פותח כדי להעריך את פעילות glucosidase תאית בסביבות מימית 10,11 עושה שימוש 4 methylumbelliferone-(MUB) מצעים מקושרים. המוצר הסופי שפורסם (4-methylumbelliferone) הוא ניאון מאוד וניתן לאתר באמצעות fluorometer עם הגדרת עירור / פליטה סביב 360/460 ננומטר. מגוון מצעים מלאכותיים MUB צמודים זמין, המאפשר מדידת fluorometric של הפעילות של אנזימים לפחות כמו רבים (למשל β-glucosidase, cellobiohydrolase, Nagase, phosphatase) כפי שניתן assayed באמצעות הליך colorimetric NP-מצע p. אנזימים אחרים חיידקים תאיים, כגון aminopeptidase לאוצין החלבון משפיל, יכולים להיות assayed fluorometrically באמצעות 7-אמינו-4-methylcoumarin (COU) מצעים מקושרים. שני MUB ומצעי COU צמודים היו בשימוש כדי לקבוע פעילות אנזים בדגימות יבשתית ומימיות שונות 12,13. בעוד שהמחקרים קודמים descrmicroplate fluorometric או colorimetric ibed גישות כדי לקבוע פעילות אנזים תאית 14, יש צורך בהצגה ברורה של איך לנהל מבחני כאלה. כאן אנו מדגימים נהלים לביצוע טכניקות microplate תפוקה גבוהות לניתוח פעילות אנזים תאי בקרקעות ומשקעים בגישת מצעים צמודים NP p colorimetric ובמים הטבעיים באמצעות טכניקת מצעי MUB צמודת הניאון. אנו מתמקדים במדידה של הפעילות של β-glucosidase, Nagase, וphosphatase כיכולים להיות קשורים אנזימים אלה לפחמן, חנקן, זרחן ורכיבה על אופניים, בהתאמה. עם זאת, ניתן ליישם הנהלים שתוארו כאן כדי המדידה של אנזימים תאיים אחרים באמצעות מצעים מלאכותיים שונים.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS AND MATERIALS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP612-1</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3234</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7006</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9376</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Clear 96-well microplates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-563-301</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96-well deep well blocks</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3958</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Aluminum weigh pans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 15 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8883</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3633</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2133</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96-well microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3792</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-81</td>
			<td>For microplates/deep-well blocks</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate fluorometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>FLx 800</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>8-channel pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of microbial extracellular enzyme activity in waters, soils, and sediments using high throughput microplate assays

חלק גדול מהרכיבה על האופניים מזינים ועיבוד פחמן בסביבה טבעית מתרחש באמצעות הפעילות של אנזימים תאיים שפורסמו על ידי מיקרואורגניזמים. לכן, מדידה של הפעילות של אנזימים תאיים אלה יכול לתת תובנות השיעורים של תהליכים ברמת מערכת אקולוגית, כגון פירוק חומר אורגני או חנקן וזרחן מינרליזציה. מבחני של פעילות אנזים תאית בדגימות סביבתיות בדרך כלל כרוכים חושפים את הדגימות למצעי colorimetric או fluorometric מלאכותיים ומעקב אחר השיעור של הידרוליזה מצע. כאן אנו מתארים שיטות microplate המבוסס על נהלים אלה המאפשרים הניתוח של מספר הגדול של דגימות תוך פרק זמן קצר. דוגמאות מותרת להגיב במצעים מלאכותיים תוך 96 גם microplates או גם עמוקים בלוקים microplate, ופעילות אנזים נקבעה לאחר מכן על ידי קליטה הקרינה או של המוצר הסופי וכתוצאה מכך באמצעות ריד microplate טיפוסיr או fluorometer. נהלי תפוקה גבוהה כגון להקל לא רק השוואות בין אתרים או מערכות אקולוגיות במרחב נפרדים, אלא גם להפחית באופן משמעותי את העלות של מבחני אלה על ידי צמצום כמויות מגיב הכוללות הנדרשות לדגימה.

