Damos las gracias a Osman Kaftanoglu consejos útiles y asistencia durante el rodaje. Nos gustaría agradecer a los revisores anónimos por sus comentarios perspicaces. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Noruega (otorga 180.504, 191.699 y 213.976), Marie Curie/FP7 (ref proyecto. 238.665), el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA subvención P01 AG22500) y el Pew Charitable Trusts.

1. Desacoplamiento senescencia de Edad cronológica En esta sección se describe la configuración de las colonias dobles de cohortes, que consisten en una cohorte de individuos identificados que comparten la misma edad cronológica (&quot;grupo de edad único&quot;) y una cohorte de abejas nido. Los mismos individuos de edad de la cohorte de edad solo el tiempo se separan en diferentes tipos de trabajadores-con diferentes dinámicas de envejecimiento - estas son las abejas nodrizas con abejas desacelerado y cosechadoras de forraje con el declive funcional acelerada. Todos los procedimientos se describen, por una colonia experimental. Asesoramos, sin embargo, para realizar experimentos durante al menos dos réplicas de colonias para que los efectos de colonias pueden ser controlados para (dos replicados-diseño). <ol><li> Preparación de las cajas de colmena para las colonias dobles cohorte: Prepare una caja regular colmena que recibe dos peines de alimentos con miel, otro peine de alimentos con el polen, y dos panales vacíos. Asegúrese de colocar una reina acoplado, así como una colonia de donantes con más de 3.000abejas nido. Ambos se introducirán más tarde (1.3). </li><li> Obtención y marcado individuos con edad cronológica similar: Recoger peines con cría sellada que está a punto de emerger. Para un replicado esperar para recoger peines con un total de 3.000-5.000 celdas de cría tapados. Para cada réplica utilizar una cantidad equilibrada de cría de al menos tres fuentes diferentes de la colmena para evitar distribuciones asimétricas de genotipos maternos (origen colmena). <ol><li> Coloque panales de cría en una incubadora a 34 ° C con una humedad relativa de 60-70%. Asegúrese de guardar los peines de tal manera que la colonia emergente no puede escapar. </li><li> Deje que las abejas emergen durante dos días y marcan estas abejas con una pequeña etiqueta de la pintura en el tórax (por ejemplo Uni POSCA, Mitsubishi Pencil Co. Ltd.). La marca de pintura permitirá la identificación de las abejas de la cohorte de edad solo (día de la emergencia), y para distinguirlos de otras colonias replicadas. </li></ol></li><li> Configuración de una colonia cohorte doble, que incluye la cohorte de identified, abejas sola edad: En el día de las abejas jóvenes han sido marcados, recogen unos 2.500-3.000 abejas nido de una colonia de donantes (compare la sección 1 en la discusión.), y agregar estas abejas sin marcar a la caja de la colmena que fue preparado antes (ver paso 1.1). Estas últimas personas constituirán la cohorte de nido de abeja no identificado. <ol><li> Añadir a la reina, que se limitaba inicialmente a una jaula de la reina (disponible en el comercio). Selle la caja con dulces comestibles (por ejemplo Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Alemania) para que las abejas obreras liberan lentamente la reina. </li><li> Añadir las abejas recién nacidas y marcados, los cuales constituirán el grupo de edad único. Estas abejas son los individuos sólo marcados, y son el grupo de enfoque para todos los pasos siguientes. </li></ol></li><li> Monitoreo de forrajeo inicio y marcado recolectoras: Evaluar la aparición y la dinámica de la transición enfermera-recolector en el grupo de edad única, supervisará la evolución demográfica de la actividad de forrajeo de correomuy otro día para cada colonia. Empiece a contar cinco días después de colonias se establecieron (Figura 1). <ol><li> Cuente el número total de las abejas regresan de forrajeo vuelos (recuentos de entrada) a menos de 3 x 20 min períodos de observación a horas fijas. Asegúrese