Los autores desean agradecer a Ina Wolter por su excelente asistencia técnica. VGAT-Venus ratas transgénicas fueron generadas por los Dres. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi y Y. Kawaguchi en el Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas, Okazaki, Japón, usando pCS2-Venus proporcionada por el Dr. A. Miyawaki.

Declaración de Ética: Todos los procedimientos y de los animales de mantenimiento se realizaron de conformidad con las directrices institucionales, la Ley Alemana de Bienestar Animal, el Consejo Europeo de la Directiva 86/609 / CEE relativa a la protección de los animales, y las directrices de las autoridades locales (Berlín, T-0215/11 ) 1 Preparación de rebanadas de hipocampo aguda- <ol><li> Tome una rata transgénica (17 a 24 días de edad), que expresa la proteína Venus / YFP fluorescente bajo el promotor VGAT, que las etiquetas de la mayoría de las interneuronas inhibitorias corticales 13. Decapita a la rata. Rápidamente diseccionar el cerebro (&lt;40 seg) en semicongelado, carbogenated (95% O 2/5% CO 2) fluido a base de sacarosa artificial cefalorraquídeo (sacarosa-ACSF, Figura 1A). </li><li> Evaluar el cerebro de rata diseccionado para la fluorescencia Venus / YFP con una lámpara de 505 nm y filtro de emisión de 515 LED, montado en un par de gafas. </li><li> Retire la tercera frontal de la corteza y Cerebellum; a continuación, separar los hemisferios, todos con un bisturí. Retire la superficie dorsal de la corteza para proporcionar una superficie plana para pegar el cerebro hacia abajo, como se ha descrito previamente 14. </li><li> Cortar rodajas transversales (300 m) de la formación del hipocampo en un vibratome, los hemisferios deben estar rodeados con semicongelado, carbogenated sacarosa-ACSF (Figura 1B) 14. Retire regiones adicionales de rostral corteza, mesencéfalo y el tronco cerebral. Transferir cada rebanada a una cámara de retención sumergida ACSF que contiene sacarosa, que se carbogenated y se calentó a 35 ° C. </li><li> Deja las rebanadas de recuperar a 35 º C durante 30 minutos desde el momento de la última rebanada de entrar en la ACSF calentado. Haga esto con el fin de reactivar los procesos metabólicos y facilitar el resellado de los procesos neuronales cortadas. A continuación, traslado a la temperatura ambiente para el almacenamiento (Figura 1C). </li></ol> 2. Fabricación y Llenado de pipetas de registro <ol><li> Pupipetas de parche ll de capilares de vidrio, de modo que se consigue una resistencia de la pipeta de 2-4 mW cuando se llena con filtrado (filtro de jeringa, tamaño de poro: 0,2 micras) solución intracelular contenía 0,1% de biocitina (para el etiquetado intracelular). Mantenga la solución intracelular enfriado en hielo para evitar la degradación de sus componentes. </li><li> Llenar pipetas de parche para la identificación de las corrientes postsinápticas con una solución que contiene un bajo Cl fisiológicamente relevante - concentración (E R (Cl) = -61 mV; véase la lista de solución). </li><li> Para grabaciones pareadas para identificar las respuestas mediadas por el receptor presináptica, llenar pipetas de parche con solución intracelular con Ca 2 + de la capacidad tampón de baja para evitar la interferencia con la liberación del transmisor presinápticamente, así como 4 veces mayor concentración de Cl - (E R (Cl) = -20 mV) para mejorar la relación señal-ruido de IPSCs observados 5 que permiten una evaluación precisa de resp farmacológicaonsiveness. Tenga en cuenta que el cambio de concentración de Cl - puede alterar la cinética de IPSC 15. </li></ol> 3. Whole Cell Patch-clamp grabación de FS-ins <ol><li> Carbogenate la ACSF y se alimentan a través del sistema de perfusión a la cámara de grabación, por medio de una bomba peristáltica (que también elimina ACSF de la cámara de registro a través de una línea de succión, la Figura 2A). Encienda todos los equipos de la configuración en la preparación para la grabación. </li><li> Transferir una rebanada a la cámara de registro y mantenerlo en su lugar con un anillo de platino encadenan con fibras individuales de seda. Coloque la rebanada de modo que el estrato piramidal (str.) De CA1 corre verticalmente a través del campo de