קרקעות ומשקעים ימיים יש בדרך כלל רמות ניכרות של פעילות אנזים תאית כתוצאה מקהילות המצורפות חיידקים (biofilms) גובר על פני השטח של חלקיקים. איור 3 מראה כיצד פעילות זו משתנה בהתאם לגודל של חלקיקים המתקבלים מהמשקעים של כשליש המשטח זרם כדי שבצפון מיסיסיפי, ארה&quot;ב. מחקר קודם הראה כי קהילות חיידקים על חלקיקי משקעים מהזרם הזה ניתן להפריד לשלוש קבוצות מובחנות המבוססות על ניתוח מולקולרי של מבנה הקהילה שלהם: אלה ב0.063 חלקיקי מ&quot;מ, אלה על 0.125, 0.25, ו0.5 מ&quot;מ חלקיקים, ואלה ב -1 מ&quot;מ חלקיקי 15. ניתוח של דפוסים בפעילות אנזים תאי תומך במסקנה זו; עם (איור 3 א) phosphatase להיות דומה ב0.125, 0.25, ו0.5 מ&quot;מ חלקיקים אבל הרבה יותר גבוה שבברים 1 ו0.063 מ&quot;מ כאשר נמדדו תוך שימוש בטכניקת המצע צמוד NP p. Oאנזימי יס כגון β-glucosidase (איור 3), וNagase (איור 3 ג) להראות פסגות דומות בחלקיקים המשובחים ביותר, אך אינם גבוהים על חלקיקי 1 מ&quot;מ, המדגישים את העובדה שאנזימים שונים עשויים להראות הפצות סביבתיות שונות ואלה יכולים להיות הובהר באמצעות assay. הברים השגיאה נמוכים יחסית מראים כי מבחני colorimetric של פעילות אנזים על משקעים הם לשחזור, ולכן ניתן לניתוח סטטיסטי בהשוואה בין דגימות סביבתיות שונות. מי טבע נוטה להיות בעלי פעילות נמוכה תאית אנזים לכל מיליליטר מקרקעות או משקעים לעשות לגרם. ככזה, הם צריכים להיות assayed fluorometrically באמצעות מצעים MUB צמודים. איור 4 מראה כיצד פעילותם של האנזימים פוספטאז (איור 4 א), β-glucosidase (איור 4), וNagase (איור 4C) משתנים עם עומק באגם רדוד בצפון מיסיסיפי, ארה&quot;בא האגם (boondoggle האגם) ידוע להיות 16 תזונתיים ירודים, שגם היא הוצעה על ידי הפעילות גבוהה יחסית של phosphatase (איור 4 א), אנזים שמיקרואורגניזמים לייצר על מנת לרכוש פוספט מתרכובות אורגניות. לכל שלושת האנזימים assayed, דגימות שנאספו על פני המים (0 סנטימטר) ו50 סנטימטר עומק הראו פעילות דומה, ואילו פעילות הייתה גבוהה במדגם 100 סנטימטר. מדגם זה בעצם נלקח מממשק מים המשקע, ואת הנוכחות של חלקיקי משקעים במדגם סביר חשבונות עבור הפעילות גבוהה יותר ניתן לראות בדוגמה זו, במיוחד עבור β-glucosidase וNagase. כמו עם מצעי NP p, הברים השגיאה הנמוכה מראים כי אפילו עם רק שלוש קריאות לשכפל, שחזור של מבחני fluorometric באמצעות מצעי MUB הוא גבוה. שים לב שיחידות לאיור 4 נמצאות בnmoles של מצע נצרך ואילו אלה לאיור 3נמצא בμmoles של המצע הנצרך, למרות שגודל יחידה לדומה (או לכל מיליליטר או לז). זה מדגיש את העובדה שקרקעות ומשקעים נוטים להיות פעילות תאית גבוהה בהרבה ממים הטבעיים (הפעילות של כל אנזים ספציפי באיור 3 הן גבוהה בכ 10-100x מהפעילות של האנזים המקביל באיור 4). הוא גם ממחיש את הרגישות המוגברת של טכניקת MUB צמודת המצע, ואת הצורך בשימוש בטכניקה הזו למנסה לאמוד פעילות אנזים תאית בדגימות מים. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50399/50399fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50399/50399fig1.jpg" /> איור 1. פריסה מוצעת של לוקי 96 היטב גם עמוק עבור assay של פעילות אנזים תאית בקרקעות או משקעים באמצעות ים צמוד NP p colorimetricטכניקת ubstrate. כל גם צריך לקבל סך של 300 μl, מורכב מתרחיף מדגם, פתרון מצע, או אצטט חיץ תלוי אם זה ריצת מדגם, בקרת מדגם, או שליטת מצע. <img alt="איור 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50399/50399fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50399/50399fig2.jpg" /> איור 2. פריסה מוצעת של 96, גם שחור microplates עבור assay של פעילות אנזים תאית בדגימות מים באמצעות טכניקת מצע MUB צמודת fluorometric. ניתן לארגן תשע דגימות אנכית על () הצלחת כל כובש שמונה בארות. שמונה בארות אלה משמשות לריצות לדוגמא, פקדי מדגם, ולהרוות את הפקדים ואילו בארות שנותרו משמשות עבור פקדי מצע וסטנדרטים MUB (ב &#39;). <img alt="איור 3" fo:content-width = &quot;3.5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/50399/50399fig3highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50399/50399fig3.jpg&quot; src איור 3. פעילות תאית אנזים בגדלים שונים של חלקיקי משקעים שנאספו ממשטח זרם קטן בצפון מיסיסיפי, ארה&quot;ב. כל שבריר גודל חלקיקים הייתה assayed לפעילות של phosphatase (), β-glucosidase (ב &#39;), וNagase (C) הבא הליך colorimetric p NP-מצע. פעילות מדווחת במצע μmoles גרם -1 hr המוני יבש נצרכו של משקעים -1 והוא הממוצע (+ SE) של שלוש קריאות לשכפל לשבריר גודל חלקיקים. <img alt="איור 4" fo:content-width="3.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50399/50399fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50399/50399fig4.jpg" /> איור 4. פעילות אנזים תאית במים שצולמו בשלושה difמעמקי ferent (0, 50, ו100 סנטימטר) מאגם רדוד בצפון מיסיסיפי, ארה&quot;ב. המים היו assayed לפעילות של phosphatase (), β-glucosidase (ב &#39;), וNagase (C) הבא MUB-המצע הליך fluorometric. פעילות מדווחת במיליליטר -1 שעות נצרך מצע nmoles של מים ו -1 היא הממוצע (+ SE) של שלוש קריאות לשכפל לדגימה.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays at JoVE.com

