Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

NOTA: Todos los procedimientos fueron aprobados por el Royal Victorian Eye y Ear Comité de Investigación y Ética Animal Hospital (RVEEH AEC; # 10-199AB). Los sujetos fueron tratados de acuerdo con la Salud de la Nación y &quot;Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de animales con fines científicos&quot; del Consejo de Investigación Médica (2013) y la &quot;Prevención de la Crueldad contra los Animales Act&quot; (1986, y sus modificaciones). Todos los procedimientos de evaluación y electrofisiológicos quirúrgicos, clínicos se llevaron a cabo bajo anestesia y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. 1. La enucleación y Fijación NOTA: Siga el procedimiento enucleación y fijación se describe en detalle en el manuscrito acompañante 16, teniendo especial cuidado alrededor de los cables de dispositivos o puertos de vitrectomía, si está presente. En pocas palabras, se trata de: <ol><li> Transcardially perfundir el tema con solución salina tibia seguida de buffe neutro fríoformalina rojo. </li><li> Ate suturas para el globo ocular para servir como puntos de referencia. </li><li> Enuclear el ojo 16, el mantenimiento de los cables del dispositivo y cualquier archivo adjunto parches / pestañas. </li><li> Post-fijar los ojos en solución de Davidson durante 18 - 36 h. </li><li> Traslado al 50% de etanol por 6-8 hr. </li><li> Transferencia a etanol al 70% y refrigerar (4 ° C) hasta que la disección. </li></ol> 2. Eliminación del electrodo y la disección. NOTA: No todos los implantes epirretinianas tendrán el mismo factor de forma, pero en general habrá una serie de electrodos y algún tipo de material de soporte flexible y adaptable. Los dispositivos que se adosa a la retina tienen un agujero tachuela donde la tachuela de metal penetra en la matriz y la parte posterior del ojo, manteniendo estos juntos. <ol><li> Visualizar el implante y el punto en el que se asegura a la retina. <ol><li> Utilizando una cuchilla de 15 grados hacer una incisión circunferencial trans-corneal y retire la tapa de la córnea a expose el iris y el cristalino subyacentes. </li><li> Utilizando una cuchilla de 15 grados, disinsert las fibras zonulares de la lente y quitar la lente en su totalidad, la exposición de la cámara posterior con el implante epirretiniana y la pegajosidad de metal in situ. </li></ol></li><li> Dependiendo del implante y el estudio que se realizaron, eliminar los componentes extraños antes de una nueva disección. NOTA: En el presente ejemplo, la matriz epirretiniana que está siendo evaluado consistió en un paquete hermético electrodo de diamante y la electrónica prototipo alojado dentro de un vehículo de silicona conformal (producido en casa; consulte 20). <ol><li> Aquí, extraer cuidadosamente el paquete de electrodo de diamante mediante disección fina con un bisturí. Deja el cuerpo de silicona del implante junto con la tachuela de la retina y los restos de los cables de platino (Figura 2). Si un array / vivienda incrustado no es parte del diseño del dispositivo objeto de la investigación, a continuación, omitir este paso (2.2). </li></ol></li><li> Cuidadosamentediseccionar una muestra que incluye el puño de amura y el tejido circundante en la orientación deseada. Utilice tijeras de disección finas para cortar tiras de grosor completo de la parte posterior del ojo, incluyendo la esclerótica, la coroides y la retina. Tomar una muestra, lo que da una sección transversal longitudinal de la tachuela, mostrando todas las capas de la retina adyacentes a la pegajosidad (Figura 2) NOTA: La orientación deseada para la muestra puede diferir dependiendo del resultado particular deseado. Por ejemplo, si se desea examinar la proximidad de la tachuela daños en el disco óptico, entonces el disco óptico debe ser incluido dentro de la muestra. </li></ol> 3. La