이 작품은 연계 프로젝트 부여 LP120100264 아래의 호주 연구위원회에 의해 지원되었다.

1. 나선 신경절 신경 세포의 배양 <ol><li> 오토 클레이브의 작은 원형 (예를 들어 10mm 직경) 유리 coverslips는과 곡선 집게를 소독. 소독 집게를 사용하여 멸균 4-링 35mm 페트리 접시 또는 4 - 웰 플레이트의 각 우물에 살균 coverslips를 전송합니다. 최대 48 시간에 대한 배양기에서 coverslip을과 장소의 표면 (37 ° C)에 폴리-L-오르니 틴 (500 ㎍ / ㎖) 및 마우스 라미닌 (0.01 밀리그램 / ML) 150 μl를 적용합니다. coverslips를이 우물의 바닥에서 멀리 떠하지 않도록 확인하십시오. </li><li> 47.5 ML neurobasal, 0.5 ML N 2 보충, 1 ML B27 보충제, 0.5 ML의 L-글루타민, 0.5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신 : 각 신경의 문화에 대한 50 ML 멸균 Neurobasal 미디어 (NBM)를 준비합니다. 참고 : 보조 식품을 냉동 할 수 -20 ° C에 저장하고 필요한 날에 미디어에 추가됩니다. </li><li> 이전에 20,21 설명 된대로 출생 후 하루 4-7 쥐 새끼에서 나선 신경절 신경 세포를 떼어 놓다, 우리효소 (0.025 % 트립신 0.001 % DNase의 I) 및 기계 기술을 모두 ING. Whitlon 등. 22 비에이라 등. 23을 참조 modiolus 격리 시위 나선 신경절 신경 세포의 문화 나 파커 등. 24 자세한 절차. </li><li> coverslips는 남아있는 모든 poly-L-ornithine/laminin 솔루션을 기음과 NBM과 함께 간단히 씻는다. </li><li> 인큐베이터 (37 ° C, 10 % CO 2)에 coverslips를 제자리에 해리 나선 신경절 신경 세포 현탁액 150 ~ 200 μl를 추가합니다. 참고 : 최대 20의 coverslips는 8 쥐 새끼의 평균 쓰레기에서 준비 할 수 있습니다. </li><li> 네 시간 도금 뉴런 후, 세포 파편을 제거하고 150 ~ 200 ㎕의 예열 신선한 NBM으로 대체 할 솔루션을 대기음. 참고 : 미디어 탈수를 방지하기 위해 매일 보충이 필요할 수 있습니다. </li><li> 전기 생리학 녹음에 필요한 때까지 배양기에 coverslips를 반환합니다. 참고 : 해리 나선형신경절 신경 세포 배양 사시간 분리 후 이후 최대 두 개의 일을위한 전기 생리학 실험에 사용할 수 있습니다. 생체 시간은 결과의 분석에서 고려되어야한다. 모든 24-48 시간을 NBM 보충. </li></ol> 2. 패치 클램프 녹음을위한 준비 <ol><li> 솔루션을 준비 <ol><li> 세포 (마이크로 피펫) 해결책 : 115 mM의 K-글루코 네이트, 7 mM의 KCl을, 10 MM의 HEPES, 0.05 mM의 EGTA, 2 개 mm 나 2 ATP, MgATP 2 밀리미터, 0.5 밀리미터 나 2 GTP (KOH로 pH를 7.3로 조정, 295 조정 자당과 mOsmol 원 / kg). 살균 필터 (0.2 μm의)를 통해 솔루션을 전달하고 기록의 날까지 -20 ° C에 저장할 수 200 μL의 aliquots로 나눕니다. </li><li> 세포 (목욕) 해결책 : 137 mM의 NaCl을 5 mM의 KCl을, 2 MM의 염화칼슘 2, 1 mM의 MgCl 2, 10 MM의 HEPES, 10 mM의 포도당 (수산화 나트륨으로 pH를 7.4로 조정, 자당과 300-310 mOsmol / kg의 조정) . 이 솔루션은 기록의 날에 이루어집니다. </li></ol></li><li> MΩ 2-6의 저항을 녹음 마이크로 피펫을 준비합니다. 와 붕규산 유리 (1.0 mm 외경, 0.58 mm 내경, 75mm 길이), 우리는 CO 2 레이저 풀러 (서터 악기 P-2000)을 사용합니다. </li><li> 레이저를 준비합니다. 이 프로토콜은 OptoTech P / L.