Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional del Cáncer, el Centro para la Investigación del Cáncer; acuerdo de investigación colaborativa entre el NCI y Calidris Terapéutica, Sociedad Americana del Cáncer de subvención IRG 97-152-17 a OT, y fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, NIH, bajo HHSN26120080001E contrato.

1. Preparación de lisado celular Este protocolo está diseñado para las células adherentes que expresan cualquier proteína GFP-fundido. Se necesita el número de células puede variar desde tan bajo como 10 6 a un máximo de 20 x 10 6 células, dependiendo del nivel de expresión de la proteína. Por ejemplo, lisado de células HEK que sobreexpresan GFP-STAT3 se preparó mediante el tratamiento de las células cultivadas en matraces T75 10 a cerca de 70% de confluencia con 1 ml de tampón de lisis. Sin embargo, este lisado tuvo que ser diluida 150 veces para proporcionar el nivel óptimo de la fluorescencia para el experimento MST. Protocolo de lisis celular depende fuertemente de las propiedades y la localización intracelular de la proteína objeto de la investigación. Si el uso de detergentes no es deseable debido a la inestabilidad de la proteína, la sonicación se describe a continuación, podría ser la mejor opción. Diferentes aditivos se pueden añadir al tampón de lisis para prevenir las reacciones de modificación de proteínas: EDTA impide la fosforilación, vanadato de sodio inhibe la proteína fosfatasas de tirosina, por lofluoruro de sodio es un inhibidor de la Ser / Thr fosfatasas. <ol><li> Prepare el buffer de lisis. Por fáciles de extraer proteínas citoplasmáticas la siguiente composición funciona bien: HCl 25 mM Tris, pH 8,0, y cóctel inhibidor de proteasa diluyeron 100 veces (Sigma-Aldrich P2714, que consta de 2 mM AEBSF, 0,3 mM aprotinina, 130 mM bestatina, 1 mM de EDTA, 14 mM E-64, 1 mM leupeptina). Alternativamente, para las proteínas menos solubles, se puede utilizar tampón RIPA comercial con cóctel de inhibidores de proteasa y detergentes no desnaturalizantes. Mantenga el buffer en hielo. </li><li> Lavar las células brevemente con helado de PBS con 10 ml de tampón por T75 frasco. Mantener células en hielo durante 5 minutos, o hasta que las células comienzan a desprenderse del matraz. Raspe las células con un raspador de células para separar, si es necesario. </li><li> Resuspender las células en 10 ml de PBS frío y la transferencia a una ronda de 14 ml tubo de centrífuga de fondo previamente enfriado. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 400-600 xg a 4 ° C durante 5 min. Combino las células de varios frascos en este punto if necesario. </li><li> Eliminar PBS sobrenadante y se resuspende el precipitado en 200 l de tampón de lisis enfriado en hielo, la transferencia de la suspensión a un pre enfriado tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Mantener las células en hielo para minimizar el sobrecalentamiento local. Lyse células con 3 x 10 seg pulsos de ultrasonidos a 30% de la amplitud, con un 2-3 mm punta de pre-enfriado. Mantenga la punta por debajo de la superficie para reducir al mínimo la formación de espuma. Omitir este paso cuando se utiliza un detergente que contiene tampón y se incuba en hielo durante 30 min en lugar. </li><li> Corregir la solución de lisado para contener la concentración de sal fisiológica (100 mM de NaCl) si es necesario el uso de 5 M de NaCl. </li><li> Recoger lisados ​​por centrifugación a aproximadamente 26.000 xg a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Determinar la dilución de lisado óptima (como se describe en la sección 3 más adelante) y la cantidad de lisado necesario para una titulación (típicamente alrededor de 300 l de lisado pre-diluido). </li><li> Dividir en partes alícuotas del lisado y se almacena a temperatura apropiada para la proteína objeto de investigación (-80 ° C, en la mayoría de los casos). </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Selección y Preparación de Tampón de MST <ol><li> Dado que las interacciones proteína-ligando son dependientes de condiciones de tampón, la composición del tampón MST se elige sobre la base de las propiedades de un sistema en particular. Por lo general, es ventajoso para probar por lo menos dos tampones diferentes. </li><li> Prepare 2 buffers MST 5x. Hemos tenido buenas experiencias con estas dos composiciones: HEPES (250 mM de HEPES, pH 7,4; 25 mM de MgCl 2, 500 mM de NaCl, 0,25% NP-40) y Tris HCl (250 mM de Tris HCl, pH 7,4, 750 mM de NaCl; 50 mM de MgCl 2; 0,05% de Tween-20). La adición de BSA (5% en la mezcla de unión final) puede ayudar a evitar la adhesión de las proteínas a tubos de plástico y los tubos capilares de vidrio. NaN 3 (0,5 mM) también se puede incluir para prevenir el crecimiento de microorganismos. </li></ol> 3. Determinación de la dilución óptima Lysate <ol><li> Seleccione la fuente de excitación del LED con la longitud de onda λ = 470 nm en el instrumento MST. </li><li> Cargar capilares con el cell extracto diluido 2 y 10 veces con tampón MST. </li><li> Realice la operación de &quot;Búsqueda capilares&quot; en software de control de instrumento MST. El rango óptimo de fluorescencia en lisado diluido es de 400 a 1500 unidades de fluorescencia. </li></ol> 4. Determinación del ligando de intervalo óptimo de concentración <ol><li> La mayor concentración del ligando debe ser de al menos 20x más alta que la constante de disociación esperada. </li><li> La concentración de ligando más bajo debe ser menor que la concentración molar de la proteína fluorescente. </li></ol> Consulte la herramienta de Tecnologías Buscador Concentración NanoTemper para la estimación rango de concentración de ligando. 