deshidratación, incrustación, Montaje, Moler, tinción, e Imagen <ol><li> Deshidratar la muestra a lo largo de tres días en etapas progresivas de etanol: <ol><li> Deshidratar la muestra en etanol al 70% durante 2 horas dos veces. </li><li> Deshidratar la muestra en etanol al 80% durante 2 horas dos veces y luego O / N. </li><li> Deshidratar la muestra en etanol al 90% durante 2 horas twice. </li><li> Deshidratar la muestra en etanol al 100% durante 2 horas dos veces y luego O / N. </li></ol></li><li> Deshidratar la muestra en acetona al 100% durante 2 horas dos veces. <ol><li> Retire la muestra de la acetona y observarlo bajo un microscopio de luz ya que las seca al aire a temperatura ambiente. Trasladar la muestra a epoxi (consulte el paso 3.4) justo antes de que comience a curvarse / colapso. NOTA: La eliminación de líquido de los tejidos blandos resultados en células colapsadas y contracción. Una apreciación de cuando se produce el rizado tejido / colapso se desarrolla con la experiencia. </li></ol></li><li> Preparar resina epoxi de grado médico de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para curar la resina, utilizar cualquiera de 55 ° C durante 1 hora o 24 horas a RT. Colocar en una cámara de vacío durante ~ 5 min a ~ 50 mbar para la eliminación de burbujas de aire. Regular el vacío manualmente como un vacío excesivo hará que la mezcla de epoxi a hervir y desgasificación no ocurrirá efectivamente NOTA: Realice el paso 3.3 simultáneamente a la etapa 3.2. </li><li> Incrustar el sample en resina epoxi claro. Sumergir el tejido ocular en epoxi desgasificado en un recipiente hermético apropiado y deje O / N a temperatura ambiente para curar. </li><li> Tenga cuidado para incrustar la muestra en la orientación deseada (Figura 2) por el cambio de tamaño y volver a incrustar el bloque epoxi curada. Re-incrustar el bloque de redimensionado que contiene el tejido del ojo de tal manera que el eje largo de la tachuela está orientada paralela a la parte inferior del molde (taza amarilla - la Figura 3A). </li><li> Monte la resina en un portamuestras moler y moler la muestra (230 a 250 rpm con el agua en, molienda manual) usando papel de carburo de silicio (a partir de 800 rejilla; Figuras 3C y 3E). </li><li> Para la tinción, moje la superficie del suelo en la mancha azul de toluidina para 3-5 minutos, o hasta que se desarrolla la mancha (Figura 3F). </li><li> Enjuague con agua del grifo (Figura 3G). </li><li> Image la superficie del suelo de la muestra con un alcance de disección de alta potencia para visualizar las capas celulares de laretina (Figura 3H). Aplicar una gota de agua destilada en la superficie superior del epoxi por encima de la muestra para suavizar la difracción en la interfase aire-epoxi. Use una fibra fuente de luz óptica &quot;cuello de cisne&quot; para iluminar la muestra. </li><li> Repetir los pasos 3.6 hasta 3.9, cada tiempo de molienda de distancia un espesor prefijado de la muestra (incremento preciso y reproducible mínimo de molienda de soporte de la muestra es de 20 micras). </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+round+window+and+cochleostomy+approaches+with+a+prototype+hearing+preservation+electrode.">Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode.</a> Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).</li><li>Shepherd, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cochlear+implant+electrode+array+for+use+in+experimental+studies.">An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies.</a> Hear Res. 277, 20-27 (2011).</li><li>Tykocinski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrode+position+in+the+human+cochlea+using+various+perimodiolar+electrode+arrays.">Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays.</a> Am J Otol. 21, 205-211 (2000).</li><li>Hardie, N. 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Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

