Nous remercions Osman Kaftanoglu pour obtenir des conseils utiles et d&#39;assistance pendant le tournage. Nous tenons à remercier les relecteurs anonymes pour les commentaires perspicaces. Ce travail a été soutenu par le Conseil norvégien de la recherche (accorde 180504, 191699, 213976 et), Marie Curie/FP7 (projet ref. 238665), le National Institute on Aging (NIA subvention P01 AG22500), et les Pew Charitable Trusts.

Une. Le découplage de la sénescence âge chronologique Cette section décrit la configuration des colonies de la double cohorte, qui consistent d&#39;une cohorte d&#39;individus identifiés qui partagent le même âge chronologique («cohorte d&#39;âge unique&quot;) et une cohorte d&#39;abeilles nid. Les personnes âgées de même de la cohorte d&#39;âge unique finiront par se séparer en différents types de travailleurs ayant des dynamiques du vieillissement - ce sont les nourrices avec des abeilles butineuses ralenti et avec le déclin fonctionnel accéléré. Toutes les procédures sont décrites pour une colonie expérimentale. Nous vous conseillons cependant, d&#39;effectuer des expériences pour au moins deux répétitions colonie de sorte que les effets de la colonie peuvent être contrôlés pour (deux répliquée-conception). <ol><li> Préparation des boîtes de ruche pour les colonies de la double cohorte: Préparez une boîte régulière de ruche qui reçoit deux peignes alimentaires avec du miel, un autre peigne alimentaire avec du pollen, et deux rayons vides. Assurez-vous de trouver une reine fécondée ainsi qu&#39;une colonie de donateurs de plus de 3000abeilles nid. Les deux seront introduits plus tard (1.3). </li><li> L&#39;obtention et le marquage des individus avec l&#39;âge chronologique similaire: Recueillir peignes avec couvain operculé qui est sur ​​le point d&#39;émerger. Pour une répétition s&#39;attendre à recevoir des peignes avec un total de 3000-5000 cellules de couvain. Pour chaque répétition utiliser une quantité équilibrée de couvain d&#39;au moins trois sources différentes ruches pour éviter les distributions asymétriques de génotypes maternels (origine ruche). <ol><li> Placez couvain dans un incubateur réglé à 34 ° C avec 60-70% d&#39;humidité relative. Assurez-vous de stocker des peignes de telle manière que couvain naissant ne peut pas s&#39;échapper. </li><li> Laissez les abeilles sortent pendant deux jours et marquent ces abeilles avec une petite étiquette de peinture sur le thorax (par exemple POSCA Uni, Mitsubishi Pencil Co. Ltd). La marque de peinture permettra d&#39;identifier les abeilles de la cohorte d&#39;âge unique (jour de l&#39;émergence), et de les distinguer des autres colonies répétés. </li></ol></li><li> Mise en place d&#39;une colonie de la double cohorte, qui comprend la cohorte de identified, les abeilles d&#39;âge unique: Le jour de jeunes abeilles ont été marqués, recueillent environ 2500-3000 abeilles de nidification d&#39;une colonie de donateurs (comparer l&#39;article 1 dans la discussion.), et ajouter ces abeilles non marquées à la boîte de ruche qui a été préparé avant (voir l&#39;étape 1.1). Les derniers individus constituent le nid d&#39;abeille non identifié cohorte. <ol><li> Ajouter la reine, qui sera initialement limité à une cage de reine (disponible dans le commerce). Sceller la cage avec des bonbons comestible (par exemple Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Allemagne) pour faire ouvrières libèrent lentement la reine. </li><li> Ajouter les abeilles nouvellement écloses et marqués, qui vont constituer la cohorte d&#39;âge unique. Ces abeilles sont les individus ne marquées, et sont le groupe de discussion pour toutes les étapes suivantes. </li></ol></li><li> Suivi recherche de nourriture apparition et butineuses marquage: Pour évaluer l&#39;apparition et de la dynamique de la transition infirmière-fourrier dans la cohorte d&#39;âge unique, de suivre l&#39;évolution démographique de l&#39;activité recherche de nourriture etrès autre jour pour chaque colonie. Commencer à compter les cinq jours suivant colonies ont été créées (Figure 1). <ol><li> Compter le nombre total d&#39;abeilles revenant de recherche de nourriture des vols (chiffres d&#39;entrée) à moins de 3 x 20 périodes d&#39;observation min à heures fixes. Assurez-vous de ne pas compter les abeilles pendant les périodes de vols d&#39;orientation (voir Discussion). </li><li> Lorsque les chiffres d&#39;entrée indiquent l&#39;activité de recherche de nourriture considérable pour commencer (&gt; 100 comptes d&#39;entrée / jour), commencer butineuses marquage. Pour ce faire, les butineuses de la cohorte d&#39;âge unique (individus marqués simples) reçoivent une deuxième marque de peinture au retour de leurs premiers vols de recherche de nourriture. Cette marque de peinture doit préciser le jour de la recherche de nourriture apparition, et permettra d&#39;identifier plus tard l&#39;âge de la recherche de nourriture pour chaque butineuse. </li><li> Répétez marques quotidiennes jusqu&#39;à ce qu&#39;un nombre suffisant d&#39;abeilles a été marqué. Pour estimer un nombre suffisant de butineuses marqués, s&#39;attendre à un taux de récupération de plus de 5-10% après ces abeilles avaient été âgés, généralement après 14 jours dela recherche de nourriture. </li></ol></li><li> Échantillonnage: Comme toutes les abeilles d&#39;abord marquées ont un âge chronologique, groupes d&#39;infirmières et de vieilles butineuses même âge peuvent être collectées simultanément, lorsque les butineuses ont butiné pour ≥ 14 jours. <ol><li> Simples