Bu çalışma Bağlantı Projesi hibe LP120100264 altında Avustralya Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir.

1. Spiral ganglion nöronlar Kültür <ol><li> Bir otoklav küçük turu (örneğin 10 mm çapında) cam lamelleri ve kavisli bir forseps sterilize edin. Steril forseps kullanılarak steril 4 halka 35 mm petri ya da 4-plaka ayrı kuyu içine sterilize lamelleri aktarın. En fazla 48 saat için bir kuluçka makinesi içinde lamel yeri ve üst yüzeyi (37 ° C) ile poli-L-ornitin (500 mg / ml) ve fare laminin (0.01 mg / ml) 150 ul uygulanır. Lamelleri kuyunun dibinde uzak yüzer yok emin olun. </li><li> 47.5 ml Neurobasal A, 0.5 ml 2 N takviyesi, 1 mi B27 takviyesi, 0.5 ml L-glutamin, ve 0.5 ml penisilin-streptomisin: Her sinir kültürü için 50 ml steril Neurobasal ortamı (NBM) hazırlayın. Not: Ek dondurulabilir, -20 ° C&#39;de depolanır ve gerektiğinde günde ortam ilave edildi. </li><li> Daha önce 20,21 açıklandığı gibi doğum sonrası günlük 4-7 sıçan yavrular spiral ganglion nöronları ayırmak, bizeenzimatik (tripsin% 0.025 ve% 0.001 DNase I) &#39;in ve mekanik teknikler de ing. Whitlon ve ark. 22 ve Vieira et al. 23 bakınız modiolus izolasyon bir gösteri için spiral ganglion nöron kültürü, ya da Parker ve ark. 24 ayrıntılı yordamlar için. </li><li> Lamelleri kalan tüm poly-L-ornithine/laminin çözüm aspire ve NBM ile kısa bir süre yıkayın. </li><li> Bir kuluçka (37 ° C,% 10 CO 2) içine lamelleri ve yere ayrışmış spiral ganglion nöron süspansiyon 150-200 ul ekleyin. Not: 20 kadar lamelleri 8 sıçan yavruları bir defada doğurulan ortalama yavru yola çıkılarak kolayca hazırlanabilir. </li><li> Dört saat kaplama nöronlar sonra, hücre enkaz kaldırmak ve 150-200 ul ısıtılmış taze NBM ile değiştirin çözüm aspire. Not: Medya dehidratasyonu önlemek için günlük ikmal gerektirebilir. </li><li> Elektrofizyolojik kayıtlar için gerekli kadar inkübatör lamelleri dönün. Not: ayrışmış spiralGanglion nöron kültürleri dört saat sonra ve daha sonra çözülme fazla iki gün için elektrofizyolojik deneyler için kullanılabilir. In vitro zaman sonuçlarının analizi sırasında dikkate alınmalıdır. Her 24-48 saat NBM yenileyin. </li></ol> 2. Patch Kelepçe Kayıtlar Hazırlık <ol><li> Çözümler hazırlayın <ol><li> Hücre içi (mikropipet) çözeltisi: 115 mM K-glukonat, 7 mM KCI, 10 mM HEPES, 0.05 mM EGTA, 2 mM Na 2 ATP, MgATP 2 mM, 0.5 mM Na 2 GTP (KOH ile pH 7.3 &#39;e ayarlanır; 295 ayarlamak sukroz ile mOsmol / kg) verildi. Steril bir filtre (0.2 um) aracılığıyla çözüm geçmek ve kayıt güne kadar -20 ° C&#39;de depolanmak üzere 200 ul hacimde ayrılır. </li><li> Hücre dışı (banyo) çözeltisi: 137 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glükoz (NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın, sukroz ile 300-310 mOsmol / kg&#39; a ayarlayın) . Bu çözüm, kaydın gün yapılır. </li></ol></li><li> MQ 2-6 bir direnç ile kayıt mikropipetler hazırlayın. Ve borosilikat cam (1.0 mm dış çapı 0.58 mm iç çapı; 75 mm uzunluk), biz bir CO2 lazer çektirmesi (Sutter Aletleri P-2000) kullanın. </li><li> Lazer hazırlayın. Bu protokol, OPTOTECH P / L, bu tür 1.870 nm Kızılötesi sinir uyarıcısı olarak bir fiber çiftli lazer ile kullanım için tasarlanmıştır Deneylerde ışık teslimat için kullanılan fiber optik iki ucunda bir sayısal 0.22 diyafram ve FC-PC konektörler ile 200/220 mikron çekirdek / kaplama çapı silika elyaftır (AFW Teknolojileri MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). Patch kablo iki fiber pigtail (yani bir ucunda Konnektörlü ve diğer de bölünmüş) üretmek için ikiye kesilmiştir. Lif çekirdek çapı ve lazer kaynaklı ısı değişiklikleri sayısal açıklık etkileri Thompson ve arkadaşları tarafından ayrıntılı olarak ele alınmıştır. 