에서 같은 1,870 nm의 적외선 신경 자극 등의 섬유 결합 레이저와 함께 사용하기위한 것입니다 우리의 실험에서 빛 전달에 사용되는 광섬유 양단에 수치 0.22의 조리개와 FC​​-PC 커넥터와 220분의 200 μm의 코어 / 클래딩 직경의 실리카 섬유 (AFW 기술 MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). 패치 코드는 두 개의 광섬유 떠꺼머리 (즉, 한 쪽 끝에서 커넥터 처리 및 기타에 죽습) 생산 반으로 잘라되었다. 섬유 중핵 직경과 레이저 유도 온도 변화에 개구의 효과는 톰슨 등으로 자세하게 설명되어있다. 25 <ol><li> 베기 표준 기술을 사용하여 빛을 전달 섬유의 끝그리고 그 결과로 끝이 광학 현미경 (즉, 끝이 섬유 축에 수직 및 육안 검사에 평평하게 나타납니다)과 관찰 고품질 있는지 확인합니다. 커넥터 (예 : THORLABS ADAFC2)를 통해 적절한 사용하여 자극 레이저 섬유 커플 링 출력에 빛을 전달 섬유를 연결합니다. </li><li> 적절한 악기 (LM-3 검출기 머리 예를 들어, 일관된 FieldMate)를 사용하여 빛을 전달 섬유의 절단 된 끝에서 출력 레이저 파워를 측정한다. 그것은 레이저 전원에게 빛을 ​​전달 섬유 쪼개거나 중요한 조정 (예를 들어, 하나의 실험실에서 다른 교통 수단) 레이저로 만든 때마다 확인하는 것이 좋습니다. </li><li> 섬유 척 또는 이와 동등한 장치 부착 적절한 micropositioner에 척으로 빛을 전달 섬유를 삽입합니다. 그것은 정확하게 광섬유 coverslip을 함께 만드는 θ 각도를 결정하는 것이 중요하다. 이 ANGLE는 실험 배치의 사진을 촬영 각도를 얻기 위해 이미지 처리 소프트웨어 (예를 들어 ImageJ에)를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 특히 현미경 - 각도 θ (또는 가능한 각도 범위)는 기본적으로 실험 배치의 공간적 한계에 의해 제한됩니다. 우리의 실험에서 θ의 전형적인 값 (직립 현미경에 따라) 36 °의 주위에, 그러나 최적의 각도 (거꾸로 현미경을 사용하는 예를 들어) 다른 설정에 대해 상당히 다를 수 있습니다. </li><li> 레이저와 그림 2와 같이 패치 클램프 데이터 수집 시스템 (예 : Digidata 1440A, 분자 장치) 사이의 연결을 확인합니다. 패치 클램프 데이터 수집 시스템에서 디지털 출력이 가능한 데이터 수집 시스템의 독립적 인 레이저 펄스 매개 변수를 지정하고, 외부 함수 발생기를 통해 레이저에 연결해야합니다. 또는이 출력에 직접 연결할 수 있습니다레이저 드라이버 (펄스 길이와 반복 속도는 데이터 수집 소프트웨어에 의해 설정 될 필요). 어느 경우 레이저를 트리거하는 데 사용되는 신호는 레이저 펄스의 타이밍과 길이는 전기 생리학 신호를 동시에 기록 할 수 있도록 데이터 수집 시스템의 입력으로 연결되어야합니다. </li></ol></li></ol> 3. INS의 조사를위한 패치 클램프 녹음 <ol><li> 세포 용액으로 관류 시스템의 적절한 컨테이​​너를 채우고 1-2 ML / 분의 속도로 목욕 관류를 제공하기 위해 유량을 조정합니다. 우리는 솔루션의 신속한 가열 및 흡입에 의해 소비 용액을 제거하기 위해 연동 펌프를 사용하려면 인라인 히터 중력 공급 시스템 (흡인기 병, 핀치 밸브 및 PE 튜브)를 사용합니다. </li><li> 직립 현미경의 기록 챔버 (화장실)에 배양 세포로 coverslip을 배치합니다. 높은 배율 물 침지 목표 (E 사용40X. g.) 및 위상 대비 (예를 들어, 미분 간섭 대비 또는 Dodt 그라데이션 대비), 시각 문화 내에서 나선 신경절 뉴런을 찾습니다. 그림 1a와 같이 전형적인 나선 신경절 신경 세포는 저명한 핵을 가진 직경 위상 밝고, 둥근 약 15 μm의 수 있습니다. </li><li> 신경 세포가 위치되면, 낮은 배율 목표 (예를 들어, 10X)로 전환 시야 내의 표적 신경 세포를 찾습니다. </li><li> 다음 절차를 (또는 이에 상응하는)를 사용하여 위치에 빛을 전달 광섬유로 이동 : <ol><li> 끝이 수평 및 수직 평면 모두에서 대상 뉴런에 가까운 때까지 출력 섬유를 이동하는 micropositioner를 사용합니다. 