nourrices marqués sont recueillies dans la ruche, et sont identifiés par des comportements de soins (alimentation et nettoyage des larves de têtes mises dans des cellules de couvain ouvert). </li><li> Butineuses doubles marqués sont également recueillies dans la ruche avant le début de l&#39;activité quotidienne la recherche de nourriture. </li><li> Recueillir les abeilles dans des cages (tubes, boîtes) qui fournissent une ventilation suffisante, et garder sombre jusqu&#39;à leur traitement ultérieur. Sinon, pour transcriptomique, protéomique épigénétique ou études, calées abeilles de congélation dans l&#39;azote liquide. Collecter des numéros équilibré des individus de tous les groupes d&#39;essai et de reproduire colonies. </li></ol></li></ol> 2. Reprise des travailleurs avec Rapid de travailleurs avec le vieillissement ralentie par l&#39;évolution démographique de la Ruche &lt;/ P&gt; Cette section détaille la façon dont la reprise de travailleurs avec un vieillissement accéléré (des butineuses) aux travailleurs avec le vieillissement ralenti (infirmières des abeilles) est effectuée. Cette inversion de comportement est induit, lorsque les butineuses face à un manque de nourrices, qui exercent normalement dans les soins du couvain. La procédure de réversion sera séparer une seule colonie répliquer dans deux ruches: une ruche avec la fraction infirmière d&#39;abeille («infirmière-dérivé&quot;), et une autre avec la fraction de butineuse (&quot;butineuse dérivés&quot;). Après inversion réussie, les symptômes possibles de plastique et de vieillissement inversé peuvent être étudiés dans la cohorte d&#39;âge unique des travailleurs rétrocédés, les fouilleurs continue, continue nourrices et butineuses nouvellement recrutés. Comme avant, les abeilles identifiés de la cohorte d&#39;âge unique, pas la cohorte des abeilles nid non identifiés, constituent le groupe de discussion expérimental. <ol><li> Préparation: Répliquer ruches avec des infirmières (seul marqué) et butineuses (double marquée) sont mis à disposition comme décrit dans la section précédente. Assurez-vous de ne pas commencer la réversion de moins de 500 butineuses marqués par répétition colonie pour assurer la récupération suffisante après le retour a été achevée. <ol><li> Pour une identification sûre des groupes d&#39;essai après l&#39;inversion, il est essentiel que l&#39;ensemble de la population de butineuses dans la ruche d&#39;origine a été marqué avant de réversion. La procédure suivante est décrite pour une répliquée. </li><li> La veille de la réversion, préparer un champ de ruche supplémentaire pour la ruche de butineuse dérivés (voir l&#39;étape 1.1). Repérez les deux reines et deux cadres de couvain de ruches donateurs. Avant le transfert vers les colonies expérimentales balayer toutes les abeilles adultes de ces peignes. Une reine en cage (voir l&#39;étape 1.3) et un couvain remplaceront reine et couvains dans la boîte de ruche d&#39;origine. L&#39;autre série de la reine et du couvain peigne sera utilisé le lendemain pour la nouvelle boîte de ruche. Répartition similaire de nouveaux cadres de couvain et les reines exotiques pour les deux, l&#39;original et la nouvelle ruche est conseillé de s&#39;assurer que les butineuses séparés et infirmières aura également l&#39;expérience changé indices ruche (&quot;odeur ruche&quot;). </li></ol></li><li> Réversion: Dans la matinée, juste avant le retour, ajouter la reine en cage et le couvain à la nouvelle boîte qui recevra la fraction de butineuse dérivés. Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;heure de pointe de recherche de nourriture commence. Puis déplacez la colonie d&#39;origine avec butineuses balisés et nourrices au moins 100 m de l&#39;emplacement d&#39;origine. <ol><li> À l&#39;emplacement d&#39;origine, mettre en place la nouvelle boîte pour la ruche de butineuse dérivé de couvain et de la reine seulement. </li><li> Les butineuses vont quitter la boîte de ruche d&#39;origine luxation, et de retourner à l&#39;emplacement d&#39;origine. Permettre aux butineuses pour revenir à l&#39;emplacement d&#39;origine pendant 2 heures pour atteindre à côté de la séparation complète de la population butineuse des abeilles nid. </li><li> Ensuite, pour mettre fin à la séparation, fermer l&#39;original, maintenant &quot;infirmière dérivés&quot; ruche, et transférer à un rucher à moins de 3 km. </li></ol></li><li> Entretien ruche et suivi pour tâche sociale réussieinversion: Vérifiez les ruches expérimentales régulièrement pour la santé, couvain ouvert. <ol><li> Pendant les premiers jours après la manipulation de la colonie remplacer couvain sans surveillance et mort à réduire la charge pathogène potentiel. </li><li> Pour valider inversion réussie au sein de la ruche de butineuse dérivés, prendre des photos de rayons de couvain avant l&#39;introduction de ceux-ci, et à nouveau lorsque les peignes sont remplacés ou lorsque l&#39;expérience de réversion est terminée (Figure 2). Zones de couvain précédemment non plafonné et ouvert avec, nichée en direct sont des marqueurs fiables de l&#39;activité de soins infirmiers dans les colonies de butineuses dérivés. </li></ol></li><li> Échantillonnage: effets physiologiques qui accompagnent inversion sociale peuvent être détectés 3-8 jours après butineuses et les infirmières ont été séparées. <ol><li> Nous vous conseillons d&#39;échantillonnage tous les groupes d&#39;essai, les travailleurs à-dire rétrocédés et butineuses poursuivies (ruche de butineuse dérivés), ainsi que les infirmières