25 <ol><li> Bölünme, standart teknikler kullanılarak, ışık dağıtım lif ucuve elde edilen ucu bir optik mikroskop (yani ucu lif eksenine dik olması ve görsel denetim üzerine düz görünmelidir) ile gözlem ile yüksek kalitede olduğundan emin olun. Bağlayıcı (örneğin Thorlabs ADAFC2) aracılığıyla uygun bir uyarım kullanılarak lazer elyaf çiftli çıkışına ışık dağıtım lif bağlayın. </li><li> Uygun bir alet (LM-3 dedektör kafası ile örneğin Tutarlı FieldMate) kullanarak ışığı teslim lif bölünmüş ucundan çıkış lazer gücünü ölçün. Bu lazer güç ışığı teslim lif bölünmüş ya da önemli bir ayar (örneğin bir laboratuvar diğerine ulaşım) lazer yapılır her zaman kontrol edilmesi önerilir. </li><li> Bir fiber ayna veya eşdeğer cihaz ve yapıştırın uygun micropositioner için ayna ışık teslim lif yerleştirin. Bu doğru fiber optik lamel ile yaptığı açı θ tespit edebilmek için önemlidir. Bu anglE deneysel düzenlemenin bir fotoğraf çekme ve açısını elde etmek için görüntü işleme yazılımı (örneğin İmageJ) kullanılarak ölçülebilir. Özellikle mikroskopta - açısı θ (veya olası açıları aralığı) öncelikle deneysel düzenleme mekansal sınırlamaları ile sınırlıdır. Bizim deneylerde θ tipik değerleri (dik bir mikroskop dayalı) 36 ° civarında, ancak en iyi açısı (ters bir mikroskop kullanarak bu gibi) alternatif kurulumları için önemli ölçüde farklılık gösterebilir. </li><li> Lazer ve Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, yama kelepçe veri toplama sistemi (örneğin Digidata 1440A, Molecular Devices) ile bağlantı kurarlar. Yama kelepçe veri toplama sisteminden dijital çıkış mümkün veri toplama sisteminden bağımsız lazer darbe parametreleri belirlemek için yapım, harici bir fonksiyon jeneratörü ile lazer bağlanmalıdır. Alternatif olarak bu çıkış doğrudan bağlanabilirlazer sürücüsü (darbe uzunluğu ve tekrarlama oranı veri toplama yazılımı tarafından ayarlanacak gerektiren). Her iki durumda da, lazer tetiklemek için kullanılan sinyal lazer darbelerinin zamanlaması ve süresi elektrofizyolojik sinyali ile eş zamanlı olarak kaydedilebilir sağlamak için bilgi elde etme sisteminde bir girişine geri bağlanmış olması gerekir. </li></ol></li></ol> 3. INS incelenmesi için yama Kelepçe Kayıtlar <ol><li> Hücre-dışı çözelti ile perfüzyon sistemi uygun bir kap doldurun ve 1-2 ml / dakika arasında bir oranda banyosunun perfüzyon sağlamak için akış hızını ayarlamak. Bu çözeltinin hızlı ısıtma ve emme tarafından harcanan çıkarmak için çözelti bir peristaltik pompa sağlamak için bir in-line bir ısıtıcı ile yerçekimi beslemeli sistemi (aspiratör şişesi, sıkıştırma valfi ve PE tüp) kullanın. </li><li> Dik bir mikroskop kayıt odasına (banyo) içine kültürlenmiş hücreler ile bir lamel yerleştirin. Bir yüksek büyütme su daldırma hedefi (E kullanarak40X. G.) Ve faz-kontrast (örneğin diferansiyel girişim kontrast veya Dodt degrade kontrast), görsel kültürü içinde spiral ganglion nöronları bulun. Şekil 1a gösterildiği gibi tipik bir spiral ganglion nöron, önemli bir çekirdek ile çapı faz-parlak, yuvarlak ve yaklaşık 15 mikron. </li><li> Bir nöron bulunan sonra, daha düşük bir büyütme hedefi (örneğin 10X) geçmek ve görme alanı içinde hedef nöron bulun. </li><li> Aşağıdaki yordamı (veya eşdeğeri) kullanarak yerine ışık teslim fiber optik hareket: <ol><li> Ucu, yatay ve dikey düzlemde hem de hedef nöron yakın kadar çıkış elyaf hareket ettirmek için micropositioner kullanın. Lif ucunun dikey konumunu nesnel yukarı ve aşağı hareket (odak tarama) tarafından