visión, permitiendo el acceso con 2 pipetas tanto a la str. radiatum y str. oriens simultáneamente (Figuras 2C y 4A). </li><li> Coloque la cámara en la configuración e iniciar la perfusión de carbogenated y caliente (32-34 º C) Una grabaciónCSF a un caudal de 5-10 ml / min. </li><li> Evaluar la calidad rebanada bajo la óptica DIC-IR a 40X aumento del objetivo, y visualizar con una cámara CCD se ve en una pantalla. Supongamos buena calidad rebanada si un gran número de células piramidales CA1, moderadamente contrastados redondos (CA1 PC) se puede ver en str. pyramidale a profundidades de 20-30 micras por debajo de una superficie lisa y ligeramente de cráteres (Figura 2C). Rebanadas de mala calidad contienen un gran número de muy contrastados, células reducidas o inflamadas, con una superficie de loncha desigual. </li><li> Identificar FS putativos interneuronas bajo iluminación de epifluorescencia que las que expresan Venus / YFP (Figura 2B), con gran somata multipolar en o cerca de la str. pyramidale. Seleccione las celdas razonablemente profundo dentro de la rebanada (50-100 m, Figura 2C) con el fin de preservar mejor su integridad morfológica. </li><li> Monte el electrodo de registro en el soporte de la pipeta en el cabezal de la platina; a continuación, la aplicaciónLY una presión positiva baja (20-30 mBar) a través de la línea de tubo. Bajar la pipeta a la superficie de la rodaja, ligeramente desplazada del centro de la neurona seleccionada. </li><li> Obtener configuración de la grabación de células enteras como se describió previamente 14,16 y ver también las figuras 2D y 2E: <ol><li> Haz objetivo a una celda: Aumenta la presión a 70-80 mbar y bajar rápidamente la pipeta a través de la rebanada justo por encima del soma de la celda seleccionada (Figura 2D, arriba). </li><li> Acércate a la célula: Pulse la pipeta contra la membrana de la célula para producir un &quot;hoyuelo&quot; en él (Figura 2D, arriba). Realice este paso con rapidez, a fin de evitar el etiquetado biocitina de las células vecinas. </li><li> Crear un sello giga-ohm: Suelte la presión y al mismo tiempo aplicar un comando de 20 mV de tensión a la pipeta. Un sello de giga-ohm (1-50 GΩ; Figura 2D, abajo y la figura 2E medio) typicaliado se desarrolla rápidamente. Una vez sellados, aplicar el potencial de membrana en reposo esperado (típicamente entre -70 y -60 mV) como un comando de voltaje. </li><li> Romper a través del parche: Una vez sellada, rompa el parche de membrana con un breve pulso de presión negativa; consiguiendo de esta manera la configuración de célula completa (Figura 2E, parte inferior). </li></ol></li><li> Compensar la capacitancia de célula entera y resistencia en serie (R S). R s es normalmente 5-20 mW y estable durante un máximo de 120 min. Abandonar las células si el potencial de membrana (V M) en caso de ruptura a través de más despolarizado que -50 mV; R S es inicialmente mayor que 30 mW; o cambios R S por más de 20% en el transcurso de la grabación. </li><li> Identificar FS-ins por su respuesta (en el modo de corriente-clamp) para una familia de hiper a despolarizante pulsos de corriente (-250 a 250 pA, Figura 2F, arriba). FS-ins relativamente han despolarizado V M (normalmente -50 to -60 mV), la membrana corta constante de tiempo (&lt;20 ms) y responder a un 500 pA despolarizante de inyección de corriente con un tren de potenciales de acción (AP) a frecuencias&gt; 100 Hz 11 (Figura 2F, parte inferior), que son notablemente diferentes a las de CA1 PC (Figura 2F, medio). </li></ol> 4. extracelular estimulación eléctrica para evocar respuestas mediadas por R GABA B <ol><li> Para observar las respuestas evocadas sinápticamente, colocar un electrodo de estimulación extracelular (un parche pipeta llena de NaCl 2 M; Resistencia: 0,1-0,3 mW) en el corte en la frontera de str. radiatum y str. -lacunosum moleculare. Coloque el electrodo de 200-300 micras lateral a la soma para prevenir la estimulación eléctrica directa de la célula y minimizar los artefactos de estimulación (figura 3A). </li><li> Una vez que el electrodo de estimulación se coloca, obtener la grabación de células enteras dela célula y elegido evaluar el fenotipo fisiológico en modo de corriente-clamp