5. Preparación de lisado celular y diluciones de ligandos <ol><li> Coloque un bastidor de tubo con un número necesario (normalmente 10-16) de los tubos de centrífuga LoBind 0,5 ml en hielo. Pipetear 25 l de tampón de MST para la parte inferior de cada tubo. Añadir 25 l de la solución madre de ligando a la primera bañerae (# 1, ligando concentración más alta) y llevar a cabo serie de dilución de dos veces del ligando utilizando el resto de los tubos. Mantenga el estante con muestras de ligandos en el hielo. </li><li> Thaw lisado celular lentamente en hielo. </li><li> Diluir lisado celular con tampón MST para proporcionar el nivel óptimo de la proteína diana fluorescente en las reacciones de unión. La concentración final de proteína debe estar cerca de la esperada K D o inferior. Se deberá ajustar para obtener el número necesario de cuentas de fluorescencia en la solución final. Para la determinación de GFP-STAT3 concentración en el lisado, el instrumento se calibró con una ayuda de fluoresceína. La concentración molar de GFP en el lisado se determinó utilizando la proporción de fluoresceína y rendimientos cuánticos de EGFP, 0,85 y 0,61, respectivamente. 15 </li></ol> 6. Termoforesis microescala Estudios de unión <ol><li> Seleccione la fuente de excitación del LED con λ = 470 nm en el instrumento MST. </li><li> Coloque los tubos LoBind 0,5 ml en el tUbe bastidor a través de los tubos de muestras con ligando de dilución en serie. Añadir cuidadosamente 15 l de lisado celular a la parte inferior de cada tubo. Trate de no tocar las paredes del tubo para evitar la pérdida de la muestra. </li><li> Añadir 15 l de la muestra ligando con la concentración más alta (# 1) en el tubo correspondiente # 1 con el lisado celular. Mezclar bien y cambiar una punta de pipeta. Repita este paso con el resto de los tubos a excepción de la última, que debe contener ningún ligando. </li><li> Añadir 15 l de tampón de MST para el último tubo y mezclar bien. </li><li> Llenar aproximadamente 2/3 de la primera capilar con la mezcla de unión de tubo n º 1, la inclinación que se mueva la solución hacia el centro, y colocar el capilar en la bandeja capilar a la posición # 1 (la posición más cercana a la abertura de la bandeja) . Repita este paso con el resto capilares. Extremos de los capilares se pueden conectar con cera para los experimentos más largos. </li><li> Coloque la bandeja en el interior del instrumento MST y cerrar la puerta del aparato. </li><li> Realice &quot;Buscar capilares&quot;comando para dejar que el instrumento de encontrar posiciones exactas de los capilares y medir la fluorescencia de las muestras. </li><li> En base a la intensidad de la señal de fluorescencia, ajustar la potencia del LED (10-100%) para ponerla en 400-1,500 unidades de intervalo. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Inicio&quot; para llevar a cabo el experimento termoforesis. Más de una fuente de IR-láser puede ser elegido para el experimento con el fin de encontrar el gradiente de temperatura óptima para el sistema particular. Recopilar datos 2-3 carreras para el mismo conjunto de capilares para asegurar la reproducibilidad de las mediciones. Se tarda 10-12 minutos para ejecutar un conjunto de 16 capilares. </li></ol> 7. Análisis de datos termoforesis Microscale <ol><li> Abra el software de análisis. </li><li> Cargue la carpeta del proyecto. En el Visor de Run Información aparecido seleccione recogidas en un específicas de infrarrojos láser de potencia curvas termoforético. Hay una opción de abrir todos los rastros termoforético recogidos en diversas condiciones, tales como la potencia del láser IR, LED power, temperatura, concentración, etc. a la vez y luego elegir las curvas de análisis cambiándolas por intervalos (haga clic en el nombre del experimento). </li><li> En la ventana de gráficos de puntos de evaluación, seleccione la termoforesis o termoforesis con T-salto. Asegúrese de que las líneas azules y rojas están colocadas correctamente. Para obtener los puntos de promedio con desviaciones estándar, seleccione &quot;Usar promedio&quot; o &quot;Distinguir corre&quot; de carreras por separado. </li><li> Para trazar un ajuste constante de disociación, seleccione &quot;Usar promedio&quot;, entrar y fijar el valor de concentración de molécula marcada (marque la &quot;concentración&quot; cuadrada en un menú de la ventana en forma), y el ajuste de la curva. El valor K D con su desviación estándar aparece en una ventana de información emergente independiente. Para trazar un ajuste mediante el método de Hill y selecciona &quot;Normal&quot;, el método de Hill, y luego ajustar la curva. El valor de afinidad CE 50 con su desviación estándar se muestra en este caso. La característica de K o D Hill &quot;frontera&quot;, también se puede utilizar cuando la saturaciónen un estado ligado no se alcanza. </li><li> Guardar los datos de ajuste promedio en un archivo de texto y transferir a Excel. </li><li> Parcela F norma (fluorescencia normalizada), Df norma (diferencia en la fluorescencia normalizada si se comparan diferentes experimentos), o fracción unida (véase la fórmula a continuación) como una función de la concentración de la molécula no marcado (titulados). </li></ol> Fracción unida (fracción de las moléculas en un complejo) = (Therm (C)-no unido) / (unida-no unido), donde Therm (C) es termoforesis medido para la concentración de C, no unido es termoforesis para el estado no ligado (cuando las moléculas están no en un complejo), y atado es termoforesis para el estado completamente unido.

