Un sistema de purificación de proteínas de alto rendimiento económico y versátil que utiliza un adaptador de placa de varias columnas. Hola, la purificación de proteínas es imprescindible para el estudio de la estructura y función de las proteínas. Y generalmente se usa en combinación con técnicas biofísicas.
Esto es especialmente importante en la era de la proteómica funcional que requiere una producción de proteínas de alto rendimiento. La hipótesis de que un adaptador de placa de varias columnas, el MCPA, puede interconectar múltiples columnas de cromatografía de diferentes resinas con placas de múltiples pozos para la purificación paralela. Con este adaptador, hemos desarrollado un método económico y versátil de purificación de proteínas que se puede utilizar bajo gravedad o vacío rival en la velocidad de un sistema automatizado.
Aquí mostramos este método para la cromatografía de afinidad de níquel y cromatografía de intercambio iónico. Monte el MCPA colocando una alfombrilla de sellado perforada sobre una placa de goteo larga y, a continuación, inserte el número deseado de columnas en los orificios de la alfombrilla de sellado. Coloque una placa de recolección abierta en la base de la variedad y ciérrese con la parte superior de la variedad.
Coloque la tubería y coloque el MCPA montado con columnas en la parte superior. Pipetear 1.2 mil de la solución de níquel-NTA en las columnas. Mientras se pipetea, asegúrese de que las cuentas permanezcan completamente mezcladas.
Encienda la bomba y ejecute el etanol al 20% a través de las columnas y en la placa de recolección a continuación. Apague la bomba una vez que el líquido se ejecuta a través de. Deseche el contenido de la placa de recolección en una caja de residuos.
Agregue tres volúmenes de resina de tampón EDTA a todas las columnas. Encienda la bomba y ejecute el líquido a través de. Ahora lave las columnas con tres volúmenes de resina de 0,5 molares de hidróxido de sodio tampón.
Lave las columnas con cuatro volúmenes de resina de sulfato de níquel 100 milimolares, luego 10 volúmenes de resina de agua Mili-Q. Si una columna está funcionando más lento, empuje el líquido a través con el émbolo de la jeringa. Vierta el contenido de las placas de recolección en una caja de residuos.
Luego lave las columnas dos veces con cuatro volúmenes de resina de 10 milimomolares imidazol lavado tampón y vacíe las placas de recolección. Si se están purificando varias muestras, reemplace las placas de recolección abiertas con placas de 48 pozos. Con el vacío apagado, cargue los lysates en las columnas.
Use un agitador de plástico delgado para mezclar suavemente las cuentas y los lisatos en la columna para maximizar la unión. Encienda la bomba y ejecute el líquido a través de. Si una columna se bloquea, transfiera la mezcla de resina de lisato a una columna con un filtro fresco.
Congele las placas de recolección para contener su flujo. Reemplazado con una placa de recolección abierta y luego lavar las columnas con nueve volúmenes de resina de 10 milimomolar imidazol lavado tampón. Repita este paso cuatro o cinco veces.
Para evitar desbordamientos, vacíe periódicamente las placas de residuos. Reemplace las placas de recolección abiertas con una placa de 96 pozos, asegurándose de que A1 esté en la esquina superior izquierda. Pipetear un volumen de resina de desnaturalización del tampón de elución en las columnas.
Pase el líquido y revise la placa de recolección para asegurarse de que no haya contaminación entre los pozos. Para la siguiente dilución, repita los pasos anteriores y colóquel en una placa de recolección fresca. Tome una alícuota de 50 microlitras de cada elución para el análisis de pureza y concentración.
A continuación, lave las columnas con dos mililitros de etanol al 20%. Agregue otros dos mil de etanol al 20% a las columnas y use el agitador de plástico fino fresco para mezclar las perlas en el etanol antes de transferirlas a un tubo de 50 mil para su almacenamiento a cuatro grados Centígrados. Monte el MCPA en colector de vacío con una placa de recolección abierta y émbolos de jeringa en todas las columnas.