Técnicas histológicas estándar son incapaces de procesar los implantes de metal duro in situ debido a las limitaciones en cortar estos objetos de metal, vidrio o incluso discos de diamante. En nuestro documento complementario 16, se demostró que el uso de una técnica de fijación de ojos conjunto modificado podría reducir la delaminación retina artefactos. En el manuscrito actual, una molienda establecido y técnica de pulido para la visualización de los implantes cocleares 21-23 in situ se modificó para las prótesis de retina. Una tachuela de titanio, utilizado para asegurar un conjunto de electrodos a la retina, epiretinally, se ha incrustado en epoxi junto con el tejido ocular circundante. A continuación, este bloque de resina estaba orientado de manera adecuada y suelo progresivamente / pulido con el fin de revelar la morfología del tejido inmediatamente adyacente a la pegajosidad metal. Imágenes de la superficie pulida del bloque a varias profundidades fueron tomadas con un potente microscopio de disección. Esta técnica es útil para: visualizar y evaluating la respuesta del tejido adyacente al implante epirretiniana; para evaluar el trauma quirúrgico asociado con la implantación del implante; para determinar la reacción biológica a los componentes de metal duro; y para medir la distancia entre el implante y la superficie de la retina. Esta técnica será útil en estudios de seguridad futuras para la visualización in situ de la región adyacente a una tachuela de retina u otros (por ejemplo, metálico) objetos duros en el ojo. Esto tiene aplicación directa en la evaluación de la seguridad preclínica de prótesis clavados a la retina epiretinally. También puede ser útil para evaluar el daño tisular en las regiones de la retina en contacto con los implantes situados en la ubicación sub-retinal. Hay varias maneras de verificar que la técnica se ha realizado correctamente. En cada etapa, la retina debe permanecer adherida a las capas externas del ojo. Si hay desprendimiento de retina artifactual bruto, esto puede Indiccomió un problema con la fijación. Cuando se incrusta la muestra y re-orientado en la resina final bloquear la retina debe estar cerca ortogonal con la superficie de rectificación del bloque; esto reducirá al mínimo de corte oblicuo. Es útil para comprobar que el número de pasos incrementales de molienda (de tamaño de paso conocido) requerido para atravesar un objeto (tal como una tachuela de la retina) se correlaciona en consecuencia con las dimensiones del objeto. La técnica se puede optimizar de varias maneras. Los arañazos en la superficie del bloque de epoxi asociado con el proceso de molienda se puede reducir con el pulido progresivamente más fino grado. Para el presente estudio, hemos utilizado 800, 1000, 1200, 2400, 4000 y papel de carburo de silicio de grado. Pasta de diamante también se podría utilizar para mejorar el acabado de superficie. Un acabado superficial más fino da una imagen de mayor calidad, pero a costa de tiempo de pulido adicional. Otra consideración crítica para mejorar el resultado de esta técnica es la elección y la calidad de la optics e iluminación utilizados para la captura de imágenes. Otras tinciones histológicas básicas - en particular las manchas de Nissl, se pueden utilizar en lugar de azul de toluidina, pero pueden requerir una mayor optimización. Algunas manchas se mancha la resina, así como el tejido (por ejemplo, Eosina), por lo tanto, un pulido superficial puede ser necesaria después de la tinción de fondo para eliminar la decoloración. Manchas especializados, colorantes fluorescentes y tinción inmunohistoquímica no se intentó, pero menos que se desee un resultado muy específico, el tiempo requerido para realizar estas manchas en cada nivel de molienda es probable que sea prohibitivo. Sin embargo, puede ser posible manchar el tejido en su conjunto antes de la etapa incrustación (paso 3.4) 24. La principal limitación de esta técnica es que una vez que la región de interés se ha molido de distancia, no puede ser recuperada, por lo tanto, es prudente para capturar muchas imágenes (posiblemente redundantes) en una variedad de aumentos en cada etapa de esmerilado y pulido. EsTambién es importante utilizar pequeños incrementos para cada ajuste de la profundidad de molienda. Otra limitación de esta técnica es la de la ampliación óptica y la resolución en comparación con montado en un portaobjetos de vidrio y se ve con un estándar (transmisión) microscopio de luz de tejido. A los efectos de creación de prototipos y la evaluación de la seguridad de un dispositivo de implante novela, la evaluación patológica bruto es de interés primordial. Esta técnica proporciona un método eficiente para observar el daño clínicamente relevante asociada con una tachuela de la retina. Con la práctica, el tiempo total necesario para reunir moler, pulir y fotografiar una muestra dada (una vez integrados) es comparable al tiempo que se tardaría en sección de un bloque de parafina o sección de congelados. Hay también el potencial de las presentes técnicas para extenderse a aplicaciones fuera del ámbito de aplicación de implantes de retina. Esta técnica es adecuada para evaluar el tejido adyacente a un implante duro, donde la extracción del implante no es feasible o dañarían la interfaz. Por ejemplo, esta técnica podría ampliarse para evaluar los implantes hechos de metal (por ejemplo, platino, nitinol, etc.) que no se puede cortar con técnicas histológicas convencionales, tales como algunos cerebral profunda o electrodos de los nervios periféricos, cánulas para la entrega de drogas, stents vasculares o prótesis ortopédicos.