de no contar con las abejas durante los períodos de vuelos de orientación (ver Discusión). </li><li> Cuando los conteos de entrada indican una considerable actividad de forrajeo de comenzar (&gt; 100 cuentas de ingreso / día), comience marcando recolectoras. Para ello, Cosechadoras de forraje de la cohorte de edad única (individuos marcados individuales) reciben una segunda marca de pintura al regresar de sus primeros vuelos de forrajeo. Esta marca de pintura especificará el día de inicio de forrajeo, y permitirá identificar más tarde de la edad de forrajeo para cada recolector. </li><li> Repita marcas diarias hasta que un número suficiente de abejas ha sido marcado. Para la estimación de un número suficiente de forraje marcados, esperar una tasa de recuperación de no más de 5-10% después de estas abejas habían sido envejecido, típicamente después de 14 días deforrajeo. </li></ol></li><li> Muestreo: Desde todas las abejas marcadas inicialmente tienen una edad cronológica semejante, los grupos de la misma edad de las enfermeras y los recolectores de edad pueden ser recogidos de forma simultánea, cuando recolectores han alimentaban durante ≥ 14 días. <ol><li> Soltero abejas nodrizas marcadas se recogen dentro de la colmena, y se identifican por el comportamiento de enfermería (alimentación y limpieza de las larvas con las cabezas puestas en celdas de cría abiertos). </li><li> Recolectores dobles marcados también se recogen dentro de la colmena antes de que comience la actividad diaria de forrajeo. </li><li> Recoger las abejas en las jaulas (tubos, cajas) que proporcionan una ventilación suficiente, y mantener a oscuras hasta su posterior procesamiento. Alternativamente, para transcriptómica, epigenética o estudios proteómicos, snap directamente abejas congelación en nitrógeno líquido. Reunir un número equilibrado de personas de todos los grupos de prueba y replicar colonias. </li></ol></li></ol> 2. Reversión de los trabajadores con rápido a los trabajadores con el envejecimiento frenado por los cambios demográficos de la Colmena &lt;/ P&gt; En esta sección se detalla cómo se lleva a cabo la reversión de los trabajadores con el envejecimiento acelerado (recolectores) a los trabajadores con el envejecimiento lento (abejas nodrizas). La reversión del comportamiento es inducida, cuando recolectores experimentan una falta de las abejas nodrizas, que normalmente se dedican a cuidado de las crías. El procedimiento de reversión se separará una sola colonia se replica en dos colmenas: una colmena con la fracción de abeja enfermera (&quot;deriva-nurse&quot;), y otro con la fracción forrajera (&quot;derivados de recolector&quot;). Después de la inversión de éxito, posibles síntomas de plástico y revirtió el envejecimiento pueden ser estudiados en el grupo de edad solo con los trabajadores revertidas, continuando recolectores, que continúan las abejas nodrizas y recolectores de nueva contratación. Al igual que antes, las abejas identificados de la cohorte de edad única, no la cohorte de abejas nido no identificados, constituyen el grupo de enfoque experimental. <ol><li> Preparación: Replicar colmenas con las enfermeras (solo marcó) y forrajeras (doble marcado) se hacen disponibles como se describe en la sección anterior. Asegúrese de no iniciar la reversión con menos de 500 recolectores marcados por colonia réplica para garantizar la recuperación suficiente después de la reversión se ha completado. <ol><li> Para la identificación segura de los grupos de prueba después de la inversión es crucial que toda la población forrajera en la colmena original ha sido marcado antes de la reversión. El siguiente procedimiento se describe para un replicado. </li><li> El día antes de la reversión, preparar una caja colmena adicional para la colmena forager derivados (véase el paso 1.1). Localice dos reinas y dos panales de cría de las colmenas de los donantes. Antes de la transferencia a las colonias experimentales quitar todas las abejas adultas de estos