Este trabajo fue financiado por el Consejo Australiano de Investigación bajo Vinculación del proyecto de subvención LP120100264.

1. Cultura de las neuronas del ganglio espiral <ol><li> Esterilizar pequeñas y redondas (por ejemplo, 10 mm de diámetro) cubreobjetos de vidrio y pinzas curvas en un autoclave. Transfiera los portaobjetos esterilizados en pocillos individuales de una 4-anillo de 35 mm placa de Petri estéril o placa de 4 pocillos, utilizando las pinzas esterilizadas. Aplicar 150 l de poli-L-ornitina (500 mg / ml) y laminina de ratón (0,01 mg / ml) a la superficie superior del cubreobjetos y colocar en una incubadora (37 ° C) durante un máximo de 48 h. Asegúrese de que los cubreobjetos no flotan lejos de la parte inferior del pozo. </li><li> Preparar ml de medio Neurobasal estériles (NBM) 50 para cada cultivo neuronal: 47,5 ml neurobasal A, 0,5 ml de N 2 suplemento, 1 ml de suplemento B27, 0,5 ml de L-glutamina, y 0,5 ml de penicilina-estreptomicina. Nota: Los suplementos pueden ser congelados, almacenados a -20 ° C y se añaden a los medios de comunicación en el día requerido. </li><li> Disociar las neuronas del ganglio espiral de post-natales días 4-7 crías de rata como se describió previamente 20,21, nosción tanto enzimática (0,025% de tripsina y 0,001% de DNasa I) y las técnicas mecánicas. Consulte. Whitlon et al 22 y Vieira et al. 23 para los procedimientos detallados de la cultura ganglio espiral neurona, o Parker et al. 24 para una demostración de aislamiento modiolus. </li><li> Aspirar cualquier solución poly-L-ornithine/laminin restante de los cubreobjetos y se lava brevemente con NBM. </li><li> Añadir 150-200 l de la suspensión de las neuronas del ganglio espiral disociado a los cubreobjetos y colocar en una incubadora (37 ° C, 10% de CO 2). Nota: hasta 20 cubreobjetos se pueden preparar a partir de una camada media de 8 crías de rata. </li><li> Cuatro horas después de las neuronas de chapado, aspirar la solución para eliminar restos de células y reemplazar con 150-200 l calentada NBM fresco. Nota: Los medios pueden requerir la reposición diaria para evitar la deshidratación. </li><li> Cubreobjetos Volver a la incubadora hasta que sea necesario para los registros electrofisiológicos. Nota: Espiral disociadocultivos de neuronas ganglionares se pueden utilizar para los experimentos electrofisiológicos cuatro horas después de la disociación y de hasta dos días a partir de entonces. Tiempo in vitro se debe tomar en cuenta durante el análisis de los resultados. Reponer NBM cada 24 a 48 horas. </li></ol> 2. Preparación para el Patch clamp grabaciones <ol><li> Preparar soluciones <ol><li> Intracelular (micropipeta) solución: 115 mM de K-gluconato, 7 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,05 mM de EGTA, 2 mM de Na 2 ATP, 2 mM de MgATP, 0.5 mM de Na 2 GTP (ajustar el pH a 7,3 con KOH; ajustar a 295 mOsmol / kg con sacarosa). Pasar la solución a través de un filtro estéril (0,2 micras) y se dividen en 200 ml de alícuotas a ser almacenado a -20 ° C hasta el día de la grabación. </li><li> Extracelular (baño) solución: 137 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM de HEPES, 10 mM de glucosa (ajustar a pH 7,4 con NaOH; ajustar a 300-310 mOsm / kg con sacarosa) . Esta solución se hizo en el día de la grabación. </li></ol></li><li> Preparar grabación micropipetas con una resistencia de 2-6 mW. Utilizamos un láser de CO2 extractor (P-2000, Instrumentos de Sutter) y vidrio de borosilicato (diámetro exterior de 1,0 mm, 0,58 mm de diámetro interior, 75 mm de longitud). </li><li> Preparar el láser. Este protocolo está diseñado para su uso con un láser de fibra de acoplamiento, tales como la 1870 nm infrarrojo estimulador del nervio de Optotech P / L. La fibra óptica se utiliza para la entrega de la luz en nuestros experimentos es una fibra de sílice diámetro del núcleo / revestimiento de 200/220 micras con una apertura numérica de 0.22 y conectores FC-PC en ambos extremos (AFW Tecnologías MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). Los cables de conexión se cortaron por la mitad para producir dos trenzas de fibra (es decir, conectorizado en un extremo y se escindió en el otro). Los efectos de diámetro de núcleo de la fibra y la apertura numérica de los cambios de temperatura inducidas por láser se han discutido en detalle por Thompson et al. 25 <ol><li> Cleave la