doğrulanabilir. </li><li> Yüksek büyütme hedefi geri dönmek ve t yanındaki istediğiniz konumda fiber optik ucu pozisyono nöron (Şekil 2 ilave bakınız). Fiberin dikey pozisyonunun ayarlanması, bu fiber alt kenarı fiberin konumda belirsizlik en aza indirmek için, lamel (yani sadece dokunarak) üzerine oturtulmuş olması önemlidir. Yatay düzlemde en iyi şekilde sıraya elyaf lamel ve lif r yarıçapı ile yaptığı θ açısına bağlıdır. Hedef nöronun merkezi lif ekseni boyunca uzanır, böylece lif konumlandırmak için, fiberin üst kenarı ile hedef hücre arasındaki yatay mesafe olmalıdır Δ target = r (Cosec θ - 2 sin θ), negatif değerler işaret eder nerede fiber optik çıkıntılar hücre. Fiber hizalama olduğunda, elyaf üst kenarı ve nöronun arasındaki Δ hedef bir mesafe yaklaşık görsel muayene ile elde edilebilir. Ancak Δ hedef için tasarlanmıştırsadece kaba bir kılavuz olarak hizmet vermektedir. Fiberin üst kenarı ve nöron merkezi arasındaki gerçek mesafe Δ Δ hedef (Şekil 1&#39;de gibi) ölçülebilir farklı şekilde lif Konumlandırma ortasından her iki radyal yer değiştirme (yani yürürlüğe fikir sağlayabilir Hedef nöron göre kirişin kiriş) ve eksenel yer değişimi (yani lif ekseni boyunca). Tipik modlu fiberler için ışın profili de bir üst şapka dağıtımı 26, yerel olarak emilen enerji (sıcaklık) düşüş ile yaklaşık olarak bu yana yani - Örneğin, Δ ayarı ≈ 0 hücrenin çevresinde yerel sıcaklığını artırmak için beklenir kirişin merkezinde yer değiştirme nedeniyle yakın hücreye fiber uç yüzü hareket emilen enerji artışı ile karşılaştırıldığında çok azdır. Bakımı gibi doğru ve tekrarlanabilir bir po gibi lif konumlandırmak için alınması gerekirkengörsel ipuçları, hedef nöron (örneğin Δ) göre lif konumu hassas ölçüm kullanarak ssible önceden belirlenmiş bir mesafe uzakta konumlandırma daha büyük önem taşımaktadır. Protokolün adım 3.8.2 &#39;de tarif edilene Δ resim analizi ile (± 3 um arasında bir tahmin edilen maksimum belirsizlik ile) tespit edilebilir. Bazı deneylerde 5,8 olarak, beyaz ışık kaynakları ve istenen hücre hedeflemek için fiber üzerinden akuple edilmiştir. Bu yaklaşım, hedef bölge saçılan ışığın yoğunluğunu bu sığ açıları (θ) nispeten düşük olduğu gibi, dik bir mikroskop kurulum etkisiz olduğu bulunmuştur. </li><li> Lif konumda sonra, mikropipet basit konumlandırma sağlamak için bilinen bir miktar dışarı hareket ettirin. Fiber sonra sinir kayıt elde edilir orijinal konumuna iade edilebilir. </li></ol></li><li> Hücre içi çözüm mikropipet doldurun ve güvenli başlarına yerine uygunamplifikatör millere (örneğin Multiclamp 700B, Molecular Devices). Mikroelektrot tutucunun tarafına bağlı tüp kullanarak, mikropipet tıkanmasını önlemek için pozitif basınç küçük bir miktar uygulanır. </li><li> Bir micromanipulator kullanarak, sadece hedef nöron üzerinde pozisyona mikropipet hareket ettirin. </li><li> Tüm hücre kayıtları için Protokol: <ol><li> Amplifikatör gerilim-kelepçe modunda 10 msn, +10 mV kare dalga darbe (örneğin Seal Test) uygulayın ve 0 nA için temel sinyal mikropipet potansiyeli (pipet offset) ayarlayın. Sızdırmazlık da mikroelektrot direnişini istenen aralığı (- MQ 6 örneğin 2) içinde olup olmadığını belirlemek için kullanılmalıdır. </li><li> Direncinin izlenmesi sırasında, yavaşça hedef nöron yüzeyi üzerine mikropipet konumlandırmak için mikromanipülatör ince ayar kullanımı. Mikropipet nöron ile temas halinde olduğunda, direnç (~ 0,5-1 MQ) tarafından artacaktır. Benmmediately direnç artışı takiben, pozitif sıvı basıncı kaldırmak ve küçük bir negatif basınç uygulayın. Bir kez direnci 10 geçti - 20 MQ, bir holding düzeyinde (-60 mV