Los sideróforos son biomoléculas quelantes de metal de bajo peso molecular quelantes implicadas en el ciclo de hierro en el medio ambiente. Este protocolo permite una evaluación rápida de alto rendimiento de la actividad de sideróforo en muestras de suelos y plantas. Los métodos anteriores para la detección de sideróforos han eliminado el entorno crucial de la comunidad microbiana.
Nuestra técnica permite la detección dentro de la comunidad microbiana relativamente intacta y el hábitat en el que participa. Debido a que la disponibilidad de hierro es crucial para la productividad agrícola, por lo que en este protocolo podría utilizarse para investigar el papel de los microbios en la modulación de la disponibilidad de hierro a las plantas. Además, este método podría utilizarse para evaluar el impacto de las prácticas de gestión de las granjas en la salud del suelo y las comunidades productoras de sideróforos, así como el desarrollo de dichas comunidades a lo largo del tiempo.
Para empezar, lave a ácido toda la cristalería en 100 mililitros de ácido nítrico 100 mililitros durante un mínimo de dos horas antes de su uso en el ensayo CAS. Prepare una bandeja para hornear de aluminio llena de arena de laboratorio y cúbrala con papel de aluminio. Autoclave a 121 grados centígrados durante 30 minutos y reserva.
Prepare HDTMA añadiendo 0365 gramos a 20 mililitros de agua desionizada doble, y coloque la solución en un baño de agua a 37 grados centígrados para promover la solubilización. Agregue 0302 gramos de CAS a 25 mililitros de agua desionizada doble mientras remueve suavemente con una barra de agitación magnética estéril. A continuación, añada cinco mililitros de un hexahidrato de cloruro de hierro molar a los 25 mililitros de solución de CAS mientras continúa agitando suavemente.
Ahora, agregue lentamente los 20 mililitros de solución HDTMA a la solución compleja CAS de hierro mientras remueve suavemente. Prepare la solución tampón disolviendo 15,12 gramos de PIPES en 375 mililitros de agua desionizada doble con agitación suave. Ajuste el pH a 6,8 con un hidróxido de sodio molar.
A continuación, agregue agua para llevar el volumen a 450 mililitros. Ahora agregue cinco gramos de agarosa a la solución. Autoclave la solución tampón PIPES y la solución compleja CAS de hierro a 121 grados Celsius durante 30 minutos.
Agregue cuidadosamente la totalidad de la solución compleja CAS de hierro a la totalidad del tampón PIPES en el gabinete de bioseguridad después de que cada uno de ellos haya sido autoclavado. Coloque la solución mixta en un baño de agua a 50 grados centígrados. Ahora coloque un bote reactivo estéril en la arena estéril dentro del gabinete de bioseguridad y caliente a 50 grados centígrados.
Transfiera el agar complejo CAS de hierro al barco, luego aliquot 100 microlitros rápidamente a cada pozo de una microplaca estéril de fondo plano claro de 96 pocódigo. Preparar 800 micromolar pyoverdine estándar en medio M9 modificado previamente preparado. Diluir la solución en soluciones micromolares 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 y 6.25.
Agregue EDTA a 500 mililitros del medio M9 modificado previamente preparado para preparar el estándar EDTA de 3,2 mililitros. Diluir esta solución en soluciones de micromolar 1600, 800, 400, 200, 100, 25, 12,5 y 6,25. Para generar una curva estándar, añada 100 microlitros de cada concentración de pyoverdina y EDTA para separar los pozuelos de una microplaca de 96 pocóculos que contenga 100 microlitros de acero CAS complejo medio de agar.
Realice replicaciones técnicas duplicadas de cada concentración. También agregue pozos en blanco con sólo M9. Usando un lector de microplacas, mida la absorbancia después de una, seis y 24 horas de incubación a 22 grados Celsius, y utilice mediciones de absorbancia para generar curvas estándar. Lave el equipo de muestreo con 22 micras de filtro de doble agua desionizada seguida de 70% de etanol y limpie con toallas de papel.
Realice el lavado antes del muestreo y entre muestras para mantener la técnica estéril y reducir la contaminación cruzada. Después de excisar los tejidos de las plantas y excavar una pequeña bola de raíz de las plantas en el campo, coloque la bola de raíz en una bolsa de plástico etiquetada separada para la separación de la muestra en el entorno de laboratorio. Coloque todas las muestras directamente sobre hielo y manténgalos a cuatro grados centígrados hasta que se procesen muestras para el ensayo de producción de sideróforos.
Separe las muestras de suelo asociadas a la raíz en suelo de rizosfera a granel, libremente unido y suelo rizoesfera estrechamente unido. Para ello, saque las bolas de raíz de las bolsas y sacuda suavemente el suelo de la bola de raíz. Sacudido fuera del suelo, junto con el suelo dejado en la bolsa, comprenden el suelo a granel.
Este es el suelo de rizosfera libremente unido. Generar firmemente unido rizopsa suelo tomando raíces con la muestra estrechamente unida y poniéndolas en un tubo centrífugo. Añadir 30 mililitros de agua desionizada doble y vórtice durante dos a tres minutos.