섬유 끝의 수직 위치는 목표를 위아래로 이동 (포커스를 스캐닝)하여 확인할 수 있습니다. </li><li> 높은 배율의 목표로 전환하고 t 옆에 의도 한 위치에 광섬유의 끝 위치그는 신경 세포 (그림 2 그림 참조). 섬유의 수직 위치를 조정하면, 섬유의 아래쪽 가장자리는 섬유의 위치에 불확실성을 최소화하기 위해 coverslip을 (즉, 그냥 터치)에 휴식하는 것이 중요합니다. 수평면에서 최적의 정렬은 섬유가 coverslip에와 섬유 R의 반경 만드는 θ 각도에 따라 달라집니다. 대상 신경 세포의 중심이 섬유 축 방향으로 놓 이도록 섬유를 배치하기 위해, 섬유의 상부 가장자리와 대상 셀 사이의 수평 거리가 있어야한다 Δ 대상 = R (cosec θ - 2 죄 θ) 음의 값을 나타냅니다 곳 광섬유 돌출 셀. 섬유를 정렬 할 때, 섬유의 위쪽 가장자리와 신경 세포의 중심 사이의 Δ 대상의 거리가 약 육안 검사에 의해 달성 될 수있다. 그러나 Δ 대상은하도록 설계단지 일반적인 지침 역할을합니다. 섬유의 상부 가장자리와 신경 세포의 중심 사이의 실제 거리 Δ는 Δ 대상 (그림 1에서와 같이)에서 잴 다릅니다 같은 섬유를 배치하여 중앙에서 모두 반경 변위 (즉, 효과에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다 대상 신경 세포에 비해 빔의 빔)과 축 변위 (섬유 축 방향 즉,). 전형적인 멀티 모드 섬유를위한 빔 프로파일을 잘 모자 분포 26, 로컬 흡수 에너지 (온도)의 감소에 의해 근사하기 때문에 즉 - 예를 들어, Δ 설정 ≈ 0은 셀의 주변에있는 지역의 온도가 증가 할 것으로 예상된다 빔의 중심에서 변위로 인해 가까운 셀 섬유의 단면을 움직이는 흡수 에너지의 증가에 비해 최소화됩니다. 주의가 정확하게 그리고 반복적으로 PO와 같은 섬유의 위치를​​ 이동해야하지만시각적 단서, 대상 뉴런 (예 : Δ)에 비해 섬유 위치의 정확한 측정을 사용하여 ssible은 소정 거리 멀리 위치를보다 더 중요하다. 프로토콜의 단계 3.8.2에 설명 된대로 Δ는 이미지 분석 (± 3 ㎛의 예상 최대 불확실성)를 정의 할 수 있습니다. 일부 실험 5,8에 흰색 빛 소스는 원하는 세포를 표적으로하기 위하여 섬유를 결합되었다. 이 방법은 대상 지역에서 산란되는 빛의 강도가이 얕은 각도 (θ)에서 상대적으로 낮은 때, 직립 현미경 설정에서 효과 것으로 나타났다. </li><li> 섬유가 위치에 오면, 마이크로 피펫의 간단한 위치를 사용하려면 알려진만큼 그것을 밖으로 이동합니다. 섬유는 후 신경 녹음이 달성 원래 위치로 반환 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 세포 내 용액을 마이크로 피펫을 기입하고 안전하게 머리에 장소에 적합앰프의 다케 (예 : Multiclamp 700B, 분자 장치). 미세 전극 홀더의 측면에 부착 된 튜브를 사용하여 마이크로 피펫의 막힘을 방지하기 위해 긍정적 인 압력의 작은 금액을 적용합니다. </li><li> micromanipulator에 사용, 단지 목표 뉴런 위의 위치에 micropipette를 이동합니다. </li><li> 전체 세포 레코딩을위한 프로토콜 : <ol><li> 증폭기의 전압 클램프 모드에서 10 밀리, +10 MV 구형파 펄스 (예를 들어, 인감 시험)을 적용하고 0 nA의에 기준 신호의 마이크로 피펫 잠재력 (피펫 오프셋)를 조정합니다. 도장 검사는 미세 전극의 저항이 원하는 범위 (- MΩ 6 예 2) 내에 있는지 여부를 결정하는 데 사용되어야한다. </li><li> 저항을 모니터링하면서, 조심스럽게 대상 신경 세포의 표면에 마이크로 피펫의 위치를​​ 미세 조작기의 미세 조정을 사용합니다. 마이크로 피펫은 신경 세포와 접촉 할 때, 저항 (~ 0.5-1 MΩ)에 의해 증가 할 것이다. 