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

נהלי Microplate מבוססות מתוארים לניתוח colorimetric או fluorometric של פעילות אנזים תאית. נהלים אלה מאפשרים לassay המהיר של פעילות מסוג זה במספר הגדול של דגימות סביבתיות בתוך מסגרת זמן לניהול.

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

38.7K Views.  The University of Mississippi.  נהלי Microplate מבוססות מתוארים לניתוח colorimetric או fluorometric של פעילות אנזים תאית. נהלים אלה מאפשרים לassay המהיר של פעילות מסוג זה במספר הגדול של דגימות סביבתיות בתוך מסגרת זמן לניהול. 

Video: Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

תפוקה גבוהה fluorometric מדידה של קרקע פוטנציאלית פעילויות אנזים תאיות

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals is often not well understood. Here we demonstrate an integrated field lysimetry and porewater sampling method for evaluating the mobility of chemicals applied to soils and established vegetation. Lysimeters, open columns made of metal or plastic, are driven into bareground or vegetated soils. Porewater samplers, which are commercially available and use vacuum to collect percolating soil water, are installed at predetermined depths within the lysimeters. At prearranged times following chemical application to experimental plots, porewater is collected, and lysimeters, containing soil and vegetation, are exhumed. By analyzing chemical concentrations in the lysimeter soil, vegetation, and porewater, downward leaching rates, soil retention capacities, and plant uptake for the chemical of interest may be quantified. Because field lysimetry and porewater sampling are conducted under natural environmental conditions and with minimal soil disturbance, derived results project real-case scenarios and provide valuable information for chemical management. As chemicals are increasingly applied to land worldwide, the described techniques may be utilized to determine whether applied chemicals pose adverse effects to human health or the environment.

Field lysimetry and porewater sampling allow researchers to evaluate the fate of chemicals applied to soils and established vegetation. The goal of this protocol is to demonstrate how to install required instrumentation and collect samples for chemical analysis during integrated field lysimetry and porewater sampling experiments.