La retinitis pigmentosa (RP) es un trastorno hereditario que causa la pérdida generalizada de los fotorreceptores, que son las células en la capa más externa de la retina responsable de la transducción de la luz, en forma de fotones, en la actividad neural. Es importante destacar que, los pacientes con RP tienen típicamente neuronas residuales en las otras capas de la retina que todavía son funcionales. Prótesis de retina son capaces de restaurar algo de visión limitada a estos pacientes por la orientación de estas neuronas supervivientes con estimulación eléctrica para activar su 1,2 vía visual. Resultados de percepción de los ensayos clínicos han mostrado resultados iniciales prometedores y recientemente algunos dispositivos han sido aprobados para su uso comercial. Actualmente, hay tres principales localizaciones anatómicas en el que las prótesis de la retina clínicos se han posicionado epiretinally: 3,4, 5,6 y subretinally suprachoroidally 7,8. Diferentes dispositivos utilizan diferentes materiales y su forma es personalizadoa la ubicación en la que se implantan. Sin embargo, todos ellos crean percepciones visuales mediante la activación de las neuronas residuales de la retina con impulsos eléctricos. Existe el potencial para cualquier prótesis médica para dañar el tejido circundante debido a los efectos mecánicos de la colocación inicial o fuerzas en curso posteriores. En el caso de estimuladores implantables, tales como prótesis de la retina, está la consideración adicional de que los parámetros eléctricos deben estar dentro de los límites de seguridad. La seguridad del paciente es de suma importancia, por lo que los dispositivos deben ser rigurosamente en estudios preclínicos antes de avanzar a establecer una clínica 9-15. En nuestro compañero artículo, se describe un método para evaluar la histopatología localizada del ojo que rodea a un implante colocado en el espacio supracoroidal 16. En el presente manuscrito, se describe una técnica para la visualización de tejido del ojo que rodea una matriz de electrodos viró a la retina epiretinally, en un preclínica (Femodelo de línea) (Figura 1). La ubicación epirretiniana es la posición más comúnmente utilizado para la localización de una prótesis visual. Conjuntos de electrodos situados aquí suelen colocarse en la retina con una tachuela de metal que penetra en todas las capas del ojo 17-20. Antes de las técnicas descritas en el presente manuscrito, era difícil evaluar con precisión la retina y otros tejidos que rodean una tachuela. La fijación del ojo estándar utilizando formalina tamponada neutra dio lugar a daño en la retina de artefactos debido al movimiento diferencial de la retina y la esclerótica en contra de la punta de la tachuela fijo. Por lo tanto cualquier daño real causado por la pegajosidad y la matriz epirretiniana no se pudo observar con precisión. Además, seccionar el tejido ocular no pudo realizarse con el puño de amura de la retina in situ como objetos de metal no se pueden cortar fácilmente con aparatos histológico tradicional; la eliminación de la pegajosidad antes del procesamiento histológico fue tambiénindeseable ya que esto también llevó a daño en la retina artefactos. El objetivo del presente estudio fue doble: 1) para reducir el artefacto desprendimiento de retina por lo que los daños causados ​​por la adherencia y la matriz de implante epiretinal se puede evaluar de forma fiable; y 2) para visualizar la arquitectura de la retina adyacente a la pegajosidad sin eliminarlo. A fin de lograr objetivo 1, se utilizó una nueva técnica de fijación (como se describe en el artículo de compañía 16), lo que reduce la deslaminación de la retina artefactual. A fin de lograr objetivo 2, modificamos una incrustación, molienda y pulido técnica, desarrollado originalmente para la observación in situ de electrodos de implantes cocleares 21-23. Los métodos descritos en este manuscrito permiten la visualización de la retina circundante y adyacente a una tachuela in situ mientras se minimiza el daño de la retina artefactual y por lo tanto permite una evaluación precisa de cualquier daño potencial causado por el puño de amura y la matriz epirretiniana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="853">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Name of the reagent / equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:151px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Acetone</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Supply</td>
			<td style="width:176px;">AA008</td>
			<td style="width:151px;">Propanone BHD Medical grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Epo-Tek 301 Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Epoxy Technology</td>
			<td style="width:176px;">Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol 70-75% v/v</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">4.10261</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">90143</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Toluidine blue O</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">T3260</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">TegraPol grinding/polishing machine</td>
			<td>Struers</td>
			<td>TegraPol-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">AccuStop specimen holder</td>
			<td style="width:191px;">Struers</td>
			<td style="width:176px;">Accustop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2.0x Planapo Objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC-420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Software</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Application Suite v4.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