peines. Una reina enjaulada (véase el paso 1.3) y un panal de cría reemplazarán queen y panales de cría en la caja original de la colmena. El otro conjunto de la reina y la cría de peine que se utilizará el día siguiente para el nuevo cuadro de colmena. Asignación similar de nuevas panales de cría y las reinas exóticas para ambos, el original y se aconseja la nueva colmena para asegurarse de que cazadores-recolectores separados y enfermeras será igualmente experiencia cambiado las señales de las colmenas (&quot;olor de la colmena&quot;). </li></ol></li><li> Reversión: Por la mañana, justo antes de la reversión, agregue la reina enjaulada y el panal de cría para la nueva caja que recibirá la fracción forrajera derivada. Espere hasta que comience la temporada alta de forrajeo. A continuación, mueva la colonia original con recolectores marcados y las abejas nodrizas al menos 100 m de distancia de la ubicación original. <ol><li> En la ubicación original, configurar el nuevo cuadro de la colmena forager derivados con la cría y única reina. </li><li> Foragers dejarán el cuadro de colmena original, dislocado, y regresar a la posición original. Permitir recolectoras para volver a la posición original durante 2 horas con el fin de lograr junto a la separación completa de la población recolectora de abejas nido. </li><li> Entonces, para terminar la separación, cerrar el Original &quot;derivada enfermera&quot; colmena, y transferirlo a un colmenar, al menos, a 3 km. </li></ol></li><li> Mantenimiento de la colmena y la supervisión de la tarea social exitosareversión: Compruebe las colmenas experimentales regularmente, cría abierta saludable. <ol><li> Durante los primeros días después de la manipulación colonia reemplazar cría desatendido y muerto para reducir el potencial de carga de patógenos. </li><li> Para validar reversión exitosa dentro de la colmena forager derivados, tomar fotos de panales de cría antes de la introducción de estos, y de nuevo cuando peines sean sustituidos o cuando el experimento reversión se completa (Figura 2). Las áreas con cría previamente destapado y con abierta, cría en vivo son marcadores confiables de la actividad de enfermería en las colonias de cosechadoras de forraje derivado. </li></ol></li><li> Muestreo: Efectos fisiológicos que acompañan a la inversión social, se pueden detectar 3-8 días después de cazadores-recolectores y las enfermeras se separaron. <ol><li> Aconsejamos a todos los grupos de pruebas de muestreo, es decir, los trabajadores revertidas y recolectores continuadas (colmena forager derivados), así como los continuos enfermeras y recolectores recién contratados (colmena enfermera derivados) 8 días después se inicia la reversión. </li><li> Columnamuestras lect como se describe en el paso 1.5. </li></ol></li></ol> 3. Análisis de tipo Trabajador Patrones senescencia celular específica por Cuantificación de lipofuscina La lipofuscina es un biomarcador universal de la senescencia celular. Como un producto de la acumulación intrínseca, autofluorescencia específica de lipofuscina (emisión máx = 530 a 650 nm) se puede utilizar para la detección de 18. <ol><li> La disección y fijación: las abejas se enfría en hielo hasta inmóvil; retirar y diseccionar a cabo la muestra de tejido deseado. <ol><li> Transferencia en fijador (4% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato, PBS, pH 7,2) para la incubación durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lávese las muestras 3 veces en PBS. </li></ol></li><li> Procesamiento de tejidos y de montaje: Cortar muestras de tejido en secciones con no más de 40 m de espesor, por ejemplo mediante el uso de un micrótomo cuchilla vibrante, por ejemplo, de Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Alemania). <ol><li&gt; Para la limpieza, se incuban secciones de tejido durante la noche en 30% de glicerol (PBS), y otro 2 horas en 50% de glicerol (PBS). </li><li> Montar secciones sobre portaobjetos de microscopio en 50% de glicerol (PBS). Para