poursuivies et butineuses nouvellement recrutés (ruche infirmière dérivés) 8 jours après inversion est lancée. </li><li> ColLect échantillons comme décrit dans l&#39;étape 1.5. </li></ol></li></ol> 3. Analyser travailleur de type Patterns de la sénescence cellulaire spécifique par quantification de Lipofuscin Lipofuscine est un biomarqueur universel de la sénescence cellulaire. En tant que produit d&#39;accumulation intrinsèque, autofluorescence spécifique de lipofuscine (émission max = 530-650 nm) peut être utilisée pour la détection 18. <ol><li> Dissection et fixation: abeilles de froid sur la glace jusqu&#39;à ce que immobile; supprimer et disséquer l&#39;échantillon de tissu désiré. <ol><li> Transférer dans un fixateur (paraformaldéhyde 4% dans une solution saline tamponnée au phosphate, PBS, pH 7,2) pour une incubation pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Lavez échantillons 3 fois en PBS. </li></ol></li><li> Transformation de tissus et de montage: Couper des échantillons de tissus en sections avec plus de 40 um d&#39;épaisseur, par exemple en utilisant un microtome à lame vibrante, par exemple Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Allemagne). <ol><li&gt; Pour la compensation, incuber les coupes de tissus nuit dans 30% de glycérol (PBS), et un autre 2 heures dans 50% de glycérol (PBS). </li><li> Montez les sections sur des lames microscopiques dans 50% de glycérol (PBS). Pour sceau de stockage à long terme couvercle glisse avec le vernis à ongles. </li></ol></li><li> acquisition de l&#39;image: Pour détecter lipofuscine, nous vous conseillons d&#39;utiliser un microscope confocal à balayage laser qui fournit des lignes laser avec λ = 514, 561nm ou similaire pour l&#39;excitation, et la largeur de bande du détecteur fixé à 570-650 nm. <ol><li> Pour une meilleure identification de la lipofuscine, inclure un second canal, et faire un scan simultané à des spectres de longueur d&#39;onde plus courte (excitation = 405 nm; émission = 410-450 nm). Le canal de longueur d&#39;onde va révéler à la fois, la lipofuscine granulaire, mais aussi &quot;fond&quot; non spécifique en raison de la trachée autofluorescente et autres structures non granulaires. La deuxième, canal de longueur d&#39;onde plus courte ne révèlera autofluorescence non spécifique, mais pas lipofuscine. Ainsi, l&#39;identification de lipofuscine peut être faci<html> Tated en comparant les signaux dans les deux canaux, avec un seul d&#39;entre eux révéler les granules avec la fluorescence spécifique de la lipofuscine. </li><li> Pour l&#39;acquisition d&#39;images à haute résolution utiliser un objectif avec un grossissement de 40X ou plus, et de préférence une ouverture numérique de 1,25 ou plus. Image de balayage cumule avec des dimensions d&#39;environ 100 x 100 x 10 um 3. Chaque échantillon individuel et le tissu doit être représenté par plusieurs piles d&#39;images. </li><li> Pour réduire les variations intra-individuelles et inter-individuelles causée par la variation technique, gardez toujours la puissance du laser et la constante de la sensibilité du détecteur. </li><li> Pour réduire les biais par jour le jour les variations techniques numériser un nombre d&#39;échantillons égal de tous les groupes de test dans chacune des plusieurs séances de balayage. </li></ol></li><li> Traitement de l&#39;image: Utilisez des logiciels avec des modules qui permettent de traitement avancé des piles d&#39;images microscopiques, par exemple ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Etats-Unis,gej.nih.gov / ij / &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Générer une projection maximale 2D pour chacune des piles d&#39;images 3D. </li><li> Appliquer un filtre de Gauss avec une taille de noyau modeste afin d&#39;atténuer le bruit à haute fréquence, et de préserver des structures avec des dimensions de granules de lipofuscine. </li><li> Fusionner les deux canaux de couleur pour faciliter l&#39;identification de lipofuscine (voir l&#39;étape 3.2). </li></ol></li><li> Analyses Image: Assurez-vous que le sujet d&#39;effectuer les étapes de quantification sera aveugle pour tester l&#39;identité du groupe. <ol><li> Pour toutes les images, choisissez d&#39;abord une région d&#39;intérêt (ROI) qui couvre les structures concernées, et a des dimensions similaires à celles du ROI d&#39;autres images. </li><li> Ensuite, sélectionnez le nombre souhaité de granules de lipofuscine qui représentent chaque ROI. Lors de la sélection des granules de lipofuscine dans un retour sur investissement, l&#39;application des règles suivantes sera de réduire le biais subjective. <ol><li> Choisissez un emplacement cohérent pour sélectionner la première granulationle. Cela peut être, par exemple, le bord le plus à gauche d&#39;un retour sur investissement, et le granulé qui est plus proche du bord sera toujours le premier choix. </li><li> Un après l&#39;autre, les granules sont choisis qui sont le plus proche de la sélection précédente (à côté du voisin). </li><li> Lorsque vous choisissez le voisin, se déplacer que dans un sens, par exemple que la recherche à droite de la sélection précédente. Cette règle empêche que la sélection est dominé par des groupes occasionnels de granules denses. </li><li> Lorsque la sélection est terminée, déterminer la taille de chaque particule de la lipofuscine en exposant et en mesurant la surface des granules respectif. Utilisez tests statistiques appropriés pour comparer les individus des différents groupes de test. </li></ol></li></ol></li></ol>