El protocolo de fijación reduce sustancialmente el desprendimiento de artefactos y delaminación de la retina 16. Orientación de la muestra dentro del bloque de epoxi se consiguió consistentemente utilizando el proceso de incrustación de dos pasos descrito. El procedimiento de molienda gradual requiere un nivel moderado de destreza manual para lograr resultados óptimos, pero fue ayudado por el portamuestras ajustable que proporciona un control preciso sobre la resolución de la subasta. En todos los casos (n = 5) de la tachuela fue localizado y tierra / pulido con resultados deseables y consistentes. La retina adyacente a las tachuelas fueron resoluble y se tiñeron apropiadamente. Pulir la superficie del bloque de resina epoxi con un # 800 papel de carburo de silicio de grado P era suficiente para la imagen de la macroestructura celular del tejido embebido. Papel de grado superior, o suspensión de diamante se pueden utilizar para pulir aún más la superficie en cualquier profundidad dada si se desea. Un microscopio de disección y fibra óptica &quot;cuello de cisne&quot; light fuente se encontró que era adecuado para obtener imágenes de la superficie del bloque de suelo y la muestra de tejido incorporado. La posición de la fuente de luz se varió por ensayo y error para encontrar una ubicación y el ángulo que dio la mejor iluminación y contraste a través del microscopio. La adición de una gota de agua destilada a la superficie del bloque, por encima de la muestra, era útil para reducir la trayectoria de la luz de difracción y / o distorsiones lisas en la interfase aire epoxi. La Figura 4 muestra imágenes de ejemplo de tejido de la retina visualizados inmediatamente adyacente a una retina de titanio virar utilizando esta técnica. Desprendimiento de retina no artefactual y plegado se pueden ver en cada lado de la silicona (Figura 4A). El eje de la tachuela es visible incrustado en silicona; el jefe de la tachuela ha penetrado en la retina y la esclerótica. Hay desprendimiento de retina no artefactual en la retina sin teñir cada lado de la silicona (Figura 4C). La técnica ha demostrado que, en este caso, There es la desorganización de la retina adyacente a la pegajosidad y la compresión de la retina en un lado debido a un ángulo de inserción oblicua. Tenga en cuenta que las imágenes presentadas son meramente ilustraciones de la éxito de la técnica, no es representativo de la histopatología tack-daños en general. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> Figura 1. La colocación de un conjunto de electrodos epirretiniana. (A) Diagrama esquemático del ojo que muestra una sección transversal ampliada de la esclerótica posterior, la coroides y la retina degenerada (que carece de fotorreceptores). Un conjunto de electrodos se representa en azul, colocada epiretinally. (B) asistido por ordenador-dibujo de un conjunto de electrodos epiretinal. un circuito integrado (&#39;chips&#39;) y el paquete de electrodos; b, titanio tachuela retina; c, la vivienda de silicona de grado médico; d, punto de salida de plomo. Panel A modificado a partir de un illustrati originalesen facilitado por Bionic Vision Australia, los derechos de autor de Beth Croce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> Figura 2. remoción del electrodo y la disección del ojo. Alto rango dinámico de fotografías macro de un ojo felino enucleado con la tachuela epiretinal in situ. (A) de fijación del anuncio con fijador de Davidson para preservar la arquitectura de la retina 16, el ojo enucleado fue disecada. El paquete de matriz de electrodos fue retirado del portador de silicona (contorno cuadrado de trazos indica la ubicación original de matriz de electrodos), con la tachuela (flecha) y el cuerpo de silicona del implante restante. (B) El ojo se disecó con la sección transversal longitudinal adyacente a la tachuela(Línea discontinua). La pegajosidad permanece incrustado en la pared posterior de la ojera (flecha), estabilizado predominantemente por la esclerótica. La sección de tejido que contiene la tachuela fue preparado para la incrustación de resina y de molienda (segmento de la derecha), mientras que la sección que contiene la retina debajo de la matriz de electrodos eliminado fue preparado para el procesamiento histológico estándar 16 (segmento de la izquierda). Una regla con incrementos de 0,5 mm se muestra en el borde inferior de cada panel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> Figura 3. empotramiento epoxi y molienda de la tachuela y el tejido de la retina. Fotografías del epoxi embebido y muestra de tejido alineado, molienda, tinción y de imagen de la tachuela y el tejido de la retina. (A) El tac<html> k muestra fue incrustado en un bloque de resina epoxi. Usando el molde, la muestra se orientó de manera que el plano longitudinal es paralelo a la parte inferior del molde. (B) El bloque de epoxi curada que contiene la muestra pegajosidad. (C) El bloque de epoxi se montó en un soporte de la muestra de molienda, listos para la molienda . (D) La muestra se orienta de modo secciones de captación de imagen del tejido del suelo contienen las capas celulares de la retina y el eje longitudinal de la tachuela. (E) La muestra se molió usando papel de carburo de silicio en una rectificadora rotatoria. (F) La superficie del suelo de el bloque se tiñó con azul de toluidina para identificar las capas de la retina. (G) El bloque fue lavada con agua del grifo para eliminar el exceso de colorante. (H) El toluidina capas de la retina teñidas de azul y tachuela fueron imágenes utilizando un alto alcance disección con alimentación. ad / 52348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Imágenes de potencia alta y baja de la tachuela y la retina. En varios puntos durante las imágenes de proceso de molienda fueron tomadas con un microscopio de disección, mostrando secciones longitudinales de la tachuela (asterisco) que penetran a través del ojo y que salen de la esclerótica (&#39;S&#39; ), Silicona (hash) y azul de toluidina manchado y la retina sin mancha (&#39;R&#39;) contiguo. Tenga en cuenta estos son sólo imágenes de ejemplo para demostrar la presente técnica de visualización, y no son representativos de todos los implantes o tachuela resultados histológicos inserción epirretinianas. Restos de tierra de los cables de platino son visibles en los paneles AD (&quot;W&quot;). (A) la energía baja, imagen sin mancha de la tachuela penetrar la retina y la esclerótica. (B) Imagen de alta potencia del desprendimiento de retina y plegado en la retina sin mancha adyacente al vehículo de silicona imagen A. (C) Imagen de baja potencia en el centro del eje de rumbo. <strong&gt; (D) Imagen de alta potencia del centro de la tachuela en la imagen C (E) En una muestra independiente, con ninguna compañía de silicona, se muestra una imagen de alta potencia de toluidina retina manchada azul debajo de la empuñadura de la tachuela, inmediatamente antes de moler el eje tachuela (F) toluidina normal azul arquitectura retinal manchada (GCL: capa de células ganglionares de la retina; INL: la capa nuclear interna; ONL: capa nuclear externa; PR: fotorreceptores; T: felino tapetum lucidum). visualizado utilizando la misma técnica de molienda . Las barras de escala en cada panel son: A y C = 2 mm; B y D = 500 m; E = 200 micras; F = 100 micras.