나는mmediately 저항 증가에 이어, 긍정적 인 유체 압력을 제거하고 작은 부정 압력을 적용합니다. 일단 저항 10를 통과했다 - 20 MΩ, 지주 레벨 (-60 MV 정도 등)에 대한 잠재적 멤브레인을 고정합니다. </li><li> 그것은 1 GΩ을 초과 할 때까지 전극의 저항은 효과적인 밀봉 ( &#39;gigaseal&#39;라고)가 세포막과 마이크로 피펫 사이에 형성되었음을 의미, 계속 증가한다. 이 시점에서, 마이크로 피펫에서 모든 유체 압력을 제거합니다. </li><li> gigaseal가 형성되면, 짧은 전류 펄스 (25-100 마이크로 초, +1 V)를 사용하거나 파열 세포막에 부정적인 유체 압력의 짧은 펄스 및 전체 셀 구성을 얻을 수 있습니다. </li><li> 막 커패시턴스, 직렬 저항과 씰 테스트 펄스와 현재에 장착 지수 곡선에서 결정되는 입력 저항을 기록합니다. 다음 switc, 앰프 CpFast 및 CpSlow 컨트롤을 조정하여 용량 과도을 최소화H는 전체 셀 모드로 증폭기, 평면 현재까지 커패시턴스와 저항을 보정은 물개 시험 중에 관찰된다. 평면 테스트 씰 응답을 유지하기 위해 용량과 저항 컨트롤을 조정, 직렬 저항 보상 (70 % 예측 ~ 70 % 보정)를 적용. </li><li> 앰프 전류 클램프 모드로 전환합니다. 휴식 막 잠재력 (전류 주입의 부재)을 기록해 두십시오. 원하는 수준 (예 : -60 MV)에서 막 잠재력을 안정 잡고 전류를 설정합니다. 피펫 용량을 중화하고 전압 강하를 균형 다리의 밸런스를 조정합니다. </li><li> (; 300 밀리 초 지속 시간 +10 펜실바니아 단계 10-200 PA) 현재의 탈분극과 자극에 의​​해 신경 세포의 발화 특성을 확인합니다. </li></ol></li><li><ol><li> 신경 옆에 위치에 광섬유를 다시 이동합니다. CCD 카메라에 연결된 이미징 소프트웨어를 사용하여 대상 신경과 관련하여 섬유의 위치의 이미지를 캡처N, 광 섬유 (그림 1 참조)의 상단 가장자리에 다음 초기 신경 세포의 평면에 초점을합니다. </li><li> 결과 이미지의 후속 분석 (예를 들어, 그림의 1B 및 1C)에 의해 정확하게 Δ를 (대상 신경 세포의 중심에 광섬유 상대의 위쪽 가장자리의 위치)을 결정 할 수 있습니다. 일단 Δ가 알려져 같은 섬유 단면에서 대상 신경 세포 (섬유 축) Z와 빔 δ의 R의 중심에서 신경 세포의 반경 방향 변위까지의 거리 등의 매개 변수는 간단한 삼각 관계를 사용하여 계산 될 수있다 : Z = R 죄 2θ + Δ COS θ δ R = ((R COS 2θ - Δ 죄 θ) 2 + ΔY 2) 1 / 2, ΔY는 섬유 축 이상에서와 같이 신경 세포의 중심 사이의 거리입니다 (예 : SE전자 그림 1). 이러한 위치 매개 변수의 정확한 지식이 자극 공정 25의 가능한 차이를 해결해야 할 수 있으므로 분석은 셀에서 셀에 계정 위치 변화를 고려한다. </li></ol></li></ol> 4. INS 실험 <ol><li> 현재 클램프 또는 전압 클램프 구성 중 하나에있는 전기 생리학 데이터를 기록하는 동안, 원하는 매개 변수 (예 : 전력, 펄스 길이, 반복 속도 등)에 자극 레이저를 실행합니다. 우리의 레이저, 광 파워는 레이저 드라이버로 직접 입력을 통해 제어되며 각 기록하기 전에 수동으로 지정됩니다. 펄스 길이와 반복 속도는 외부 신호 발생기 또는 데이터 수집 소프트웨어 (같은 단계 2.3.4에 설명) 중 하나에 의해 제어 할 수 있습니다. 데이터가 패치 클램프 채널과 레이저 트리거 채널 모두에서 기록되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 다양한 길이의 레이저 펄스약 500 마이크로 초에서 15 밀리와 펄스 당 ~ 0.25-5 엠제이의 에너지에서 일반적으로 측정 전기 반응을 얻을 수 있습니다. 그것은이 매개 변수의 영향을 최소화 할 수 있기 때문에 1 또는 50Hz이어야 레이저 펄스의 반복 속도를 설정하면, 초기 실험에 유용 할 수 있습니다. 기록 된 신호의 변화를 보여주는 전형적인 결과는 다음 절에 제시되어있다.