civarında örneğin) potansiyel membran düzeltmek. </li><li> Bu 1 GΩ aşana kadar elektrot direnci etkili bir mühür (&#39;gigaseal&#39; olarak adlandırılan) hücre zarı ve mikropipet arasında oluşan olduğunu simgeleyen, artmaya devam etmelidir. Bu noktada, mikropipet tüm sıvı basıncı çıkarın. </li><li> Gigaseal oluşmuştur sonra, kısa akım darbeleri (25 to 100 mikrosaniye, +1 V) kullanın veya kopma hücre zarı negatif sıvı basıncı kısa bakliyat ve tüm hücre yapılandırma elde. </li><li> Membran kapasitans, seri direnç ve sızdırmazlık darbe sırasında mevcut takılı üstel eğrisinden belirlenen giriş direnci kaydedin. Sonra switc, amplifikatör üzerindeki CpFast ve CpSlow kontrolleri ayarlayarak, kapasitans geçici aza indirmekh tüm hücre moduna amplifikatör ve düz akım kadar kapasite ve direnç telafi sızdırmazlık sırasında görülmektedir. Düz test işareti yanıt korumak için kapasitans ve direnç kontrolleri ayarlayarak,; seri direnç tazminat (% 70 tahmini ~% 70 düzeltme) uygulayın. </li><li> Amplifikatör akım kelepçe moduna geçin. Istirahat membran potansiyeli (mevcut enjeksiyon yokluğunda) dikkat edin. Istenen seviyede (örneğin -60 mV) de membran potansiyeli stabilize etmek için bir holding akımı ayarlayın. Pipet kapasitans nötralize ve gerilim düşümü dengelemek için köprü dengesini ayarlar. </li><li> (; 300 milisaniye süresi +10 pA adımda 10-200 pA) mevcut depolarizan ile uyararak nöron ateşleme özelliklerini kontrol edin. </li></ol></li><li><ol><li> Nöron yanında pozisyona fiber optik geri hareket ettirin. Bir CCD kamera birleştirilmiş görüntüleme yazılımı kullanılarak, hedef nöro ile ilgili lif pozisyonu görüntülerini yakalamakN, fiber optik (bkz. Şekil 1) üst kenarında daha sonra ilk olarak bir nöronun düzlem üzerinde odaklanarak, ve. </li><li> Ortaya çıkan görüntüler sonraki analiz (örneğin, Şekil 1b ve 1c) tarafından tam olarak Δ (hedef nöronların merkezi optik fiber göreli üst kenarının konumu) belirlemek mümkündür. Sonra Δ bilinmektedir, bu tür fiber uç yüzü olan hedef nöron (lif ekseni boyunca) Z ve kiriş δ r merkezi nöron radyal yer değiştirmesi için mesafe parametreleri basit trigonometrik ilişkiler kullanılarak hesaplanabilir: z = r sin 2θ + Δ cos θ δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) 2 + δy 2) 1/2, δy lif ekseni ve yukarıda da görüleceği gibi nöron merkezi arasındaki mesafe olduğu (örneğin see Şekil 1). Bu konumu parametrelerin doğru bilgi uyarılması işlemleri 25 arasındaki olası farklılıkları gidermek için gerekli olabilecek Analizi, hücreden hücreye hesap pozisyonel varyasyonları almalıdır. </li></ol></li></ol> 4. INS Deneyler <ol><li> Akım kelepçe veya gerilim kelepçe yapılandırmaları birinde elektrofizyolojik veri kaydederken, istenen parametreleri (örneğin güç, darbe uzunluğu, tekrarlama oranı vb) de uyarılması lazer çalıştırın. Bizim lazer, optik güç lazer sürücü doğrudan bir giriş üzerinden kontrol edilir ve her kayıttan önce manuel olarak belirtilir. Darbe uzunluğu ve tekrarlama oranı, harici sinyal üreteci veya veri toplama yazılımı (, adım 2.3.4 &#39;de açıklandığı gibi) ya da kontrol edilebilir. Veri yama kelepçe kanal ve lazer tetikleyici kanal hem de kaydedilir emin olun. </li></ol> Arasında değişen uzunlukları ile lazer darbeleriyaklaşık 500 mikro-saniyeye 15 msn ve darbe başına ~ 0,25-5 mJ enerjileri tipik olarak ölçülebilir elektrik yanıtları verim. Bu parametre etkilerini en aza indirmek çünkü 1 Hz ya da daha az olduğu lazer darbelerinin tekrar oranının ayarlanması, ilk deneyler için faydalı olabilir. Kaydedilen sinyal değişikliği tipik sonuçları aşağıdaki bölümde sunulmuştur.