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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attraction+of+reproductive+honey+bee+swarms+to+artificial+nests+by+Nasonov+pheromone.">Attraction of reproductive honey bee swarms to artificial nests by Nasonov pheromone.</a> Journal of Chemical Ecology. 20, 1053-1056 (1994).</li><li>De Moraes, R., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+cell+death+in+the+hypopharyngeal+gland+of+the+honey+bee+(Apis+mellifera+L).">Modes of cell death in the hypopharyngeal gland of the honey bee (Apis mellifera L).</a> Cell Biol Internat. 24, 737-743 (2000).</li><li>Sheehy, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-cytometric+method+for+quantification+of+neurolipofuscin+and+comparison+with+existing+histological+and+biochemical+approaches.">A flow-cytometric method for quantification of neurolipofuscin and comparison with existing histological and biochemical approaches.</a> Arch Gerontol Geriatr. 34, 233-248 (2002).</li><li>Hsieh, Y. S., Hsu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honeybee+trophocytes+and+fat+cells+as+target+cells+for+cellular+senescence+studies.">Honeybee trophocytes and fat cells as target cells for cellular senescence studies.</a> Exp Gerontol. 46, 233-240 (2011).</li><li>Wolschin, F., Munch, D., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+proteomic+analyses+reveal+regional+brain+differences+during+honeybee+aging.">Structural and proteomic analyses reveal regional brain differences during honeybee aging.</a> J Exp Biol. 212, 4027-4032 (2009).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Nous adoptons ici approches décrites précédemment 8,16,17,19,20, et les intégrer dans un seul flux de travail qui facilitera l&#39;étude de vieillissement souple chez les abeilles. Notre objectif est de fournir aux scientifiques qui sont novices dans ce domaine avec un outil normalisé fixé pour obtenir du matériel de l&#39;échantillon concerné, et à améliorer la reproductibilité expérimentale entre différentes équipes de recherche. Bien que nos procédures sont simplifiées et ne nécessitent ...