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S., Kollmar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+stimulation+of+neurite+outgrowth+in+a+serum-free+culture+of+spiral+ganglion+neurons+from+adult+mice.">Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice.</a> Hearing Research. 230, 17-23 (2007).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti.</a> J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation.">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).</li><li>Snyder, A. W., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Waveguide Theory. , (1983).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation.">Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).</li><li>Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+temperature+jump+by+infrared+diode+laser+irradiation+for+patch-clamp+studies.">Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies.</a> Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 문서에 설명 된 프로토콜을 사용하면 추출 문화 나선 신경절 신경 세포 및 전체 세포 패치 클램프 실험을 수행하여 레이저 유발 전기적 활동을 조사 할 수 있습니다. 체외에서 사용할 경우, 패치 클램프 기술은 생체 내에서 달성 할 수없는 실험 매개 변수의 제어 수준을 제공합니다. 같은 파장, 펄스 에너지, 펄스 길이, 펄스 모양과 펄스 반복 시퀀스로 레이저 자극 매개 변수는 재?...

신경 생리학 및 의학 생체 공학의 분야는 신경 조직에 전기 반응의 제어 자극 할 수 있도록 기술에 크게 의존하고 있습니다. 전기 자극은 신경 자극의 황금 표준 남아있는 동안 신경 반응 및 조직 1 주변에 현재의 확산으로 인해 자극 특이성의 부족을 녹음 할 때, 그것은 이러한 자극 유물의 존재와 같은 단점의 숫자에서 겪고있다. 지난 수십 년간 광학 매개 자극 기술 2의 개발을 보았다. 이러한 기술 중 일부는 특정 분자의 추가 (예 갇힌 분자) 3 연구 설정 밖에서 쉽게 적용 할 수있다 어느 것도 유전자 조작의 일부 형태 (예를 들어 optogenetics 4)를 통해, 표적 조직의 수정이 필요합니다. 특히 관심을 따라서 적외선 신경 자극 (INS), whereb는Y 신경 조직은 펄스 적외선 레이저 빛에 의해 흥분됩니다. INS는 신경 조직 2의 매우 구체적인, 비 접촉 자극을 가능하게하여 전기 자극의 많은 단점을 극복 할 수있는 잠재력이있다. INS가 성공적으로 생체 내에서 다양한 설정에서 설명하고있는 동안 그러나, 여기의 정확한 메커니즘은 불확실 남아있다. 최근 일부 서적은 5-7 INS 뒤에 메커니즘을 폭로으로 진행 상황을 보여 주었다. 물에 의해 레이저 빛의 흡수에 의한 급속한 난방은 중요한 역할을 나타납니다. 그러나이 넘어 합의가 아직 도달 할 수있다. 샤피로 등. 7 빠른 가열 세포막과 이후의 탈분극의 정전 용량의 변화를 선도 세포막에 인접한 하전 입자의 분포에 교란을 일으키는 원인이 그것에 매우 일반적인 메커니즘을 제안한다. 또한, 알버트 등은 5.는 LASE를 주장R 유도 가열은 이온이 세포막을 통과 할 수 있도록 온도에 민감한 이온 채널 (일시적인 수용체 잠재적 인 vanilloid 채널)의 특정 클래스를 활성화합니다. 이 단계에서 그것을 식별 할 수 아직 추가 요소가 있는지 여부를 실제로 이러한 메커니즘을 결합하는 방법 불분명하거나. 출판물의 작은 수 (참조 5,7-9) 체외에서 INS를 조사했지만,이 분야에서 출판 작업의 대부분은 (예를 들어, 참조 1,6,10-18) 생체 내에서 실시되었습니다. 청각 신경의 적외선 자극 인공 와우 10,14-18의 잠재적 인 응용 프로그램 때문에 특별한 관심의 영역이다. 생체 내 실험에서 다양한 설정의 기술, 생체 연구에 의해 여유 컨트롤의 증가 수준 기계화에 대한 자세한 이해로 이어질 것으로 예상된다의 효과를 확인하기 위해 중요하지만INS에 대한 책임 anism. 이 보고서는이 또한 청각 시스템에서 기존 데이터의 큰 바디에 연결하는 동안 기본 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 패치 클램프 수사 배양 나선 신경절 신경 세포의 준비에 대해 설명합니다. 패치 클램프 기술은 단일 세포의 전기적 활동을 기록하는 수단을 제공하고 각각의 기본 전류 (19)의 기여를 공부하고, 전기 생리학 현상의 연구를위한 훌륭한 도구입니다. 이 기술은 같은 양식 나선 신경절과 같은 기본 뉴런의 체외 준비에 안정적으로 적용하면 깊이 신경 활동을 통제하고 조작하는 메커니즘을에서 공부 할 수있는 기회를 제공합니다. 패치 클램프를 통해 나선형 신경절 신경 세포의 전기적 특성에 레이저 자극의 효과를 조사이 작품 개요 방법에 지정된 프로토콜녹음. 접근 방식은 표준 현미경 구성을 수정할 필요없이 안전 운전뿐만 아니라보다 쉽고 반복적 인 정렬을 허용, 오히려 자유 공간 레이저보다 섬유 결합 레이저를 기반으로합니다. 이러한 프로토콜의 기초에, 그것은 더 명확 INS 뒤에 기계 또는 기계 장치를 결정하기 위해 실험의 넓은 범위를 수행 할 수 있어야한다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Cell culture materials and equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass coverslips</td>
 <td>Lomb Scientific</td>
 <td>CSC 10 1 GP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-ring cell culture dish </td>
 <td>VWR International</td>
 <td>82050-542</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-ornithine solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4957</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laminin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>23017-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved forceps</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14101</td>
 <td>Dumont #5 tweezers (45&deg; angle tip)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 Incubator</td>
 <td>ThermoScientific</td>
 <td>Heracell 150i</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Cell culture materials and equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Neurobasal media</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal A</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10888-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N-2 supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27 serum-free supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140-148</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>25030-149</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular solution</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4034</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium D-gluconate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G4500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E3889</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaGTP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8877</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium hydroxide</td>