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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, y la mención de marcas registradas, productos comerciales u organizaciones no implica la aprobación por el Gobierno de los EE.UU..

Expresión y purificación de proteínas es un paso laborioso y costoso, que es, sin embargo, necesario para la determinación de las interacciones de los K D por el método más utilizado actualmente. Aplicación del MST permite evitar la purificación de proteínas simplificando y acelerando significativamente caracterización cuantitativa de las interacciones. Presenta ventajas particularmente importantes en el caso de difíciles de expresar y purificar proteínas, como las proteínas de membrana y factore...

Caracterización cuantitativa de la afinidad de las interacciones intermoleculares es importante en muchas áreas de la investigación biomédica. Encuadernación constante de disociación (KD) es esencial no sólo en el descubrimiento de fármacos, pero también es un parámetro importante en la caracterización de cualquier interacción binaria en cualquier sistema biológico. Métodos bioquímicos utilizados para la detección de interacciones proteína-proteína, como la inmunoprecipitación y la levadura híbrido de dos pantallas, no nos informan sobre el grado de tensión son las interacciones, mientras que la afinidad define si existe este complejo particular, en determinadas condiciones in vivo. En el proceso de descubrimiento de fármacos, desarrollo de ensayos de unión es uno de los más necesarios y con frecuencia los pasos que más tiempo consume. Los métodos más utilizados de determinación K D incluyen la polarización de fluorescencia, tecnología 1 resonancia de plasmones superficiales (SPR), 2 radioligand vinculante, 3 calorimetría de titulación isotérmica, 4 equilibrium diálisis (ED), 5 de ultrafiltración (UF), 5 y ultracentrifugación (UC). 6 Todos ellos requieren cantidades importantes de proteína diana purificada. Termoforesis microescala (MST) es un método rápido desarrollo que detecta el movimiento dirigido de las moléculas en un gradiente de temperatura microscópica. Cualquier cambio de la capa de hidratación de biomoléculas resultado en un cambio relativo de movimiento a lo largo del gradiente de temperatura. 7 MST se utiliza para determinar las afinidades de unión y se ha aplicado para el estudio de unión a las proteínas marcadas con fluorescencia o ligandos fluorescentes ligando a una proteína diana. 8, 9 MST permite la medición de las interacciones directamente en solución sin la necesidad de inmovilización a una superficie (inmovilización libre de la tecnología). Prácticamente, cualquier unión es acompañado por un cambio en la señal de MST, aunque el tamaño del cambio difiere de sistema a sistema de manera significativa. Para la detección de movimiento molécula por MST, que tienen que ser fluorescenciant. Esta limitación importante del método se puede convertir en una ventaja. Si una proteína se expresa como una fusión GFP en cualquier sistema, que será la única molécula fluorescente y por lo tanto puede ser estudiado sin aislamiento a partir del lisado celular o sistema de expresión libre de células. Generación de lisados ​​celulares que permiten las condiciones de unión con artefactos mínimos es el principal desafío. Aquí se describe un protocolo de preparación de lisado celular y experimentar MST que se puede utilizar para muchas proteínas solubles y de membrana. Proteínas STAT están latentes factores de transcripción citoplasmáticos activados por la fosforilación de tirosina en respuesta a señales extracelulares y están implicadas en muchos procesos biológicos, incluyendo la inmunidad, la hematopoyesis, inflamación, y el desarrollo. 10 En los mamíferos, la familia STAT consta de STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B, y 6. Todas las estadísticas activadas se sabe que se unen a la misma secuencia de ADN, por lo que llama motivo GAS, IFN-gamma activado secuencia. Sin embargo, la transcriPCIONAL efectos de diferentes STAT son muy diferentes. 11 A pesar de la participación en muchos procesos patológicos y extensos estudios que producen más de 17.000 publicaciones, la K D de las interacciones STAT con diferentes secuencias de ADN no se han determinado. Sólo afinidad relativa de las diferentes estadísticas con las variantes del motivo GAS se ha caracterizado. 11 Las dificultades en la expresión y purificación de proteínas son los principales obstáculos en la caracterización de la selectividad de unión a ADN estadísticas de la &#39;. Aunque la mayoría de los estudios se han centrado en el papel de la Stats &quot;activados&quot;, que se convirtió en sinónimo de factor de transcripción Tyr-fosforilada, el papel de STAT no fosforilada (U-STAT) en la regulación de la transcripción está emergiendo rápidamente. 