como en la sección 3.9 (Figura 3B). </li><li> Con la neurona registrada en de fijación de voltaje (V M -65 mV), entregar la estimulación eléctrica de los axones presinápticos a 50 V (~ 500 μA estímulo eficaz) cada 20 segundos, utilizando un aislado estimulador de voltaje constante. Utilice solo los estímulos (100 microsegundos de duración, la figura 3C, la parte superior) para observar GABA B R IPSCs mediadas, y intercalar con los trenes de múltiples estímulos (a 200 Hz) para producir una mayor liberación del transmisor. </li><li> Bath aplica ionotrópicos antagonistas de los receptores de glutamato (AMPA del receptor: DNQX [10 M]; receptor NMDA: d-AP5 [50 M]) para revelar el aislado monosináptico IPSC (Figura 3C, media alta). Además de aislar el IPSC mediada R GABA B con la aplicación de un bloqueador de GABA A R (gabazine [10 M]; Figura 3C l medioower). </li><li> Confirmar la resultante lenta corriente de salida (Figura 3C inferior, expandido) como se GABA B R-mediada por la posterior aplicación de CGP-55845 [5 M] (Figura 3C inferior, sustentada en gris) </li></ol> 5. Emparejados Grabaciones de sinápticamente acoplados FS-IN y CA1 PCs <ol><li> Evaluar el control presináptica mediada por R GABA B de la transmisión sináptica inhibitoria con grabaciones simultáneas, realizadas entre sinápticamente acoplados pares IN y PC como se describe a continuación. </li><li> En primer lugar, establecer una grabación de células enteras de un interneuron presináptica (como en la sección 3) y confirmar el fenotipo FS (Figura 4A). </li><li> Entonces parchear un CA1 PC vecino (20-100 micras distancia, la figura 4A) y aplicar breve supraumbral despolarizante pulsos de corriente (1 ms de duración, 1-5 nA amplitud) a la presináptica IN (celebrada en modo de corriente-clamp) para obtener puntos de acceso. Si un co sinápticaConexion está presente, los puntos de acceso en el resultado IN en IPSCs en el PC CA1, que se celebró en el voltaje-clamp (compensar R S hasta aproximadamente el 80%). </li><li> Si es necesario, llene un nuevo electrodo de registro y grabar desde otros PCs CA1 hasta que se encuentre una conexión. </li><li> Una vez que se establece una conexión, provocar pares de puntos de acceso en el presináptica FS-IN para evaluar tanto la respuesta sináptica unitaria y comportamiento dinámico. Utilice un típico protocolo de dos pulsos de 2 estímulos despolarizantes con un intervalo de 50 ms (Figura 4B). </li><li> Recoge los rastros de control en las condiciones de base. A continuación, aplicar los GABA B baclofeno R agonista selectivo (10 m) para la perfusión ACSF, activando así Rs GABA B, seguido por el antagonista CGP-55845 (5 M), para bloquear totalmente los efectos mediados por el receptor. Recoger ~ 50 trazas durante el estado estacionario de cada condición de medicamento (Figura 4B y C). </li><li> Una vez que la grabación haya terminado, sellar la membrana somática formando una outside-cabo parche: Lentamente retirar la pipeta desde el cuerpo celular en V-abrazadera y como los R S aumenta, reducir el V M a -40 mV. Haga esto para facilitar la formación del parche fuera de salida; a continuación, extraiga la pipeta de la bañera. </li></ol> 6. Análisis de las propiedades electrofisiológicas <ol><li> NOTA: Una multitud de diferentes paquetes de software están disponibles para la adquisición de datos electrofisiológicos. Aquí, WinWCP, se utiliza un programa de Windows en el paquete gratuito Strathclyde Electrofisiología Software, que permite la grabación de hasta 16 canales de entrada analógica y la salida de 10 señales digitales. </li><li> Filtro de paso bajo de todos los datos a 5-10 kHz y muestra a 20 kHz. </li><li> Analizar los datos fisiológicos con un análisis conjunto off-line. NOTA: Stimfit, un paquete de software de fuente abierta, que incluye un terminal de Python, se utiliza en este caso; sin embargo otras alternativas pueden ser utilizadas fácilmente en su lugar. <ol><li> Analizar membrana pasiva propiedades de neuronas registradas, adquiridas en la pinza de corriente, de potencial de reposo de la membrana. </li><li> Medir la media potencial de reposo de membrana de la línea de base de las respuestas registradas desde el comienzo de la