 <td>LabServ</td>
 <td>BSPPL738.500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sucrose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S8501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Extracellular solution </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>310166</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4034</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383147</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M8266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium hydroxide</td>
 <td>LabServ</td>
 <td>BSPSL740.500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sucrose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S8501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>Zeiss </td>
 <td>AxioExaminerD1</td>
 <td>Equipped with Dodt contrast </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water-immersion objective</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platform and X-Y stage </td>
 <td>ThorLabs</td>
 <td>Burleigh Gibraltar</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Recording chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>RC-26G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vibration isolation table</td>
 <td>TMC</td>
 <td>Micro-g 63-532</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD Camera</td>
 <td>Diagnostic Instruments</td>
 <td>RT1200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Camera software</td>
 <td>Diagnostic Instruments</td>
 <td>SPOT Basic</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In-line solution heater</td>
 <td>Warner</td>
 <td>SH-27B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature controller</td>
 <td>Warner</td>
 <td>TC-324B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Patch clamp amplifier</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Multiclamp 700B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Patch clamp data acquisition system</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Digidata 1440A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micromanipulator</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>MPC-325</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette glass</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>GBF100-58-15</td>
 <td>Borosilicate glass with filament</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette Puller</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P2000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Recording Software</td>
 <td>AxoGraph</td>
 <td></td>
 <td>Lab pack and electrophysiology tools</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator bottle</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>CLS12201L</td>
 <td>1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE Tubing</td>
 <td>Harvard</td>
 <td>PolyE #340</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Masterflex peristaltic pump</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>HV-07554-85</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3.Patch clamp equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,870 nm laser diode</td>
 <td>Optotech</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200/220 &mu;m diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)</td>
 <td>AFW Technologies</td>
 <td>MM1-FC2-200/220-5-C-0.22</td>
 <td>Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber through connector (FC/PC)</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>ADAFC2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber cleaver</td>
 <td>EREM</td>
 <td>FO1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) </td>
 <td>Siemens</td>
 <td></td>
 <td>For removing optical fiber jacket</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)</td>
 <td>Siemens</td>
 <td></td>
 <td>For removing outer coating of patch cord</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Signal generator</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber positioner</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber chuck</td>
 <td>Newport</td>
 <td>FPH-DJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser power meter and detector head</td>
 <td>Coherent</td>
 <td>FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Laser equipment.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation

그것은 펄스, 적외선 레이저 빛이 표적 조직의 추가 수정에 관계없이, 신경 조직에 전기 반응을 유도하는 데 사용할 수 있습니다 최근 몇 년 동안 입증되었습니다. 적외선 신경 자극은 청각 신경의 신경 자극에 표시된 특정 관심, 생체 내 말초 감각 신경 조직의 다양한보고되었다. INS는 이러한 설정에서 작업 표시하고있는 동안 그러나, 적외선 빛은 신경 자극의 원인이되는 메커니즘 (또는 메커니즘)은 현재 잘 이해되지 않습니다. 여기에 제시 프로토콜은 배양 기본 청각 신경에있는 적외선 신경 자극의 조사를 용이하게하기 위해 설계된 전체 세포 패치 클램프 방법을 설명합니다. 철저하게 통제 된 조건 하에서 체외에서 적외선 레이저 조명에 이들 세포의 반응을 특성화함으로써, 기본적인 physica에의 향상된 이해를 얻을 수있을 수 있습니다L, 생화학 적 과정은 적외선 신경 자극을 기본.

나선 신경절 신경 세포는 전압 클램프 전류 클램프 녹음 구성 모두에서 반복 파형과 레이저 조명에 응답합니다. 그림 3A는 2.5 밀리, 0.8 mJ의 레이저 펄스 (6 일부터 평균 응답에 대한 응답으로 세포막을 통해 현재의 흐름의 전형적인 변화를 보여줍니다 -70 MV, -60 MV -50 MV에서 개최 막 잠재력을 가진 1 초 간격)으로 반복 레이저 펄스. NET 안쪽으로 전류가 지속적으로 조명 중지 한 후 초기 ?...