Les structures de la colonie complexes des animaux très sociaux sont maintenus grâce à l&#39;interaction d&#39;une caste de reproduction, et une caste d&#39;aide de typiquement travailleurs non-croisements avec des comportements différents de la tâche sociale. Dans les différentes catégories de travailleurs, des adaptations physiologiques spécifiques permettent des comportements de soins de sib distinctes, et sont également liés à des différences de durée de vie extrêmes. Les abeilles et les rats-taupes représentent modèles animaux les mieux développés pour étudier comment la socialité est liée à des motifs de l&#39;accélération, négligeable ou inversé vieillissement 1-3. Dans les colonies d&#39;abeilles, une seule reine de ponte est assisté par des milliers de travailleurs qui tendent le couvain, le fourrage pour la nourriture, et de s&#39;engager dans la garde, la thermorégulation ou comportements d&#39;hygiène 4. Parmi ces travailleurs sont les butineuses très courte durée de vie, nourrices avec intermédiaire, et l&#39;hiver (diutinus) abeilles avec une durée de vie plus longue. Les individus, cependant, ne sont pas liées de façon permanente à une certaine wode type rker, mais afficher une ontogenèse du comportement souple: ils changent de comportement de la tâche sociale à l&#39;autre («castes temporelles»). Abeilles Callow peuvent changer à couvain tendant nourrices, qui a finalement peut changer à la recherche de nourriture à l&#39;extérieur. Cependant, les abeilles inexpérimenté de nidification peuvent aussi se transformer en abeilles d&#39;hiver la plus longue durée de vie, et les butineuses de courte durée peuvent même revenir en infirmières généralement de plus longue durée. Les travailleurs avec une extrême (abeilles d&#39;hiver) et intermédiaire (nourrices) durée de vie ont bien développé production et de stockage organes alimentaires avec des ressources abondantes - par opposition à butineuses de courte durée (examinés dans 1,5). Cependant, que la réglementation de la durée de vie individuelle va au-delà de simples changements dans l&#39;équilibre d&#39;une personne ressource est suggéré par les recherches sur une protéine de jaune, qui a des fonctions adaptées divers dans la non-reproduction travailleur caste, comme la production de gelée 6, contrôle hormonal 7, immunitaire 8 et anti-oxydant défense 9. Les modèles de fbaisse unctional (sénescence) des disparités miroir de la durée de vie chez les travailleurs, établie pour olfactif, et aussi pour d&#39;autres fonctions cérébrales ou motrices 10-13. Plus précisément, la baisse significative de la fonction d&#39;apprentissage après seulement deux semaines de recherche de nourriture correspond à une progression de la mortalité similaire dans butineuses 14, par opposition à l&#39;absence de baisse détectable (sénescence négligeable) des abeilles 15 hiver longue durée de vie. Pour identifier les empreintes moléculaires du vieillissement souple, nous avons adapté paradigmes expérimentaux établis qui permettent de surveiller et de manipuler des transitions de type vieillissement 8,16,17. Expérience 1 détails la façon d&#39;obtenir des échantillons dans lesquels les effets de l&#39;âge chronologique et comportements sociaux spécifiques de type travailleur sur le vieillissement peuvent être séparés. Expérience 2 décrit le renversement des butineuses avec accélérées dans les nourrices avec la dynamique de vieillissement ralentis. Expérience 3 propose une approche pour sonder les effets de la sénescence cellulaire par anatomical quantification d&#39;un biomarqueur établi pour le vieillissement cellulaire (lipofuscine) 18.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apifonda</td>
 <td>S&uuml;dzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>paraformaldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>158127</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>phosphate-buffered saline</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.04094.1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