grabación. </li><li> Calcular la resistencia de entrada, utilizando la ley de Ohm, de la respuesta de tensión a los impulsos de corriente hiperpolarizantes más pequeños (≤ -50 Pa). Para mejorar la relación señal a ruido, múltiples trazas promedio. Nota: los ejemplos son típicamente promedios de 10 a 50 barridos individuales. </li></ol></li><li> Estimar el tiempo de membrana constante aparente ajustando una curva monoexponencial a la decadencia de las respuestas a los más pequeños pulsos de corriente de hiperpolarización. </li><li> Analizar potencial de acción de forma de onda para determinar el umbral, la amplitud (umbral a pico) y la duración (anchura medida a media altura) provocada por nivel de umbral de despolarización impulsos de corriente. </li><li> Analizar GABA B R IPSCs mediados de grabaciones de fijación de voltaje. Filtro traza fuera de línea en500 Hz (filtro Gaussiano) y evaluar la amplitud de pico y la latencia de la respuesta mediada por GABA B R (en los promedios de al menos 10 restos). </li><li> Detectar el efecto de GABA B Rs en la salida inhibitorio de SIN como un cambio en la amplitud de pico de las IPSCs mediadas-R GABA A medidos entre el pico y la línea de base anterior. Calcular la amplitud media de ≥50 trazas para el período de control y el estado de equilibrio de todas las épocas farmacológicos. </li></ol> 7. Visualización e inmunocitoquímica de FS-Ins <ol><li> A raíz de las grabaciones, fijar las rebanadas por inmersión en paraformaldehído al 4% con 0,1 M tampón fosfato (PB, pH = 7,35) O / N a 4 ° C. </li><li> Si rebanadas necesarias pueden ser transferidos a PB y almacenarse hasta ~ 1 semana antes de procesar. </li><li> Lavar abundantemente en rodajas PB fresco y posteriormente en 0.025 M PB con 0,9% de NaCl (PBS, pH = 7,35). </li><li> Para reducir anticuerpo unión no específica, bloquear las rodajas de FOr 1 hora a RT en una solución que contiene 10% de suero normal de cabra (NGS), 0,3% de Triton-X100 (un detergente para permeabilizar membranas) y 0,05% NaN 3, hecha en PBS. </li><li> Para etiquetar para la expresión PV, utilizar un anticuerpo monoclonal de ratón anti-PV diluido en una solución que contiene 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN 3, en PBS. Incubar anticuerpos primarios durante 2-3 días a 4 ° C 12. Enjuague rebanadas a fondo en PBS. </li><li> Aplicar anti-ratón secundaria de anticuerpos fluorescentes (por ejemplo Alexafluor-546.) Junto con la estreptavidina-proteína de unión a biotina, conjugado con un fluorocromo (por ejemplo, Alexafluor-647); y se incuban en una solución que contiene 3% de NGS, 0,1% de Triton-X100, 0,05% NaN 3, diluido en PBS e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Liberalmente enjuague rebanadas 2-3x con PBS seguidos por 2-3 enjuagues en PB. Montar las rebanadas en el portaobjetos de vidrio. Use un 300 micras agar espaciador para evitar el corte de colapsar. Rebanadas cubres con un fluomedio de montaje ciento y el sello con el clavo-barniz. </li></ol> 8. Imaging y Reconstrucción de Visualized FS-Ins <ol><li> Visualice las rebanadas utilizando un microscopio confocal de barrido, con el reportero fluorochome emocionados con la línea de láser adecuado (diodo láser 635 nm para Alexafluor-647; Helio-Neón 543 nm para Alexafluor-546 etiquetado para PV y Argon 488 o 515 nm para Venus / YFP). </li><li> Tomar imágenes a una resolución apropiada Z-(típicamente 0,5-1 micras pasos, usando un objetivo 20X) para producir una pila Z de toda la célula. Múltiples pilas normalmente se requiere que toda la imagen de la célula, que puede ser cosida digitalmente fuera de línea utilizando FIJI / software ImageJ (Figura 5A). </li><li> Reconstruir la celda de la pila de imágenes unidas utilizando un método de seguimiento semi-automático (simple plugin de Neurite Tracer en paquete de software FIJI / ImageJ 17, Figura C). </li><li> Por último, evaluar la PV-inmunoreactividad de la interneuron con una lente de objetivo de alta apertura numérica (60X silicio-inmersión, NA = 1,3). Hacer imágenes del soma, dendritas proximales y axón proximal, o, alternativamente, de terminales de los axones si lavado somática de PV es demasiado fuerte. Las células se consideran inmunorreactivas para PV si