sellador para almacenamiento a largo plazo cubreobjetos con esmalte de uñas. </li></ol></li><li> La adquisición de imágenes: Detectar lipofuscina, le sugerimos utilizar un microscopio confocal de barrido láser que proporciona líneas de láser con λ = 514, 561nm o similar para la excitación, y con el ancho de banda del detector pusimos a 570-650 nm. <ol><li> Para una mejor identificación de lipofuscina, incluir un segundo canal, y hacer una exploración simultánea en los espectros de longitud de onda más corta (excitación = 405 nm; emisión = 410 a 450 nm). El canal de longitud de onda más larga revelará tanto, lipofuscina granular, sino también &quot;de fondo&quot; no específica debido a la tráquea autofluorescent y otras estructuras no granulares. El segundo canal de longitud de onda más corta solamente revelará autofluorescencia inespecíficos, pero no lipofuscina. Así, la identificación de lipofuscina puede ser faci<html> tated mediante la comparación de las señales en ambos canales, con sólo uno de ellos revelando los gránulos con lipofuscina fluorescencia específica. </li><li> Para la adquisición de imágenes de alta resolución utiliza un objetivo con un aumento de 40X o superior, y preferiblemente una apertura numérica de 1,25 o superior. Imagen Scan apila con dimensiones de aproximadamente 100 x 100 x 10 m 3. Cada muestra individual y el tejido tiene que ser representado por varias pilas de imágenes. </li><li> Para reducir la variación intraindividual e interindividual causado por la variación técnica, mantener siempre la potencia del láser y de la sensibilidad del detector constante. </li><li> Para reducir el sesgo por el día a día las variaciones técnicas escanear igual número de muestras de todos los grupos de prueba en cada una de las varias sesiones de exploración. </li></ol></li><li> Procesamiento de imágenes: Utilice los paquetes de software con módulos que permiten el procesamiento avanzado de pilas de imágenes microscópicas, por ejemplo ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, EE.UU. Estados Unidos,gej.nih.gov / ij / &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Generar una máxima proyección 2D para cada una de las pilas de imágenes en 3D. </li><li> Aplicar un filtro de Gauss con un tamaño modesto núcleo para atenuar el ruido de alta frecuencia, y para preservar las estructuras con dimensiones de los gránulos de lipofuscina. </li><li> Combinar los dos canales de color para facilitar la identificación de lipofuscina (véase el paso 3.2). </li></ol></li><li> Analiza Imagen: Asegúrese de que el tema de realizar los pasos de cuantificación será ciego para probar la identidad de grupo. <ol><li> Para todas las imágenes, haga clic a la región de interés (ROI) que cubre las estructuras pertinentes, y tiene unas dimensiones similares a las del rendimiento de la inversión a partir de otras imágenes. </li><li> A continuación, seleccione el número deseado de los gránulos de lipofuscina que representan cada ROI. Al seleccionar gránulos de lipofuscina dentro de un retorno de la inversión, la aplicación de las siguientes reglas reducirá el sesgo subjetivo. <ol><li> Elija un lugar consistente para la selección de la primera granulaciónle. Esto puede ser, por ejemplo, el borde más a la izquierda de un retorno de la inversión, y el gránulo que es más próxima al borde siempre será la primera selección. </li><li> Uno tras otro, los gránulos de los escogidos que están más cerca de la selección anterior (vecino). </li><li> Al elegir el vecino, moverse sólo en una dirección, por ejemplo, sólo buscar en la derecha de la selección anterior. Esta regla evita que la selección está dominado por grupos ocasionales de gránulos densos. </li><li> Cuando se completa la selección, evaluar el tamaño de cada partícula lipofuscina con la descripción y la medición de la zona de gránulo respectiva. Utilice las pruebas estadísticas apropiadas para comparar individuos de los diferentes grupos de prueba. </li></ol></li></ol></li></ol>