obtaining specimens with slowed, accelerated and reversed aging in the honey bee model

Sociétés d&#39;animaux très sociaux disposent de grandes différences de durée de vie entre les individus étroitement liés. Chez les insectes sociaux, l&#39;abeille est le meilleur modèle créé pour étudier la façon dont la plasticité dans la durée de vie et le vieillissement s&#39;explique par des facteurs sociaux. La caste des travailleurs des abeilles comprend nourrices, qui tendent le couvain et les abeilles butineuses, qui recueillent le nectar et le pollen. Des travaux antérieurs ont montré que les fonctions du cerveau et de la performance de vol sénescence plus rapidement dans les butineuses que chez les infirmières. Toutefois, les fonctions du cerveau peuvent récupérer, lorsque les butineuses reviennent à des tâches de soins infirmiers. Ces modèles de sénescence accélérée fonctionnelle et inversée sont liés aux niveaux de ressources métaboliques modifiées, à des altérations de la protéine abondance et de la fonction immunitaire. Vitellogénine, une protéine de jaune avec des fonctions adaptées à contrôle hormonal et de défense cellulaire, peut servir d&#39;élément de régulation important dans un réseau qui contrôle les différentes dynamiques du vieillissement chez les travailleurs. Ici, nous décrivons comment l&#39;émergence d&#39;infirmières et de butineuses peut être surveillé et manipulé, y compris la reprise de butineuses généralement de courte durée dans les infirmières de plus longue durée. Nos résultats représentatifs montrent comment les individus avec un âge chronologique se différencient en butineuses et nourrices dans des conditions expérimentales. Nous illustrons comment inversion comportementale de butineuses dos des infirmières peut être validé. Enfin, nous montrons comment les différents sénescence cellulaire peut être évaluée en mesurant l&#39;accumulation de lipofuscine, un biomarqueur universel de la sénescence. Pour étudier les mécanismes qui peuvent lier les influences sociales et vieillissement plasticité, ce protocole fournit un outil standardisé mis d&#39;acquérir du matériel de l&#39;échantillon concerné, et d&#39;améliorer la comparabilité des données entre les études futures.

sections 1 et 2 du Protocole détail comment les groupes de tests peuvent être obtenus à étudier les attributs de l&#39;accélération, ralenti et inversés vieillissement dans les colonies avec une seule cohorte d&#39;âge. Pour contrôler la différenciation de type travailleur qui accompagne l&#39;ontogenèse normale, nous avons évalué les chiffres butineuses («dénombrements d&#39;entrée») pour 6 colonies (figure 1, comparer section 1). Les graphiques montrent que le changement considérable...