<ol>
	<li>Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+infrared+light+for+in+vivo+neural+stimulation.">Application of infrared light for in vivo neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).</li><li>Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stimulation+with+optical+radiation.">Neural stimulation with optical radiation.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).</li><li>Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photochemical+tools+for+controlling+neuronal+activity.">New photochemical tools for controlling neuronal activity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trpv4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons.">Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).</li><li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+mechanisms+of+transient+optical+stimulation+of+peripheral+nerve.">Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve.</a> Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Bec, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+laser+stimulation+by+near+infrared+pulses+of+retinal+and+vestibular+primary+neurons.">Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).</li><li>Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+transients+evoked+by+pulsed+infrared+radiation+in+neonatal+cardiomyocytes.">Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes.</a> Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).</li><li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+stimulation+of+auditory+neurons:+Effect+of+shorter+pulse+duration+and+penetration+depth.">Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth.</a> Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).</li><li>Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+laser+versus+electrical+energy+for+peripheral+nerve+stimulation.">Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).</li><li>Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+stimulation+of+the+facial+nerve:+A+new+monitoring+technique.">Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique.</a> Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).</li><li>Jenkins, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+pacing+of+the+embryonic+heart.">Optical pacing of the embryonic heart.</a> Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).</li><li>Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+stimulation+of+the+auditory+nerve.">Laser stimulation of the auditory nerve.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).</li><li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectivity+of+neural+stimulation+in+the+auditory+system:+A+comparison+of+optic+and+electric+stimuli.">Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli.</a> J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).</li><li>Richter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+stimulation+of+auditory+neurons:+Effects+of+acute+and+chronic+deafening.">Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening.</a> Hearing Research. 242, 42-51 (2008).</li><li>Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+stimulation+of+single+auditory+nerve+fibers.">Laser stimulation of single auditory nerve fibers.</a> Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).</li><li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+parameter+variability+in+laser+nerve+stimulation:+A+study+of+pulse+duration,+repetition+rate,+and+wavelength.">Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable-membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).</li><li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents.">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291, 1-14 (2012).</li><li>Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+hair+cell+explant+co-cultures+promote+the+differentiation+of+stem+cells+into+bipolar+neurons.">Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons.</a> Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).</li><li>Whitlon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+morphology+of+auditory+neurons+in+dissociated+cultures+of+newborn+mouse+spiral+ganglion.">Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion.</a> Neuroscience. 138, 653-662 (1016).</li><li>Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+stimulation+of+neurite+outgrowth+in+a+serum-free+culture+of+spiral+ganglion+neurons+from+adult+mice.">Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice.</a> Hearing Research. 230, 17-23 (2007).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti.</a> J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation.">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).</li><li>Snyder, A. W., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Waveguide Theory. , (1983).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation.">Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).</li><li>Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+temperature+jump+by+infrared+diode+laser+irradiation+for+patch-clamp+studies.">Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies.</a> Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda belirtilen protokolleri kullanarak ayıklamak ve kültür spiral ganglion nöronları ve tüm hücre yama kelepçe deneyler yaparak lazer uyarılmış elektriksel aktivite araştırmak mümkündür. In vitro olarak kullanıldığında, yama klemp tekniği, in vivo olarak ulaşılabilir değildir deney parametreleri üzerinde bir kontrol düzeyi sağlar. Bu dalga boyu, darbe enerjisi, darbe uzunluğu, darbe şekil ve darbe tekrarlama dizileri olarak lazer stimülasyon parametreleri tekrarlana...