punta de la fibra de distribución de luz usando técnicas estándary asegúrese de que la punta resultante es de alta calidad mediante la observación con un microscopio óptico (es decir, la punta debe ser perpendicular al eje de la fibra plana y aparecerá la inspección visual). Conecte el suministro de luz de fibra a la producción de fibra de acoplamiento del láser estimulación mediante un apropiado a través del conector (por ejemplo Thorlabs ADAFC2). </li><li> Medir la potencia del láser de salida de la punta escindido de la fibra de suministro de luz usando un instrumento apropiado (por ejemplo FieldMate coherente con LM-3 cabezal detector). Se recomienda comprobar la potencia del láser cada vez que la fibra de distribución de luz se corta o se hace un ajuste significativo al láser (por ejemplo, el transporte de un laboratorio a otro). </li><li> Inserte la fibra de suministro de luz en una tirada de fibra o dispositivo equivalente y colocar el plato a la microposicionador apropiado. Es importante ser capaz de determinar con precisión el ángulo θ que la fibra óptica hace con el cubreobjetos. Esta espe se puede medir tomando una fotografía de la disposición experimental y el uso de software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ) para obtener el ángulo. El ángulo θ (o gama de posibles ángulos) está limitada principalmente por las limitaciones espaciales de la disposición experimental - en particular, el microscopio. Los valores típicos de θ en nuestros experimentos (sobre la base de un microscopio vertical) son alrededor de 36 °, sin embargo, el ángulo óptimo puede diferir significativamente de las configuraciones alternativas (por ejemplo, los que utilizan un microscopio invertido). </li><li> Haga las conexiones entre el láser y el sistema de adquisición de datos de patch clamp (por ejemplo Digidata 1440A, Molecular Devices) como se muestra en la Figura 2. La salida digital del sistema de adquisición de datos de patch clamp se debe conectar al láser a través de un generador de función externa, por lo que es posible especificar los parámetros del pulso láser independientes del sistema de adquisición de datos. Alternativamente, esta salida se puede conectar directamente ael controlador de láser (que requiere la longitud del impulso y la tasa de repetición para ser fijados por el software de adquisición de datos). En cualquier caso, la señal utilizada para disparar el láser debe ser conectado de nuevo a una entrada del sistema de adquisición de datos para asegurar que el momento y la duración de los pulsos de láser se pueden grabar simultáneamente con la señal electrofisiológica. </li></ol></li></ol> 3. Patch clamp grabaciones para la Investigación de los INS <ol><li> Llenar el recipiente apropiado del sistema de perfusión con solución extracelular y ajustar la velocidad de flujo para proporcionar la perfusión del baño a una velocidad de 1-2 ml / min. Nosotros utilizamos un sistema de alimentación por gravedad (botella del aspirador, válvula de pinza, y el tubo de PE) con un calentador en línea para permitir el rápido calentamiento de la solución, y una bomba peristáltica para eliminar la solución pasó por succión. </li><li> Coloque un cubreobjetos con las células cultivadas en la cámara de grabación (baño) de un microscopio vertical. Con un objetivo de inmersión en agua de gran aumento (e. G. 40X) y de contraste de fase (por ejemplo contraste diferencial de interferencia o contraste gradiente Dodt), localizar visualmente las neuronas del ganglio espiral dentro de la cultura. Una neurona típica ganglio espiral es fase-brillante, redondo y aproximadamente 15 micras de diámetro con un núcleo prominente, como se muestra en la Figura 1a. </li><li> Una vez que una neurona ha sido localizado, cambiar a un objetivo de aumento menor (por ejemplo, 10 veces) y localizar la neurona diana dentro del campo visual. </li><li> Mueva el suministro de luz de fibra óptica en su posición mediante el siguiente procedimiento (o equivalente): <ol><li> Utilice el microposicionador para mover la fibra de salida hasta que la punta está cerca de la neurona diana en los planos horizontal y vertical. La posición vertical de la punta de la fibra puede ser verificada mediante mover el objetivo arriba y hacia abajo (el enfoque de exploración). </li><li> Cambie de nuevo con el objetivo de gran aumento y la posición de la punta