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Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Las técnicas para Ojos Procesamiento implantados con una retina Prótesis para análisis histopatológico localizado: Parte 2 Epirretinal Implantes de retina con tachuelas

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.4K vistas.  Bionics Institute. Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis. 

Video: Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Técnicas de Procesamiento de ojos implantados con una prótesis de retina para el análisis histopatológico localizada

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Investigación

Medicina

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

Cuantitativa del fondo de ojo autofluorescencia para la Evaluación de Enfermedades de la Retina

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Un Paso a Paso Protocolo para la cirugía subretiniana en conejos

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Un modelo agudo de retina para evaluar sanguíneos de la retina barrera violación, así como potenciales fármacos para el tratamiento

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Biotribological Testing and Analysis of Articular Cartilage Sliding against Metal for Implants

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are now available for the shoulder, hip, ankle and the first metatarsalphalangeal joint. While providing pain reduction and clinical improvement, progressive degenerative changes of the opposing cartilage are observed in many patients. The mechanisms leading to this damage are not fully understood. This protocol describes a tribological experiment to simulate a metal-on-cartilage pairing and comprehensive analysis of the articular cartilage. Metal implant material is tested against bovine osteochondral cylinders as a model for human articular cartilage. By applying different loads and sliding speeds, physiological loading conditions can be imitated. To provide a comprehensive analysis of the effects on the articular cartilage, histology, metabolic activity and gene expression analysis are described in this protocol. The main advantage of tribological testing is that loading parameters can be adjusted freely to simulate in vivo conditions. Furthermore, different testing solutions might be used to investigate the influence of lubrication or pro-inflammatory agents. By using gene expression analysis for cartilage-specific genes and catabolic genes, early changes in the metabolism of articular chondrocytes in response to mechanical loading might be detected.

This protocol describes the preparation, biotribological testing, and analysis of osteochondral cylinders sliding against metal implant material. Outcome measures included in this protocol are metabolic activity, gene expression and histology.

Pruebas biotribológicas y análisis de cartílago articular que se desliza contra el metal para implantes

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno para enfermedades retinianas isquémicas en roedores

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Inducción y análisis del estrés oxidativo en células epiteliales pigmentarias de la retina humana transfectadas por transposones de la bella durmiente

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

Sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3D a partir de células madre pluripotentes humanas

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Trasplante de epitelio pigmentario retiniano en un modelo de primate no humano para enfermedades degenerativas de la retina

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...