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No tenemos nada que revelar.

Estamos aquí adoptamos anteriormente descrito se acerca 8,16,17,19,20, e integrarlos en un único flujo de trabajo que facilitará el estudio del envejecimiento flexibles en las abejas de miel. Nuestro objetivo es proporcionar a los científicos que son novatos en este campo con una herramienta estandarizada establecido para obtener material de la muestra correspondiente, y para mejorar la reproducibilidad experimental entre los diferentes equipos de investigación. Mientras que nuestros procedimientos se si...

Las complejas estructuras de colonias de animales altamente sociales se mantienen a través de la interacción de una casta reproductiva, y una casta de ayudante normalmente los trabajadores no se reproduzcan con las diferentes conductas de tarea social. En los diferentes trabajadores, las adaptaciones fisiológicas específicas permiten a los comportamientos de cuidado sib distintas, y también están vinculados a las diferencias de vida útil extremas. Las abejas y las ratas topo representan los modelos animales más desarrollados para estudiar cómo la sociabilidad está vinculada a patrones de aceleración, insignificante o invertido envejecimiento 1-3. En las colonias de abejas de miel, una sola reina que pone huevos con la asistencia de miles de trabajadores que tienden a las crías, buscar comida, y participar en la vigilancia, la termorregulación o comportamientos de higiene 4. Entre estos trabajadores son los recolectores extremadamente efímeras, las abejas nodrizas con intermedio, y el invierno (diutinus) esperanzas de vida más largas con las abejas. Los individuos, sin embargo, no están obligados permanentemente a cierto wotipo rker, pero mostrar una ontogenia conductual flexibles: se cambian de un comportamiento tarea social a otro (&quot;castas temporales&quot;). Abejas Callow pueden cambiar a la cría tendiendo las abejas nodrizas, que con el tiempo puede cambiar al forrajeo exterior. Sin embargo, las abejas nido inexperto también pueden transformarse en las abejas más longevos de invierno, y recolectores de corta duración, incluso puede volver a enfermeras típicamente de vida más larga. Trabajadores con extrema (las abejas de invierno) e intermedio (abejas nodrizas) vida han bien desarrollado de producción y almacenamiento de alimentos órganos con cuantiosos recursos - a diferencia de cazadores-recolectores de corta duración (revisado en 1,5). Sin embargo, que la regulación de la vida útil individuo va más allá de simples cambios en el equilibrio de los recursos de un individuo es sugerido por la investigación sobre una proteína de la yema, que tiene diversas funciones adaptadas en el trabajador de castas no reproducir, como la producción de jalea de 6, control hormonal 7, inmune 8 y anti-oxidante defensa 9. Los patrones de fdisminución unctional (senescencia) disparidades espejo de vida útil entre los trabajadores, según lo establecido para olfativo, y también para otras funciones cerebrales o motoras 10-13. Específicamente, la disminución significativa en la función de aprendizaje después de sólo dos semanas de forrajeo coincide con una progresión similar en la mortalidad de forraje 14, en oposición a la falta de disminución detectable (senescencia insignificante) en de larga vida abejas de invierno 15. Para identificar las huellas dactilares moleculares del envejecimiento flexibles adaptamos paradigmas experimentales establecidos que permitan el seguimiento y la manipulación de las transiciones de tipo de envejecimiento 8,16,17. Experimento 1 se detalla cómo obtener muestras en las que los efectos de la edad cronológica y de tipo trabajador conductas sociales específicas sobre el envejecimiento pueden separarse. Experimento 2 se describe la inversión de cazadores-recolectores con acelerados en las abejas nodrizas con dinámica de envejecimiento más lento. Experimento 3 se presenta un enfoque para probar los efectos de la senescencia celular por anatomical cuantificación de un biomarcador establecido para el envejecimiento celular (lipofuscina) 18.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apifonda</td>
 <td>S&uuml;dzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>paraformaldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>158127</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>phosphate-buffered saline</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.04094.1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

obtaining specimens with slowed, accelerated and reversed aging in the honey bee model