de la fibra óptica en su posición prevista al lado de tque las neuronas (véase la Figura 2 recuadro). Al ajustar la posición vertical de la fibra, es importante que el borde inferior de la fibra está en reposo en (es decir, sólo tocar) el cubreobjetos, para minimizar la incertidumbre en la ubicación de la fibra. La alineación óptima en el plano horizontal dependerá del ángulo θ que la fibra hace con el cubreobjetos y el radio r de la fibra. Con el fin de posicionar la fibra de modo que el centro de la neurona diana se encuentra a lo largo del eje de la fibra, la distancia horizontal entre el borde superior de la fibra y la célula diana debe ser Δ target = r (cosec θ - 2 sen θ), donde los valores negativos indicarían que los voladizos de fibra óptica de la célula. Cuando la alineación de la fibra, una distancia de objetivo Δ entre el borde superior de la fibra y el centro de la neurona se puede lograr aproximadamente por inspección visual. Sin embargo Δ objetivo está diseñado parasólo sirven como una guía aproximada. Colocación de la fibra de tal manera que la distancia real de Δ entre el borde superior de la fibra y el centro de la neurona difiere considerablemente de Δ objetivo (como en la figura 1) puede proporcionar información sobre el efecto de tanto desplazamiento radial (es decir, desde el centro de la haz) y el desplazamiento axial (es decir, a lo largo del eje de la fibra) de la viga con relación a la neurona diana. Por ejemplo, el establecimiento de Δ se esperaría ≈ 0 para aumentar la temperatura local en las proximidades de la célula - es decir, desde el perfil del haz de fibras multimodo típicos se aproxima bien por una distribución de sombrero de copa 26, la disminución de la energía absorbida a nivel local (temperatura) debido al desplazamiento del centro del haz es mínima en comparación con el aumento de la energía absorbida de mover la cara de extremo de la fibra más cerca de la célula. Si bien se debe tener cuidado para posicionar la fibra con la mayor precisión y repetidamente como possible usando señales visuales, la medición precisa de la ubicación de la fibra respecto al objetivo de neurona (por ejemplo, Δ) es de mayor importancia que posicionándolo a una distancia predeterminada. Δ se puede determinar (estimando una incertidumbre máxima de ± 3 m) por análisis de imagen como se describe en el paso 3.8.2 del protocolo. En algunos experimentos 5,8, fuentes de luz blanca se han acoplado a través de la fibra con el fin de apuntar a la celda deseada. Se encontró que este enfoque a ser ineficaz en la configuración de microscopio vertical, como la intensidad de la luz dispersada desde la región diana fue relativamente baja en estos ángulos poco profundas (θ). </li><li> Una vez que la fibra está en la posición, moverlo a cabo por una cantidad conocida para permitir el posicionamiento directo de la micropipeta. La fibra puede entonces ser devuelto a la posición original cuando se consigue una grabación neuronal. </li></ol></li><li> Llene la micropipeta con solución intracelular y en forma segura en su lugar en la cabezataje del amplificador (por ejemplo MultiClamp 700B, Molecular Devices). Uso de tubo conectado a un lado del soporte de microelectrodo, aplicar una pequeña cantidad de presión positiva para evitar la obstrucción de la micropipeta. </li><li> El uso de un micromanipulador, mueva la micropipeta en posición justo por encima de la neurona diana. </li><li> Protocolo para las grabaciones de células enteras: <ol><li> Aplicar a 10 ms, 10 mV impulso rectangular (por ejemplo, prueba de Seal) en el modo de fijación de voltaje del amplificador y ajuste el potencial micropipeta (pipeta de desplazamiento) de la señal de referencia a 0 nA. El ensayo de sellado también se debe utilizar para determinar si la resistencia del microelectrodo es dentro del intervalo deseado (por ejemplo, 2 - 6 mW). </li><li> Mientras que el control de la resistencia, utilizar ajustes finos de la micromanipulador para posicionar suavemente la micropipeta sobre la superficie de la neurona diana. Cuando la micropipeta está en contacto con la neurona, la resistencia aumentará (por ~ 0,5 a 1 mW). Yommediately tras el aumento de la resistencia, eliminar la presión del fluido positivo y aplicar una pequeña presión negativa. Una vez que la resistencia ha pasado 10 a 20 mW, fijar el potencial de membrana a un nivel de