Retire las raíces para obtener la dilución de lodos del suelo de rizoesfera estrechamente unida. Homogeneizar cada muestra de suelo dentro de la bolsa de muestra mezclando y girando el suelo tanto como sea posible sin abrir la bolsa. Después de que cada muestra se haya mezclado a fondo, aliquot y suspenda dos gramos de cada muestra de suelo en 20 mililitros de medio M9 modificado dentro de un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros.
Diluir la muestra y luego sellar el tubo con un tapón de espuma estéril para permitir la aireación. Para muestras de rizosfera estrechamente unidas, agregue dos mililitros de lodo del suelo de rizosfera a 20 mililitros de medio M9 modificado dentro de un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros. Diluir la muestra y luego sellar el tubo con un tapón de espuma estéril para permitir la aireación.
Para preparar la muestra de tejido, esterilizar la superficie la raíz, disparar y el grano con 70%etanol. Macerar dos gramos de tejido fresco en 20 mililitros de medio M9 modificado utilizando una licuadora en alto durante 30 segundos. A continuación, transfiera la muestra a un tubo centrífugo estéril de 50 mililitros, diluya y selle el tubo con un tapón de espuma estéril.
Para enriquecer la producción de sideroforo a través de la limitación del hierro incubar los tubos centrífugos de 50 mililitros a temperatura ambiente y agitar a 160 RPM. A las 24, 48 y 72 horas después de iniciar el cultivo de enriquecimiento, retire las submuestras de un mililitro de los tubos de enriquecimiento mediante una técnica estéril. Centrifugar las submuestras a 10.000 veces G durante un minuto en dos tubos centrífugos de mililitro para peletizar las células.
Utilizando una técnica estéril, añada 100 microlitros del sobrenadante a una solución de 100 microlitros de agar complejo CAS de hierro por duplicado o triplicado dentro de la microplaca. Añadir también 100 microlitros de medio estéril M9 como espacios en blanco. Luego incubar la placa a 28 grados centígrados.
Cada placa debe sellarse y cubrirse con papel de aluminio antes de su colocación en la incubadora. Suspenda el sobrenadante y el pellet restantes para cada muestra en su propio tubo de centrífuga estéril de dos mililitros. Añadir 400 microlitros de glicerol estéril en cada tubo de sobrenadante de muestra y volver a suspender el pellet para crear existencias de glicerol.
Congele el stock a menos 80 grados centígrados para su posterior análisis. Mida la absorbancia a las seis, 24, 48 y 72 horas a una longitud de onda de 420 nanómetros. Una mezcla de pyoverdina biosintetizada por Pseudomonas fluorescens se utilizó como estándar para interpretar y cuantificar la absorbancia de muestras en muestras de equivalencia de pyoverdine en micromolares.
La relación entre la absorbancia a 420 nanómetros y la concentración inicial de pyoverdina se muestra aquí. La actividad siderofófora del enriquecimiento de 72 horas se evaluó a las 48 horas de incubación para determinar la influencia del genotipo y el tipo de muestra en el aislamiento de sideróforo. La actividad de sideroforo en muestras de suelo a granel era relativamente baja y no presentaba diferencias entre el genotipo de trigo del que se muestreaba el suelo a granel.
Sin embargo, los enriquecimientos de suelos sueltos aislados del genotipo 725 mostraron una mayor producción de sideróforo en comparación con el suelo libremente unido de Madsen y 727 pero no de Lewjain. Por el contrario, la producción de sideroforo en enriquecimientos de suelo estrechamente ligado no fue fuertemente influenciada por el genotipo. Los cultivos de enriquecimiento de tejido de grano arrojaron una producción de sideróforo relativamente baja independientemente del genotipo.
Los enriquecimientos del tejido de brote de Lewjain tuvieron una producción de sideróforo significativamente menor que los otros genotipos, y 725 cultivos de tejido de brote resultaron en una producción de sideróforo más variable. La mayor diferencia en la actividad de sideróforo se observó en cultivos de enriquecimiento de tejido radicular donde 725 tenía más de 200%mayor actividad de sideróforo que todos los demás genotipos. Uno de los aspectos más gravosos de la ejecución del protocolo es el mantenimiento de condiciones asépticas mientras se completan los muchos pasos para generar la microplaca de agar de hierro CAS y las muestras de prueba para la actividad del sideroforo.
Se puede aplicar una amplia gama de técnicas cromatográficas basadas en cultivos o en ADN, ya sea al pozo de microtíter real o al cultivo preservado por glicerol para más pruebas bioquímicas o caracterización genética y modelado metabólico. Mediante el uso de este protocolo de actividad siderophore puede vincularse más tarde con organismos específicos responsables de esa actividad o posteriormente dirigidos como un mecanismo para impactos ecológicos más grandes. Este protocolo podría modificarse fácilmente para evaluar la producción de sideróforos en cultivos de enriquecimiento generados a partir de muestras recogidas de otros compartimentos ambientales, incluidos el aire, el agua y los sedimentos.