Nörofizyoloji ve tıbbi biyonik alanlarında nöral dokuda elektrik tepkilerin kontrol uyarılması izin teknikleri temeline dayanmaktadır. Elektrik stimülasyonu sinir uyarım olarak altın standart olmaya devam ederken sinir yanıtları, ve doku 1 çevredeki içine akım yayılmasını nedeniyle stimülasyon özgüllük eksikliği kaydederken, bu tür stimülasyon eserler varlığı gibi sakıncaları bir dizi çekiyor. Son yirmi yılda optik aracılı stimülasyon teknikleri 2 gelişimi gördük. Bu tekniklerin bazıları ya da belirli bir molekülün eklenmesi (kafesli moleküller) 3 ya da bir araştırma ayarı dışında uygulamak kolaydır ikisi de genetik manipülasyon çeşit (örneğin optogenetik, 4) vasıtasıyla, hedef doku değişiklik gerektirir. Özellikle ilgi çekici bu nedenle kızılötesi sinir stimülasyonu (INS), whereb olduğuy sinir doku darbeli kızılötesi lazer ışık heyecanlı. INS sinir doku 2 çok özel, temassız stimülasyon sağlayarak elektrik stimülasyonu eksikliklerin birçok üstesinden gelmek için potansiyeline sahiptir. INS başarılı in vivo ayarları çeşitli gösterilmiştir Ancak,, uyarma mekanizması tam olarak bilinmese kalır. Bazı yeni yayınlar 5-7 INS arkasındaki mekanizma ortaya çıkarılması doğru ilerleme göstermiştir. Su ile lazer ışığının emilimi nedeniyle hızlı ısıtma önemli bir rol oynar. Ancak, bunun ötesinde bir fikir birliği henüz ulaşmış olmaktır. Shapiro ve ark. 7 hızlı bir ısıtma ve daha sonra hücre zarı depolarizasyon kapasitans bir değişime yol açan, hücre zarı bitişik yüklü parçacıklar dağılımı içinde bir karışıklık sebep olur, son derece genel mekanizma önerilmiştir. Buna ek olarak, Albert ve arkadaşları. 5 olduğu iddia LASEr kaynaklı ısıtma iyonlarının hücre zarından geçmesine izin, ısıya duyarlı iyon kanalları (geçici reseptör potansiyeli vanilloid kanal), belirli bir sınıf aktive eder. Bu aşamada tespit edilmesi henüz daha faktörler olup olmadığını gerçekten bu mekanizmaların bir araya nasıl belirsiz, ya da. Bir yayın az sayıda (referans 5,7-9), in vitro incelenmiştir INS olmasına rağmen, bu alanda yayınlanan çalışma bölgesinin büyük bir kısmı (örneğin, referans 1,6,10-18) in vivo olarak gerçekleştirilmiştir. Işitsel sinirlerin Kızılötesi uyarılması koklear implant 10,14-18 içinde potansiyel uygulamaları nedeniyle özel bir ilgi alanı olmuştur. In vivo deneyler, çeşitli ortamlarda teknik, in vitro çalışmalar tarafından sağlanan kontrol artan seviyesi Mech daha detaylı bir anlayış yol açması beklenmektedir etkililiğini doğrulamak için önemli olmakla birlikte,INS sorumlu olarak tarif etmişler. Bu rapor ayrıca, işitsel sistemin mevcut verilerin büyük gövdesine bağlantı sırasında temel mekanizmaları incelemek için kullanılabilir olarak, yama kelepçe araştırmalar için kültürlenmiş spiral ganglion nöronlarının hazırlanmasını tarif etmektedir. Yama kelepçe tekniği tek hücrelerinde elektriksel aktivite kayıt aracı sağlayan ve bireysel temel akımları 19 katkısı eğitim, elektrofizyolojik olayların araştırmalar için mükemmel bir araçtır. Bu teknik, kültür spiral ganglion nöronları gibi birincil nöronların, in vitro hazırlanmasında istikrarlı uygulandığında, bu derinlik sinirsel aktivite kontrol ve manipüle edildiği mekanizmaları eğitim için bir fırsat sunuyor. Yama kelepçe ile spiral ganglion nöronları elektriksel özellikleri üzerine lazer stimülasyon etkisini araştırmak için bu çalışma taslak yöntemleri belirtilen protokollerikayıtları. Yaklaşım standart mikroskop konfigürasyonu değiştirmek için gerek kalmadan güvenli operasyon gibi kolay ve tekrarlanabilir uyum sağlayan, daha çok bir boş-alan lazer daha fiber çiftli lazer dayanmaktadır. Bu protokollerin dayanarak, daha açık bir şekilde INS arkasında mekanizmasında veya mekanizmalarında belirlemek için deneyler geniş bir yapmak mümkün olmalıdır.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Cell culture materials and equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass coverslips</td>
 <td>Lomb Scientific</td>
 <td>CSC 10 1 GP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-ring cell culture dish </td>
 <td>VWR International</td>
 <td>82050-542</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-ornithine solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4957</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laminin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>23017-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved forceps</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14101</td>
 <td>Dumont #5 tweezers (45&deg; angle tip)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 Incubator</td>
 <td>ThermoScientific</td>
 <td>Heracell 150i</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Cell culture materials and equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Neurobasal media</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal A</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10888-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N-2 supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27 serum-free supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140-148</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>25030-149</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular solution</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4034</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium D-gluconate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G4500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E3889</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaGTP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8877</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium hydroxide</td>
 <td>LabServ</td>
 <td>BSPPL738.500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sucrose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S8501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Extracellular solution </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>310166</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4034</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383147</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M8266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium hydroxide</td>
 <td>LabServ</td>
 <td>BSPSL740.500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sucrose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S8501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>Zeiss </td>
 <td>AxioExaminerD1</td>
 <td>Equipped with Dodt contrast </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water-immersion objective</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platform and X-Y stage </td>
 <td>ThorLabs</td>
 <td>Burleigh Gibraltar</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Recording chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>RC-26G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vibration isolation table</td>
 <td>TMC</td>
 <td>Micro-g 63-532</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD Camera</td>
 <td>Diagnostic Instruments</td>
 <td>RT1200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Camera software</td>
 <td>Diagnostic Instruments</td>
 <td>SPOT Basic</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In-line solution heater</td>
 <td>Warner</td>
 <td>SH-27B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature controller</td>
 <td>Warner</td>
 <td>TC-324B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Patch clamp amplifier</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Multiclamp 700B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Patch clamp data acquisition system</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Digidata 1440A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micromanipulator</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>MPC-325</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette glass</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>GBF100-58-15</td>
 <td>Borosilicate glass with filament</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette Puller</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P2000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Recording Software</td>
 <td>AxoGraph</td>
 <td></td>
 <td>Lab pack and electrophysiology tools</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator bottle</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>CLS12201L</td>
 <td>1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE Tubing</td>
 <td>Harvard</td>
 <td>PolyE #340</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Masterflex peristaltic pump</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>HV-07554-85</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3.Patch clamp equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,870 nm laser diode</td>
 <td>Optotech</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200/220 &mu;m diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)</td>
 <td>AFW Technologies</td>
 <td>MM1-FC2-200/220-5-C-0.22</td>
 <td>Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber through connector (FC/PC)</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>ADAFC2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber cleaver</td>
 <td>EREM</td>
 <td>FO1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) </td>
 <td>Siemens</td>
 <td></td>
 <td>For removing optical fiber jacket</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)</td>
 <td>Siemens</td>
 <td></td>
 <td>For removing outer coating of patch cord</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Signal generator</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber positioner</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber chuck</td>
 <td>Newport</td>
 <td>FPH-DJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser power meter and detector head</td>
 <td>Coherent</td>
 <td>FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Laser equipment.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation

Bu darbeli, kızılötesi lazer ışık hedef doku arasında herhangi bir başka değişiklik bağımsız olarak, sinir dokusu elektrik yanıtları ortaya çıkarmak için kullanılabilir, son yıllarda gösterilmiştir. Kızılötesi sinir uyarımı işitsel sinir nöronların uyarılması gösterilen özel bir ilgi ile, in vivo periferik ve duyusal sinir dokusu çeşitli rapor edilmiştir. INS bu ayarları çalışmak gösterilmiştir Ancak,, kızılötesi ışık sinir uyarım neden olan mekanizma (veya mekanizmaları) şu anda iyi anlaşılmış değildir. Burada sunulan protokol kültürlenmiş birincil işitsel nöronlar içinde kızılötesi sinir stimülasyonu soruşturma kolaylaştırmak için tasarlanmış bir bütün hücre yama kelepçe yöntem açıklanır. İyice kontrollü şartlar altında in vitro kızılötesi lazer aydınlatma için bu hücrelerinin yanıtı ile karakterize, bu temel Physica geliştirilmiş bir anlaşılmasını sağlamak için mümkün olabilirl ve biyokimyasal süreçleri kızılötesi sinir stimülasyonu altında yatan.

Spiral ganglion nöronlarının voltaj-kıskaç ve akım kelepçe kayıt konfigürasyonlarının tekrarlanabilir dalga lazer aydınlatma yanıt. Şekil 3a, bir 2.5 ms, 0.8 mJ lazer darbeli (6 ortalama müdahale yanıt olarak bir hücre zarından akımı tipik değişiklikler gösterir -70 mV, -60 mV ve -50 mV düzenlenen membran potansiyeli ile 1 sn aralıklarla) tekrarlanan lazer darbeleri,. Net içe akımları sürekli aydınlatma kesildikten sonra başlangıç ​​değerlerine dönen, lazer darbele...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation at JoVE.com