12 Sin embargo, estos mecanismos no se entienden bien, y no estaba claro si U-STAT en realidad se unen a ADN o actuar a través de interacciones con otros factores de transcripción. Recientemente hemos demostrado que U-STAT3 puede unirse al ADN secuencialces diferente de motivos de gas con aún mayor afinidad. 13 El hallazgo tiene implicaciones importantes para nuestra comprensión de las funciones biológicas de esta importante proteína. Hemos aplicado termoforesis microescala para determinar las afinidades relativas de STAT3 a GAS y oligonucleótido rico en AT de S 100 (Figura 4). Casi idéntico protocolo se ha usado para la determinación de K D para la unión de un ligando de STAT3 diferente, un inhibidor de lipopéptido. 14 No se unión a un factor de transcripción relacionado, GFP-STAT1 que se utilizó como control negativo podría ser detectado confirmando de este modo la selectividad de interacción. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Caracterización cuantitativa de las interacciones proteína es esencial en prácticamente cualquier campo de las ciencias de la vida, en particular el descubrimiento de fármacos. La mayoría de los métodos actualmente disponibles de determinación de K D requieren acceso a la proteína de interés, la generación de los cuales puede ser mucho tiempo y es caro purificada. Hemos desarrollado un protocolo que permite la determinación de la afinidad de unión por termoforesis microescala (MST) sin purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El método implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido y lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes. Aplicación del método de STAT3-GFP expresa transitoriamente en células HEK293 permitieron determinar por primera vez la afinidad del factor de transcripción bien estudiado a oligonucleótidos con diferentes secuencias. El protocolo es sencillo y puede tener una variedad de aplicaciones para el estudio de interacciones de proteínas con moléculas pequeñas, péptidos, ADN, ARN, y proteins.

La medición de la afinidad de los no fosforilados STAT3 proteína de unión a oligonucleótidos. Células HEK293 que expresan STAT3-GFP se utilizaron como una fuente de la etiqueta fluorescente STAT3 para el ensayo de unión al ADN. Los lisados ​​celulares se prepararon utilizando tampón RIPA (20x10 6 células / ml). Para los estudios de unión, los lisados ​​se diluyeron 150 veces con tampón de unión a ADN MST para proporcionar el nivel óptimo de la pro...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Termoforesis microescala (MST) puede ser ampliamente utilizado para la determinación de la afinidad de unión sin la purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El protocolo implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido, lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes, y la detección de la señal de MST en presencia de concentraciones variables del ligando.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

JoVE Journal

Biology

30.3K vistas.  National Cancer Institute. Termoforesis microescala (MST) puede ser ampliamente utilizado para la determinación de la afinidad de unión sin la purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El protocolo implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido, lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes, y la detección de la señal de MST en presencia de concentraciones variables del ligando.

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Concentración de proteínas microvolumen Determinación mediante el NanoDrop 2000c Espectrofotómetro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Investigación

Biología

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

La importancia de la concentración de la proteína correcta para la cinética y la determinación de afinidad en el análisis de la estructura-función

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Lípidos vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnética clasificación de células activadas (LIMACS): un nuevo método para analizar la interacción de proteínas y lípidos

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificación de proteínas ortogonales Facilitado por un marcador de afinidad biespecíficos pequeños

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

En tiempo real de análisis de transporte de retinol en el receptor de la membrana de plasma Proteína Fijadora del Retinol

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Un método de cuantificación sensible y específica para la determinación de suero miosina cardíaca proteína de unión-C por inmunoensayo electroquimioluminiscencia

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...