mantenimiento (por ejemplo, alrededor de -60 mV). </li><li> La resistencia del electrodo debería seguir aumentando hasta que excede 1 GΩ, lo que significa que un sello efectivo (denominado &#39;gigaseal&#39;) se ha formado entre la membrana celular y la micropipeta. En este punto, eliminar toda la presión de fluido de la micropipeta. </li><li> Una vez se ha formado la gigaseal, usar pulsos cortos de corriente (25 a 100 microsegundos; 1 V) o breves pulsos de presión de fluido negativa a la ruptura de la membrana celular y lograr la configuración de células enteras. </li><li> Registre la capacitancia de la membrana, la resistencia en serie y la resistencia de entrada como se determina a partir de la curva exponencial ajustada a la corriente durante el pulso de ensayo de sellado. Minimizar los transitorios de capacidad mediante el ajuste de los controles CpFast y CpSlow en el amplificador, entonces switcse observa h el amplificador en el modo de célula completa, y compensar la capacitancia y la resistencia hasta que una corriente plana durante el ensayo de sellado. Aplicar compensación de resistencia en serie (corrección ~ 70%; 70% de predicción), ajustar los controles de la capacitancia y la resistencia para mantener un sello de prueba de respuesta plana. </li><li> Cambie al modo de corriente-clamp en el amplificador. Tomar nota del potencial de membrana en reposo (en ausencia de inyección de corriente). Establecer una corriente de retención para estabilizar el potencial de la membrana en el nivel deseado (por ejemplo, -60 mV). Neutralizar la capacitancia pipeta y ajustar el balance de puente para equilibrar la caída de tensión. </li><li> Compruebe las propiedades de disparo de la neurona mediante la estimulación con corriente despolarizante (10 a 200 pA pA en 10 pasos, 300 ms de duración). </li></ol></li><li><ol><li> Mueva la fibra óptica de nuevo en su posición al lado de la neurona. Usando software de imágenes acoplado a una cámara CCD, la captura de imágenes de la posición de la fibra con respecto a la neuro objetivon, centrándose en el plano de la neurona inicialmente, y luego en el borde superior de la fibra óptica (véase la Figura 1). </li><li> Por el posterior análisis de las imágenes resultantes (por ejemplo, Figuras 1b y 1c) es posible determinar con precisión Δ (la posición del borde superior de la fibra óptica con respecto al centro de la neurona diana). Una vez Δ se conoce, parámetros tales como la distancia desde la cara de extremo de la fibra a la neurona diana (a lo largo del eje de la fibra) z y el desplazamiento radial de la neurona desde el centro de la viga δ r se pueden calcular utilizando las relaciones trigonométricas simples: z = r sen 2θ + Δ cos θ δ = r ((r cos 2θ - Δ pecado θ) 2 + Dy 2) 1/2, donde Dy es la distancia entre el eje de la fibra y el centro de la neurona como se ve desde arriba (por ejemplo, SEe Figura 1). El análisis debe tener en cuenta las variaciones de posición de celda en celda, como un conocimiento preciso de estos parámetros de ubicación puede ser requerida para resolver las posibles diferencias entre los procesos de estimulación 25. </li></ol></li></ol> 4. Experimentos INS <ol><li> Durante la grabación de los datos electrofisiológicos en cualquiera de pinza de corriente o configuraciones de fijación de voltaje, ejecute el láser de estimulación a los parámetros deseados (por ejemplo, la energía, la duración del pulso, frecuencia de repetición, etc.) Con nuestro láser, la potencia óptica se controla a través de una entrada directa para el controlador de láser y se especifica manualmente antes de cada grabación. Duración de impulso y frecuencia de repetición pueden ser controladas por cualquiera de un generador de señal externa o el software de adquisición de datos (como se describe en el paso 2.3.4). Asegúrese de que los datos se graban tanto el canal de patch clamp y el canal de disparo láser. </li></ol> Pulsos láser con longitudes que vandesde alrededor de 500 microsegundos a 15 ms y las energías de ~ 0,25 a 5 J por impulso normalmente producir respuestas eléctricas mensurables. Ajuste de la frecuencia de repetición de pulsos de láser a ser de 1 Hz o menos puede ser útil para los experimentos iniciales, ya que reducirá al mínimo los efectos de este parámetro. Los resultados típicos que muestran el cambio en la señal grabada se presentan en la siguiente sección.