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Kızılötesi sinir stimülasyonu işitme sistemi ile ilgili olanlar dahil olmak üzere, sinir tipleri, bir dizi elektrik stimülasyonu için bir alternatif olarak önerilmiştir. Bu protokol, birincil işitsel nöronların bir kültür içinde kızılötesi sinir stimülasyonu mekanizmasını incelemek için bir yama kelepçe yöntem açıklanır.

Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

whole-cell-patch-clamp-for-investigating-mechanisms-infrared-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.9K Görüntüleme.  Swinburne University of Technology. Kızılötesi sinir stimülasyonu işitme sistemi ile ilgili olanlar dahil olmak üzere, sinir tipleri, bir dizi elektrik stimülasyonu için bir alternatif olarak önerilmiştir. Bu protokol, birincil işitsel nöronların bir kültür içinde kızılötesi sinir stimülasyonu mekanizmasını incelemek için bir yama kelepçe yöntem açıklanır.

Video: Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates of associative learning 1-5. In these studies, it is important to provide behavioral evidence of conditioning to verify that differences in brain activity are learning-related and correlated with human behavior. 
Fear conditioning studies often monitor autonomic responses (e.g. skin conductance response; SCR) as an index of learning and memory 6-8. In addition, other behavioral measures can provide valuable information about the learning process and/or other cognitive functions that influence conditioning. For example, the impact unconditioned stimulus (UCS) expectancies have on the expression of the conditioned response (CR) and unconditioned response (UCR) has been a topic of interest in several recent studies 9-14. SCR and UCS expectancy measures have recently been used in conjunction with fMRI to investigate the neural substrates of aware and unaware fear learning and memory processes 15. Although these cognitive processes can be evaluated to some degree following the conditioning session, post-conditioning assessments cannot measure expectations on a trial-to-trial basis and are susceptible to interference and forgetting, as well as other factors that may distort results 16,17 .
Monitoring autonomic and behavioral responses simultaneously with fMRI provides a mechanism by which the neural substrates that mediate complex relationships between cognitive processes and behavioral/autonomic responses can be assessed. However, monitoring autonomic and behavioral responses in the MRI environment poses a number of practical problems. Specifically, 1) standard behavioral and physiological monitoring equipment is constructed of ferrous material that cannot be safely used near the MRI scanner, 2) when this equipment is placed outside of the MRI scanning chamber, the cables projecting to the subject can carry RF noise that produces artifacts in brain images, 3) artifacts can be produced within the skin conductance signal by switching gradients during scanning, 4) the fMRI signal produced by the motor demands of behavioral responses may need to be distinguished from activity related to the cognitive processes of interest. Each of these issues can be resolved with modifications to the setup of physiological monitoring equipment and additional data analysis procedures. Here we present a methodology to simultaneously monitor autonomic and behavioral responses during fMRI, and demonstrate the use of these methods to investigate aware and unaware memory processes during fear conditioning.

A methodology to investigate the neural mechanisms that support aware and unaware memory processes during fear conditioning is described. This method monitors blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging, skin conductance response, and unconditioned stimulus expectancy during Pavlovian fear conditioning to assess the neural correlates of distinct memory processes.

FMRI ile Aware ve habersiz Korku Bellek Nöral Mekanizmalar araştırılması

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

Nörobilim

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Channelrhodopsins&#39;teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı plastisite analiz etmek için

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...