Retire todos los émbolos de la jeringa de la primera fila. Retire la junta de goma de un émbolo de jeringa de cinco mil y luego perfore un agujero en el centro. Luego empuje la parte inferior de una columna abierta a través de la junta de goma perforada.
Repita estos pasos e insértela en la primera fila de columnas. Asegúrese de que las cuentas de sefarosa Q estén completamente mezcladas. Y con la punta de la pipeta azul que se corta a dos centímetros de la parte inferior, pipetear 800 microlitros de las cuentas de sefarosa Q en las columnas abiertas.
Una vez que las cuentas se han asentado en la parte inferior de las columnas, encienda la bomba de vacío lo suficiente como para hacer funcionar el 20% de etanol a través. Lavar las columnas dos veces con dos mil de 10 milimolares Tris. Apague la bomba justo antes de que el tampón Tris haya pasado para evitar que la resina se seque.
La escorrentía se puede desechar y reemplazar con placas de recolección de 48 pozos. Transfiera todas las muestras que se van a purificar a las columnas Q Sepharose en la primera fila y use un agitador de plástico delgado para mezclar las muestras y las cuentas durante aproximadamente dos minutos antes de encender la bomba de vacío. Almacene o congele su flujo para su análisis posterior.
Con una placa de recolección abierta, lave las columnas dos veces con dos mil de 10 milimolares Tris. Substituya las placas de recogida abiertas por la placa de 96 pozos. La primera fracción de elución se puede recopilar en la primera fila o en la segunda fila.
Para eluir en la segunda fila, retire los émbolos de la jeringa de estas posiciones. Mueva las columnas Q Sepharose a estas posiciones y luego coloque los émbolos de la jeringa en las columnas abiertas en la primera fila. Pipetear un mililitro de las primeras concentraciones de sal en las columnas Q Sepharose.
Encienda la bomba y recoja la elución. Para recoger la siguiente elución, retire los émbolos de la jeringa de las siguientes posiciones, mueva las columnas Q Sepharose a estas posiciones y luego reemplace los émbolos en las posiciones anteriores. Repita estos pasos para cada concentración sucesiva de sal utilizada para eluir.
Asegúrese de que se utiliza una nueva placa de recolección para cada cuatro eluciones y que cada placa está etiquetada y almacenada. Con una placa de recolección abierta, lavar las columnas con dos mil de cuatro molares de cloruro de sodio, 10 milimolares Tris. Pipetee dos mil de etanol al 20% y ejecute esto hasta que esté justo por encima de las cuentas y luego selle las columnas para su almacenamiento.
Como ejemplo, el MCPA ha purificado con éxito 14 mutantes AbpSH3 en condiciones de desnaturalización por un níquel-NTA. Un pequeño contaminante se puede ver a 25 kilodaltons, aunque la proteína sigue siendo en gran parte pura. Los pequeños contaminantes vistos en condiciones de desnaturalización se eliminan en condiciones nativas.
Esto se demostró cuando se purificaron 11 dominios SH3 diferentes. Esto demuestra que el MCPA se puede utilizar para la comparación de condiciones de purificación. AbpSH3 se puede separar de la mayoría de los contaminantes a través de la purificación del intercambio iónico de los lisatos.
Se recuperaron buenos rendimientos de la proteína AbpSH3 considerablemente pura con varios contaminantes de mayor peso molecular. La purificación de muestras post-níquel-NTA utilizando el intercambio iónico con el MCPA ha eliminado con éxito estos contaminantes de alto peso. Aunque todavía hay una ligera contaminación, las fracciones siguen siendo en gran parte puras y han producido buenos datos biofísicos utilizando RMN y ensayos de desnaturalización química térmica.
En conclusión, nuestros resultados muestran que nuestra hipótesis es correcta y que el MCPA puede purificar con éxito cantidades de miligramo de proteínas utilizando diferentes técnicas de cromatografía. El sistema MCPA se puede configurar de varias maneras dentro de las mismas ejecuciones para optimizar las condiciones de purificación. La configuración es simple, barata y fácil de entrenar a usuarios inexpertos, especialmente en laboratorios que no purifican rutinariamente las proteínas.