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Opt. 18, 035004-0310 (2013).</li><li>Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+temperature+jump+by+infrared+diode+laser+irradiation+for+patch-clamp+studies.">Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies.</a> Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Usando los protocolos descritos en este documento, es posible extraer y cultura neuronas del ganglio espiral y para investigar laser-evocó actividad eléctrica mediante la realización de experimentos de patch clamp de células enteras. Cuando se usa in vitro, la técnica de patch clamp proporciona un nivel de control sobre los parámetros experimentales que no es alcanzable in vivo. Parámetros de estimulación láser, tales como longitud de onda, energía de pulso, duración del pulso, forma del pul...

Los campos de la neurofisiología y médica biónica dependen en gran medida en las técnicas que permiten la estimulación controlable de respuestas eléctricas en el tejido neural. Mientras que la estimulación eléctrica sigue siendo el estándar de oro en la excitación neuronal, que adolece de una serie de inconvenientes tales como la presencia de artefactos de estimulación cuando se graban las respuestas neurales, y la falta de especificidad de la estimulación debido a la propagación de la corriente en el tejido circundante 1. Las últimas dos décadas han visto el desarrollo de técnicas de estimulación mediada ópticamente 2. Varias de estas técnicas requieren la modificación del tejido diana, ya sea a través de la adición de una molécula en particular (por ejemplo, moléculas de jaula) 3 o alguna forma de manipulación genética (por ejemplo, la optogenética) 4, ninguno de los cuales son fáciles de aplicar fuera de un contexto de investigación. De particular interés, por tanto, la estimulación neural infrarrojos (INS), whereby tejido nervioso se excita con luz láser infrarroja pulsada. INS tiene el potencial de superar muchas de las deficiencias de la estimulación eléctrica, permitiendo altamente específica, la estimulación sin contacto de tejido neural 2. Sin embargo, mientras que el INS se ha demostrado con éxito en una variedad de ajustes in vivo, el mecanismo preciso de la excitación sigue siendo incierto. Algunas publicaciones recientes han mostrado un progreso hacia el descubrimiento del mecanismo detrás de INS 5-7. Calentamiento rápido debido a la absorción de la luz láser por el agua parece jugar un papel clave. Sin embargo, más allá de este consenso aún no se ha alcanzado. Shapiro et al. 7 proponen un mecanismo muy general según el cual el calentamiento rápido hace que una perturbación en la distribución de partículas cargadas adyacentes a la membrana celular, que conduce a un cambio en la capacitancia de la membrana celular y la posterior despolarización. Además, Albert et al. 5 afirman que lasecalefacción inducida r activa una clase específica de temperatura canales iónicos sensibles (receptor de potencial transitorio canales vaniloide), permitiendo que los iones pasen a través de la membrana celular. En esta etapa no está claro cómo se combinan estos mecanismos, o incluso si hay otros factores que aún no se han identificado. Aunque un pequeño número de publicaciones (referencias 5,7-9) han investigado INS in vitro, la gran mayoría de los trabajos publicados en este campo se ha llevado a cabo in vivo (por ejemplo, referencias 1,6,10-18). Estimulación de las neuronas auditivas infrarrojos ha sido un área de particular interés, debido a las potenciales aplicaciones en implantes cocleares 10,14-18. Mientras que en experimentos in vivo son importantes para verificar la eficacia de la técnica en diversos entornos, el aumento del nivel de control proporcionado por los estudios in vitro se espera que conduzca a una comprensión más detallada del mecanismonismo responsable de INS. Este informe describe la preparación de cultivos de neuronas del ganglio espiral para las investigaciones de patch clamp, ya que estos pueden ser utilizados para estudiar los mecanismos fundamentales mientras que también une a la gran cantidad de datos existentes en el sistema auditivo. La técnica de patch clamp es una excelente herramienta para la investigación de los fenómenos electrofisiológicos, proporcionando un medio de registro de la actividad eléctrica en las células individuales y el estudio de la contribución de las corrientes subyacentes individuales 19. Cuando esta técnica se aplica a un establo en la preparación in vitro de neuronas primarias, como las neuronas del ganglio espiral cultivadas, ofrece la oportunidad de estudiar en profundidad los mecanismos por los que la actividad neuronal es controlada y manipulada. Los protocolos especificados en este trabajo se resumen los métodos para investigar el efecto de la estimulación con láser en las propiedades eléctricas de las neuronas del ganglio espiral a través de patch clampgrabaciones. El enfoque se basa en un láser de fibra de acoplamiento en lugar de un láser en el espacio libre, que permite un funcionamiento más seguro, así como más fácil y más repetible alineación sin la necesidad de modificar la configuración de microscopio estándar. Sobre la base de estos protocolos, debería ser posible llevar a cabo una amplia gama de experimentos con el fin de determinar más claramente el mecanismo o los mecanismos detrás de INS.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Cell culture materials and equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass coverslips</td>
 <td>Lomb Scientific</td>
 <td>CSC 10 1 GP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-ring cell culture dish </td>
 <td>VWR International</td>
 <td>82050-542</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-ornithine solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4957</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laminin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>23017-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved forceps</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14101</td>
 <td>Dumont #5 tweezers (45&deg; angle tip)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 Incubator</td>
 <td>ThermoScientific</td>
 <td>Heracell 150i</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Cell culture materials and equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Neurobasal media</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal A</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10888-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N-2 supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27 serum-free supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140-148</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>25030-149</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular solution</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4034</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium D-gluconate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G4500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E3889</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaGTP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8877</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium hydroxide</td>
 <td>LabServ</td>
 <td>BSPPL738.500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sucrose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S8501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Extracellular solution </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>310166</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4034</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383147</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M8266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium hydroxide</td>
 <td>LabServ</td>
 <td>BSPSL740.500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sucrose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S8501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>Zeiss </td>
 <td>AxioExaminerD1</td>
 <td>Equipped with Dodt contrast </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water-immersion objective</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platform and X-Y stage </td>
 <td>ThorLabs</td>
 <td>Burleigh Gibraltar</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Recording chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>RC-26G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vibration isolation table</td>
 <td>TMC</td>
 <td>Micro-g 63-532</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD Camera</td>
 <td>Diagnostic Instruments</td>
 <td>RT1200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Camera software</td>
 <td>Diagnostic Instruments</td>
 <td>SPOT Basic</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In-line solution heater</td>
 <td>Warner</td>
 <td>SH-27B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature controller</td>
 <td>Warner</td>
 <td>TC-324B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Patch clamp amplifier</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Multiclamp 700B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Patch clamp data acquisition system</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Digidata 1440A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micromanipulator</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>MPC-325</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette glass</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>GBF100-58-15</td>
 <td>Borosilicate glass with filament</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette Puller</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P2000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Recording Software</td>
 <td>AxoGraph</td>
 <td></td>
 <td>Lab pack and electrophysiology tools</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator bottle</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>CLS12201L</td>
 <td>1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE Tubing</td>
 <td>Harvard</td>
 <td>PolyE #340</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Masterflex peristaltic pump</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>HV-07554-85</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3.Patch clamp equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,870 nm laser diode</td>
 <td>Optotech</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200/220 &mu;m diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)</td>
 <td>AFW Technologies</td>
 <td>MM1-FC2-200/220-5-C-0.22</td>
 <td>Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber through connector (FC/PC)</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>ADAFC2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber cleaver</td>
 <td>EREM</td>
 <td>FO1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) </td>
 <td>Siemens</td>
 <td></td>
 <td>For removing optical fiber jacket</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)</td>
 <td>Siemens</td>
 <td></td>
 <td>For removing outer coating of patch cord</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Signal generator</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber positioner</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber chuck</td>
 <td>Newport</td>
 <td>FPH-DJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser power meter and detector head</td>
 <td>Coherent</td>
 <td>FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Laser equipment.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation

Se ha demostrado en los últimos años que la luz láser pulsado, infrarrojos puede ser utilizado para provocar respuestas eléctricas en el tejido neural, independiente de cualquier modificación adicional del tejido diana. Estimulación neural de infrarrojos ha sido reportado en una variedad de tejido neural periférica y sensorial in vivo, con particular interés se muestra en la estimulación de las neuronas en el nervio auditivo. Sin embargo, mientras que el INS se ha demostrado que funciona en esta configuración, el mecanismo (o mecanismos) por el cual la luz infrarroja provoca excitación neuronal está actualmente no se entiende bien. El protocolo presentado aquí describe un método de patch clamp de célula completa diseñada para facilitar la investigación de la estimulación neural de infrarrojos en las neuronas auditivas primarias cultivadas. Al caracterizar a fondo la respuesta de estas células a la iluminación láser infrarrojo in vitro bajo condiciones controladas, puede ser posible obtener una mejor comprensión de la Physica fundamentall y procesos bioquímicos subyacentes estimulación neural infrarrojos.

Las neuronas del ganglio espiral responden a la iluminación con láser de formas de onda en tanto repetible de fijación de voltaje y configuraciones de grabación actual-clamp. Figura 3a muestra los cambios típicos en el flujo de corriente a través de una membrana celular en respuesta a un 2,5 mseg, 0,8 mJ láser de pulso (respuesta promedio de 6 pulsos de láser, que se repite en intervalos de 1 seg) con el potencial de membrana se celebró en -70 mV, -60 mV y -50 mV. Corrientes de entrada netos se...