inmuno-etiquetado se ve para alinearse con las estructuras Biocitina marcado (Figura 5B). </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Se describe un método que combina técnicas electrofisiológicas y neuroanatómicas para caracterizar funcionalmente neuronas morphologically- y neuroquímicamente identificados in vitro; en particular, los diversos tipos de INS inhibitorias corticales. Los aspectos clave del procedimiento son: (1) pre-selección de INS potenciales; (2) el registro intracelular y la visualización de las neuronas; y, finalmente, (3) el análisis morfológico y inmunocitoquímica de IEE registrados. Aunque este estudio se ha ocupado de ...

Circuitos neuronales del hipocampo han sido durante mucho tiempo objeto de un intenso escrutinio, con respecto tanto a la anatomía y la fisiología, debido a su papel esencial en el aprendizaje y la memoria, así como la navegación espacial en los seres humanos y roedores. Igualmente, la organización laminar prominente, pero simple del hipocampo hace de esta región un tema favorito de estudios sobre las propiedades estructurales y funcionales de las redes corticales. Circuitos del hipocampo se componen de células excitatorias principales (&gt; 80%) y una más pequeña (10-20%), pero muy diversa cohorte de interneuronas inhibidoras 1-3. Las interneuronas liberan ácido γ-aminobutírico (GABA) desde sus terminales de los axones que actúa en ionotrópicos rápido receptores GABA A (GABA A Rs) y los receptores de GABAB metabotrópicos lentas (Rs GABA B) 4. Estos mecanismos inhibitorios se equilibran de excitación y regulan la excitabilidad de las células principales, y por lo tanto laIR temporización y el patrón de descarga. Sin embargo, liberado de interneuronas GABA actúa no sólo en las células principales, sino también en los propios 5,6 interneuronas. Receptores pre y postsinápticos median la regulación por retroalimentación y las interacciones mutuas inhibitorias entre los diversos tipos de interneuronas. Estos mecanismos inhibitorios en las redes de interneuronas se cree que son fundamentales para la generación y conformación de los patrones de actividad de la población, en particular las oscilaciones a diferentes frecuencias 7. Grabación de patch-clamp de célula entera es un método bien establecido para el examen de las propiedades intrínsecas y las interacciones sinápticas de las neuronas. Sin embargo, debido a la gran diversidad de tipos de interneuronas, la investigación de las interneuronas inhibidoras requiere la identificación rigurosa de las células grabadas. Como los tipos de interneuronas del hipocampo se caracterizan por rasgos distintivos morfológicos y la expresión de marcadores neuroquímicos, anatómica combinada y inmunocitoquímica eXAMEN puede proporcionar un medio para determinar la identidad precisa 6,8,9 interneuron. En el presente trabajo se describe un enfoque experimental en el que su conjunto de células patch-clamp grabaciones de las neuronas individuales o pares sinápticamente acoplados se combinan con el etiquetado intracelular, seguido de post-hoc de análisis morfológico y inmunocitoquímica, lo que permite la caracterización de lenta GABA B receptor mediada efectos inhibitorios en interneuronas identificados. A modo de ejemplo, nos centramos en uno de los principales tipos de interneuronas, un subconjunto de las llamadas &quot;células cesto&quot; (BC), que inerva el soma y dendritas proximales de sus metas post-sinápticas y se caracteriza por un &quot;Rematar rápida&quot; (FS) descargar patrón, un axón cubriendo densamente la capa de cuerpo de la célula, y la expresión de la proteína parvalbúmina de unión a calcio (PV) 10,11. Estas interneuronas muestran grandes corrientes postsinápticas inhibitorias, así como pre prominentemodulación sináptica de su producción sináptica, en respuesta a la activación de GABA B R 12. La combinación de las técnicas descritas aquí se puede aplicar igualmente bien para investigar los mecanismos intrínsecos o sinápticas en una variedad de otros tipos de neuronas identificadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:175px;">Name</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:152px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Transgenic vGAT-venus rats</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">see Uematsu et al., 2008</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Venus (515&#160;nm) goggles</td>