Sociedades de animales altamente sociales cuentan con grandes diferencias de vida útil entre individuos estrechamente relacionados. Entre los insectos sociales, la abeja de la miel es el mejor modelo establecido para estudiar cómo la plasticidad en la vida útil y el envejecimiento se explica por factores sociales. La casta de obreras de las abejas melíferas incluye las abejas nodrizas, que tienden la cría y abejas para cosechadoras de forraje, que recogen el néctar y el polen. Trabajos anteriores han demostrado que las funciones del cerebro y el rendimiento de vuelo envejecen más rápidamente en los cazadores-recolectores que en las enfermeras. Sin embargo, las funciones del cerebro pueden recuperar, cuando recolectoras vuelven a sus tareas de enfermería. Estos patrones de senescencia funcional acelerada y revirtió están vinculados a los niveles modificados de recursos metabólicos, alteraciones en la abundancia de proteínas y la función inmune. La vitelogenina, una proteína de la yema con funciones adaptadas en el control hormonal y de defensa celular, puede servir como un elemento regulador importante en una red que controla las diferentes dinámicas de envejecimiento de los trabajadores. A continuación se describe la forma en la aparición de las enfermeras y los cazadores-recolectores se puede controlar, y manipulado, incluyendo la reversión de cazadores-recolectores normalmente de corta duración en las enfermeras de vida más larga. Nuestros resultados representativos muestran cómo los individuos con edad cronológica similares diferencian en cazadores-recolectores y las abejas nodrizas, en condiciones experimentales. Ejemplificamos cómo reversión del comportamiento de los cazadores-recolectores de nuevo a las enfermeras puede ser validado. Última, mostramos cómo los diferentes senescencia celular se puede evaluar mediante la medición de la acumulación de lipofuscina, un biomarcador universal de la senescencia. Para el estudio de los mecanismos que pueden vincular las influencias sociales y el envejecimiento de la plasticidad, este protocolo constituye un instrumento estandarizado establecido para adquirir material de la muestra correspondiente, y para mejorar la comparabilidad de los datos entre los estudios futuros.

Secciones 1 y 2 del Protocolo de detalle cómo los grupos de prueba se pueden obtener a estudiar los atributos de aceleración, más lentos y revierten el envejecimiento en las colonias con una sola cohorte de edad. Para controlar la diferenciación de tipo de trabajo que acompaña a la ontogenia normal, se evaluó el recuento para cosechadoras de forraje (&quot;puntajes de ingreso&quot;) para 6 colonias (Figura 1, compare la sección 1). Los gráficos muestran que un cambio considerable de la enfermera...

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Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

En los trabajadores de abejas, el envejecimiento depende de los comportamientos sociales, más que en la edad cronológica. Aquí se muestra cómo se pueden obtener y se analizó la senescencia celular trabajadores-con tipos muy diferentes patrones de envejecimiento.

La obtención de especímenes con desacelerado, acelerado y Invertida Envejecimiento en la abeja de la miel Modelo

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

obtaining-specimens-with-slowed-accelerated-reversed-aging-honey-bee

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K vistas.  Norwegian University of Life Sciences.  En los trabajadores de abejas, el envejecimiento depende de los comportamientos sociales, más que en la edad cronológica. Aquí se muestra cómo se pueden obtener y se analizó la senescencia celular trabajadores-con tipos muy diferentes patrones de envejecimiento. 

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In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

En vivo Ca 2 + - Imágenes de las neuronas del cuerpo de hongos durante el aprendizaje olfativo en la abeja de la miel

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Investigación

Biología

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualizar el corazón latiendo en Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Los métodos para la comparación de Nutrientes en jalea real Realizado por africanizadas y europeas Honey Bees y los efectos sobre títulos hemolinfa de proteínas

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

La disección y la observación de la abeja de la miel dorsal del recipiente de Estudios de la función cardiaca

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Controles Colonia efectos de exposición a los pesticidas subletales en las abejas de miel

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Ensayo de cribado basado en sA-Galactosidasa para la identificación de medicamentos senoterapéuticos