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Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

La estimulación del nervio infrarrojos ha sido propuesta como una alternativa a la estimulación eléctrica en una gama de tipos de nervios, incluyendo los asociados con el sistema auditivo. Este protocolo describe un método de patch clamp para estudiar el mecanismo de estimulación nerviosa de infrarrojos en un cultivo de neuronas auditivas primarias.

Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

whole-cell-patch-clamp-for-investigating-mechanisms-infrared-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.8K vistas.  Swinburne University of Technology. La estimulación del nervio infrarrojos ha sido propuesta como una alternativa a la estimulación eléctrica en una gama de tipos de nervios, incluyendo los asociados con el sistema auditivo. Este protocolo describe un método de patch clamp para estudiar el mecanismo de estimulación nerviosa de infrarrojos en un cultivo de neuronas auditivas primarias.

Video: Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates of associative learning 1-5. In these studies, it is important to provide behavioral evidence of conditioning to verify that differences in brain activity are learning-related and correlated with human behavior. 
Fear conditioning studies often monitor autonomic responses (e.g. skin conductance response; SCR) as an index of learning and memory 6-8. In addition, other behavioral measures can provide valuable information about the learning process and/or other cognitive functions that influence conditioning. For example, the impact unconditioned stimulus (UCS) expectancies have on the expression of the conditioned response (CR) and unconditioned response (UCR) has been a topic of interest in several recent studies 9-14. SCR and UCS expectancy measures have recently been used in conjunction with fMRI to investigate the neural substrates of aware and unaware fear learning and memory processes 15. Although these cognitive processes can be evaluated to some degree following the conditioning session, post-conditioning assessments cannot measure expectations on a trial-to-trial basis and are susceptible to interference and forgetting, as well as other factors that may distort results 16,17 .
Monitoring autonomic and behavioral responses simultaneously with fMRI provides a mechanism by which the neural substrates that mediate complex relationships between cognitive processes and behavioral/autonomic responses can be assessed. However, monitoring autonomic and behavioral responses in the MRI environment poses a number of practical problems. Specifically, 1) standard behavioral and physiological monitoring equipment is constructed of ferrous material that cannot be safely used near the MRI scanner, 2) when this equipment is placed outside of the MRI scanning chamber, the cables projecting to the subject can carry RF noise that produces artifacts in brain images, 3) artifacts can be produced within the skin conductance signal by switching gradients during scanning, 4) the fMRI signal produced by the motor demands of behavioral responses may need to be distinguished from activity related to the cognitive processes of interest. Each of these issues can be resolved with modifications to the setup of physiological monitoring equipment and additional data analysis procedures. Here we present a methodology to simultaneously monitor autonomic and behavioral responses during fMRI, and demonstrate the use of these methods to investigate aware and unaware memory processes during fear conditioning.

A methodology to investigate the neural mechanisms that support aware and unaware memory processes during fear conditioning is described. This method monitors blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging, skin conductance response, and unconditioned stimulus expectancy during Pavlovian fear conditioning to assess the neural correlates of distinct memory processes.

Investigar los mecanismos neurales de la memoria del miedo consciente e inconsciente con fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

Investigación

Neurociencias

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...