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Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

적외선 신경 자극은 청각 시스템과 관련된 포함 신경 유형의 범위 내에서 전기 자극에 대한 대안으로 제시되었다. 이 프로토콜은 기본 청각 신경의 문화 적외선 신경 자극의 메커니즘을 연구 패치 클램프 방법을 설명합니다.

적외선 신경 자극의 메커니즘을 조사하는 전체 세포 패치 클램프

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

whole-cell-patch-clamp-for-investigating-mechanisms-infrared-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.9K 조회수.  Swinburne University of Technology. 적외선 신경 자극은 청각 시스템과 관련된 포함 신경 유형의 범위 내에서 전기 자극에 대한 대안으로 제시되었다. 이 프로토콜은 기본 청각 신경의 문화 적외선 신경 자극의 메커니즘을 연구 패치 클램프 방법을 설명합니다.

비디오: Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates of associative learning 1-5. In these studies, it is important to provide behavioral evidence of conditioning to verify that differences in brain activity are learning-related and correlated with human behavior. 
Fear conditioning studies often monitor autonomic responses (e.g. skin conductance response; SCR) as an index of learning and memory 6-8. In addition, other behavioral measures can provide valuable information about the learning process and/or other cognitive functions that influence conditioning. For example, the impact unconditioned stimulus (UCS) expectancies have on the expression of the conditioned response (CR) and unconditioned response (UCR) has been a topic of interest in several recent studies 9-14. SCR and UCS expectancy measures have recently been used in conjunction with fMRI to investigate the neural substrates of aware and unaware fear learning and memory processes 15. Although these cognitive processes can be evaluated to some degree following the conditioning session, post-conditioning assessments cannot measure expectations on a trial-to-trial basis and are susceptible to interference and forgetting, as well as other factors that may distort results 16,17 .
Monitoring autonomic and behavioral responses simultaneously with fMRI provides a mechanism by which the neural substrates that mediate complex relationships between cognitive processes and behavioral/autonomic responses can be assessed. However, monitoring autonomic and behavioral responses in the MRI environment poses a number of practical problems. Specifically, 1) standard behavioral and physiological monitoring equipment is constructed of ferrous material that cannot be safely used near the MRI scanner, 2) when this equipment is placed outside of the MRI scanning chamber, the cables projecting to the subject can carry RF noise that produces artifacts in brain images, 3) artifacts can be produced within the skin conductance signal by switching gradients during scanning, 4) the fMRI signal produced by the motor demands of behavioral responses may need to be distinguished from activity related to the cognitive processes of interest. Each of these issues can be resolved with modifications to the setup of physiological monitoring equipment and additional data analysis procedures. Here we present a methodology to simultaneously monitor autonomic and behavioral responses during fMRI, and demonstrate the use of these methods to investigate aware and unaware memory processes during fear conditioning.

A methodology to investigate the neural mechanisms that support aware and unaware memory processes during fear conditioning is described. This method monitors blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging, skin conductance response, and unconditioned stimulus expectancy during Pavlovian fear conditioning to assess the neural correlates of distinct memory processes.

fMRI로 인식하고 알지도 못하는 두려움 메모리의 신경 메커니즘을 조사

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

연구

신경과학

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

조각 패치 클램프 기술 학습 유도 소성을 분석 하기 위한

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...