			<td style="width:148px;">BLS Ltd., Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:148px;">i.e. FST</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">For brain removal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Vibratome</td>
			<td style="width:148px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">VT1200S</td>
			<td style="width:251px;">Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Slice holding chambers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Upright IR-DIC microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">BX50WI</td>
			<td style="width:251px;">With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CCD camera</td>
			<td style="width:148px;">Till Photonics</td>
			<td style="width:152px;">VX55</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">505 nm LED system</td>
			<td style="width:148px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:152px;">OptiLED system</td>
			<td style="width:251px;">Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Multiclamp 700B&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:251px;">Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">WinWCP acquisition software</td>
			<td style="width:148px;">John Dempster, Strathclyde University</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Electrode Puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter</td>
			<td style="width:152px;">P-97</td>
			<td style="width:251px;">Used with box-filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Borosilicate pipette glass</td>
			<td style="width:148px;">Hilgenberg, Germany</td>
			<td style="width:152px;">1405020</td>
			<td style="width:251px;">2&#160;mm outer, 1&#160;mm inner diameter, no filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:148px;">Gilson</td>
			<td style="width:152px;">Minipuls</td>
			<td style="width:251px;">Other pumps or gravity feed could be used instead</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Thermometer</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom made</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Manometer</td>
			<td style="width:148px;">Supertech, Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;">Isolated constant voltage stimulator</td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Digitimer, Cambridge</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">DS-2A</td>
			<td rowspan="2" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;"><a name="RANGE!A19:D34">Biocytin</a></td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">B1592</td>
			<td rowspan="2">Otherwise known as &#949;-Biotinoyl-L-Lysine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DL-AP5(V) disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120271</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DNQX disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120169</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively NBQX or CNQX</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Gabazine (SR95531)</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120042</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively bicuculline methiodide</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">R-Baclofen</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120325</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CGP-55,845 hydrochloride</td>
			<td style="width:148px;">Tocris</td>
			<td style="width:152px;">1248</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Streptavidin 647</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">S32357</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-PV mouse monoclonal antibody</td>
			<td style="width:148px;">Swant, Switzerland</td>
			<td style="width:152px;">235</td>
			<td style="width:251px;">Working concentration 1:5000-1:10,000</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-mouse secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">A11030</td>