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis. This has traditionally been done by netting foragers at nest entrances or on flowers, chilling the bees on ice, and then removing the pollen loads from the corbiculae with forceps or a brush. This method is time and labor intensive, may alter normal foraging behavior, and can result in stinging incidents for the worker performing the task. Pollen traps, such as those used on honey bee hives, collect pollen by dislodging corbicular pollen loads from the legs of workers as they pass through screens at the nest entrance. Traps can remove a large quantity of pollen from returning forager bees with minimal labor, yet to date no such trap is available for use with bumble bee colonies. Workers within a bumble bee colony can vary in size making size selection of entrances difficult to adapt this mechanism to commercially reared bumble bee hives. Using 3D printing design programs, we created a pollen trap that successfully removes the corbicular pollen loads from the legs of returning bumble bee foragers. This method significantly reduces the amount of time required by researchers to collect pollen from bumble bee foragers returning to the colony. We present the design, results of pollen removal efficiency tests, and suggest areas of modifications for investigators to adapt traps to a variety of bumble bee species or nest box designs.

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

We present a non-lethal and automated mechanism to collect pollen from bumble bee (Bombus) workers returning to a hive. Instructions for producing, preparing, installing and using the devices are included. By using 3D-printed objects, modification to the design was timely, efficient and allowed for quick turnaround for testing.

Una trampa de polen impresa en 3D para las entradas de la colmena deabejorros (Bombus)

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in all vertebrates by providing feedback to the brain and pituitary. Teleost fishes possess a higher degree of tissue plasticity and variation in reproductive&#160;strategies compared to mammals and appear to be useful models to investigate the role of sex steroids and the mechanisms by which they act. The removal of the main source of sex steroid production using gonadectomy together with blood sampling to measure steroid levels has been well-established and fairly feasible in bigger fish and is a powerful technique to investigate the role and effects of sex steroids. However, these techniques raise challenges when implemented in small size teleost models. Here, we describe the step-by-step procedures of gonadectomy in both males and female Japanese medaka followed by blood sampling. These protocols are shown to be highly feasible in medaka indicated by a high survival rate, safety for the life span and phenotype of the fish, and reproducibility in terms of sex steroid clearance. The use of these procedures combined with the other advantages of using this small teleost model will greatly improve the understanding of feedback mechanisms in the neuroendocrine control of reproduction and tissue plasticity provided by sex steroids in vertebrates.

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

The article describes a quick protocol to gonadectomize and sample blood from the small teleost fish, using Japanese medaka (Oryzias latipes) as a model, to investigate the role of sex steroids in animal physiology.

Procedimientos de gonadectomía y muestreo de sangre en el modelo de teleósto de tamaño pequeño japonés Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate pesticide exposure of bees via pollen. Described herein is an effective pollen-trapping method for collecting corbicular pollen from honey bees returning to their hives. This collection method results in large quantities of corbicular pollen that can be used for research purposes. Honey bees collect pollen from many plant species, but typically visit one species during each collection trip. Therefore, each corbicular pollen pellet predominantly represents one plant species, and each pollen pellet can be described by color. This allows the sorting of samples of corbicular pollen by color to segregate plant sources. Researchers can further classify corbicular pollen by analyzing the morphology of acetolyzed pollen grains for taxonomic identification. These methods are commonly used in studies related to pollinators such as pollination efficiency, pollinator foraging dynamics, diet quality, and diversity. Detailed methodologies are presented for collecting corbicular pollen using pollen traps, sorting pollen by color, and acetolyzing pollen grains. Also presented are results pertaining to the frequency of pellet colors and taxa of corbicular pollen collected from honey bees in five different cropping systems.

We describe methods for collecting corbicular pollen from honey bees as well as protocols for color sorting, acetolysis, and microscope slide preparation of pollen for taxonomic identification. In addition, we present pellet color and taxonomic diversity of corbicular pollen collected from five cropping systems using pollen traps.

Recolección e identificación de polen de colonias de abejas melíferas

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...