משולב שדה Lysimetry וPorewater דגימה להערכת כימית ניידות בקרקעות וצמחייה הוקמה

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

מדידה של שטף גזי חממה מקרקעות חקלאיות באמצעות לשכות סטטי

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate reduction is used in industrial wastewater treatment to remove large concentrations of sulfate along with the chemical oxygen demand (COD) and heavy metals. The most common approach to the process is with anaerobic bioreactors in which sulfidogenic sludge is obtained through adaptation of predominantly methanogenic granular sludge to sulfidogenesis. This process may take a long time and does not always eliminate the competition for substrate due to the presence of methanogens in the sludge. In this work, we propose a novel approach to obtain sulfidogenic sludge in which hydrothermal vents sediments are the original source of microorganisms. The microbial community developed in the presence of sulfate and volatile fatty acids is wide enough to sustain sulfate reduction over a long period of time without exhibiting inhibition due to sulfide. 
This protocol describes the procedure to generate the sludge from the sediments in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) type of reactor. Furthermore, the protocol presents the procedure to demonstrate the capability of the sludge to remove by reductive dechlorination a model of a highly toxic organic pollutant such as trichloroethylene (TCE). The protocol is divided in three stages: (1) the formation of the sludge and the determination of its sulfate reducing activity in the UASB, (2) the experiment to remove the TCE by the sludge, and (3) the identification of microorganisms in the sludge after the TCE reduction. Although in this case the sediments were taken from a site located in Mexico, the generation of a sulfidogenic sludge by using this procedure may work if a different source of sediments is taken since marine sediments are a natural pool of microorganisms that may be enriched in sulfate reducing bacteria.

Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

פיתוח של Sulfidogenic בוצה מים משקעים וטריכלוריטן הפחתה בכור שמיכת Upflow אנאירובית בוצה

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

נקי דיגום ואנליזה של נהר ושפכי הנהרות ווטרס ללימודי מתכת עקבות

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

מבחן כיפוף לקביעת מגבלת פלסטיק Atterberg בקרקעות

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

שיטות Resampling הקרקע לעקוב אחר שינויים בריכוזיים הכימית של קרקעות יער

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and organiclastic sulfate reduction (OSR) in marine sediments. However, unravelling the complex pyritization sequence is a challenge because of the coexistence of different sequentially formed pyrite phases. This manuscript describes a sample preparation procedure that enables the use of secondary ion mass spectroscopy (SIMS) to obtain in situ &#948;34S values of various pyrite generations. This allows researchers to constrain how SO4-AOM affects pyritization in methane-bearing sediments. SIMS analysis revealed an extreme range in &#948;34S values, spanning from -41.6 to +114.8&#8240;, which is much wider than the range of &#948;34S values obtained by the traditional bulk sulfur isotope analysis of the same samples. Pyrite in the shallow sediment mainly consists of 34S-depleted framboids, suggesting early diagenetic formation by OSR. Deeper in the sediment, more pyrite occurs as overgrowths and euhedral crystals, which display much higher SIMS &#948;34S values than the framboids. Such 34S-enriched pyrite is related to enhanced SO4-AOM at the sulfate-methane transition zone, postdating OSR. High-resolution in situ SIMS sulfur isotope analyses allow for the reconstruction of the pyritization processes, which cannot be resolved by bulk sulfur isotope analysis.

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Analyses of the sulfur isotopic composition (&#948;34S) of pyrite from methane-bearing sediments have typically focused on bulk samples. Here, we applied secondary ion mass spectroscopy to analyze the &#948;34S values of various pyrite generations to understand the diagenetic history of pyritization.

הכנה של פיריט Authigenic ממשקעים מתאן מניבי בחיי עיר גופרית איזוטופ ניתוח באמצעות סימס

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the associated accuracy is unknown. Here, we present a detailed protocol for efficient and clustered soil sampling in a research plot and, relying on a pilot sampling using this design, for demonstrating soil spatial heterogeneity and informing reasonable sample sizes and associated accuracy for future study. The protocol mainly comprises four steps: sampling design, field collection, soil analysis, and geostatistical analysis. The step-by-step procedure is modified according to former publications. Two examples will be presented to demonstrate contrasting spatial distributions of soil organic carbon (SOC) and soil microbial biomass carbon (MBC) under different management practices. In addition, we present a strategy to determine the sample size requirement (SSR) given a certain level of accuracy based on the plot-level coefficient of variation (CV). The field sampling protocol and the quantitative determination of the sample size will assist researchers in seeking feasible sampling strategies to meet research needs and resources' availability.

The traditional soil-sampling procedure determines the number of soil samples arbitrarily. Here, we provide a simple yet efficient clustered soil-sampling design to demonstrate soil spatial heterogeneity and quantitatively determine the number of soil samples required and the associated sampling accuracy.