			<td style="width:251px;">If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:148px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:152px;">S-1000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any high quality brand&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Usually 22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Agar spacers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Agar block, cut on vibratome to 300 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">Fluoview FV1000</td>
			<td style="width:251px;">Or other comparable system</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Fiji (Fiji is just ImageJ)</td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">See Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons

Interneuronas GABAérgicas inhibitorias juegan un papel central dentro de los circuitos neuronales del cerebro. Las interneuronas representan un pequeño subconjunto de la población neuronal (10-20%), pero muestran un alto nivel de heterogeneidad fisiológica, morfológica, y neuroquímicos, que refleja la diversidad de sus funciones. Por lo tanto, la investigación de las interneuronas ofrece importantes conocimientos sobre los principios de organización y funcionamiento de los circuitos neuronales. Esto, sin embargo, requiere un enfoque fisiológico y neuroanatómico integrado para la selección e identificación de tipos de interneuronas individuales. De células enteras de grabación de cortes de cerebro agudos de animales transgénicos, que expresan proteínas fluorescentes bajo los promotores de marcadores-interneuron específica de patch-clamp, proporciona un método eficiente para apuntar y caracterizar propiedades intrínsecas y sinápticas de tipos específicos interneuron electrofisiológicamente. Combinado con tinte de etiquetado intracelular, este enfoque se puede ampliar con mo post-hocanálisis rphological y inmunocitoquímica, que permite la identificación sistemática de las neuronas registradas. Estos métodos se pueden adaptar para adaptarse a una amplia gama de cuestiones científicas sobre las propiedades funcionales de los diversos tipos de neuronas corticales.

A condición de que la calidad del corte es considerablemente buena, la grabación tanto de CA1 PC y FS-ins se puede conseguir con dificultad mínima. La línea de rata transgénica que expresa Venus / YFP bajo el promotor VGAT 13 no identifica inequívocamente FS-ins, o incluso chalecos. Sin embargo grabaciones del INS en los alrededores de str. pyramidale, donde la densidad de FS-ins es típicamente alta 1, da como resultado una alta probabilidad de seleccionar FS-ins (Figura 2B)...

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Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Redes corticales son controlados por un conjunto pequeño, pero diverso de interneuronas inhibidoras. Investigación funcional de interneuronas por lo tanto requiere la grabación específica y la identificación rigurosa. Aquí se describe un enfoque combinado que involucra conjunto de células grabaciones de pares individuales o sinápticamente acoplados de neuronas con el etiquetado intracelular, post-hoc morfológica y inmuno análisis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.3K vistas.  Charité Universitätmedizin.  Redes corticales son controlados por un conjunto pequeño, pero diverso de interneuronas inhibidoras. Investigación funcional de interneuronas por lo tanto requiere la grabación específica y la identificación rigurosa. Aquí se describe un enfoque combinado que involucra conjunto de células grabaciones de pares individuales o sinápticamente acoplados de neuronas con el etiquetado intracelular, post-hoc morfológica y inmuno análisis. 

Video: Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Investigación

Neurociencias

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Emparejados grabaciones patch clamp de neurona motora y el músculo esquelético de destino en el pez cebra

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Grabaciones de patch clamp en Inner células del oído pelo Aislado de pez cebra

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch Clamp Las grabaciones de las células embrionarias de pez cebra Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...