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Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Chez les travailleurs d&#39;abeilles, le vieillissement dépend de comportements sociaux plutôt que sur l&#39;âge chronologique. Ici, nous montrons comment les travailleurs-types avec des modèles très différents de vieillissement peuvent être obtenues et analysées pour la sénescence cellulaire.

Obtenir des échantillons avec ralenti accéléré et inversé vieillissement dans le Honey Bee Modèle

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

obtaining-specimens-with-slowed-accelerated-reversed-aging-honey-bee

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K vues.  Norwegian University of Life Sciences.  Chez les travailleurs d'abeilles, le vieillissement dépend de comportements sociaux plutôt que sur l'âge chronologique. Ici, nous montrons comment les travailleurs-types avec des modèles très différents de vieillissement peuvent être obtenues et analysées pour la sénescence cellulaire. 

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In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Imagerie des neurones du corps champignons Pendant l&#39;apprentissage olfactif dans le Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Recherche

Biologie

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualiser le cœur battant Drosophile</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Méthodes de comparaison des éléments nutritifs dans gelée royale faites par africanisées et Honey Bees européenne et les effets sur hémolymphe Les titres de protéines

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Dissection et observation de Honey Bee Dorsale Navire d&#39;études de la fonction cardiaque

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Surveiller les effets de la colonie-niveau d’exposition aux pesticides sublétale sur les abeilles à miel

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Méthodes d’étude des changements dans l’agrégation des protéines inhérente avec l’âge chez Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Essai de dépistage basé sur sA-MD-Galactosidase pour l'identification des médicaments sérothérapeutiques

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis. This has traditionally been done by netting foragers at nest entrances or on flowers, chilling the bees on ice, and then removing the pollen loads from the corbiculae with forceps or a brush. This method is time and labor intensive, may alter normal foraging behavior, and can result in stinging incidents for the worker performing the task. Pollen traps, such as those used on honey bee hives, collect pollen by dislodging corbicular pollen loads from the legs of workers as they pass through screens at the nest entrance. Traps can remove a large quantity of pollen from returning forager bees with minimal labor, yet to date no such trap is available for use with bumble bee colonies. Workers within a bumble bee colony can vary in size making size selection of entrances difficult to adapt this mechanism to commercially reared bumble bee hives. Using 3D printing design programs, we created a pollen trap that successfully removes the corbicular pollen loads from the legs of returning bumble bee foragers. This method significantly reduces the amount of time required by researchers to collect pollen from bumble bee foragers returning to the colony. We present the design, results of pollen removal efficiency tests, and suggest areas of modifications for investigators to adapt traps to a variety of bumble bee species or nest box designs.

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

We present a non-lethal and automated mechanism to collect pollen from bumble bee (Bombus) workers returning to a hive. Instructions for producing, preparing, installing and using the devices are included. By using 3D-printed objects, modification to the design was timely, efficient and allowed for quick turnaround for testing.

Un piège à pollen imprimé en 3D pour les entrées de ruche Bumble Bee (Bombus)

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in all vertebrates by providing feedback to the brain and pituitary. Teleost fishes possess a higher degree of tissue plasticity and variation in reproductive&#160;strategies compared to mammals and appear to be useful models to investigate the role of sex steroids and the mechanisms by which they act. The removal of the main source of sex steroid production using gonadectomy together with blood sampling to measure steroid levels has been well-established and fairly feasible in bigger fish and is a powerful technique to investigate the role and effects of sex steroids. However, these techniques raise challenges when implemented in small size teleost models. Here, we describe the step-by-step procedures of gonadectomy in both males and female Japanese medaka followed by blood sampling. These protocols are shown to be highly feasible in medaka indicated by a high survival rate, safety for the life span and phenotype of the fish, and reproducibility in terms of sex steroid clearance. The use of these procedures combined with the other advantages of using this small teleost model will greatly improve the understanding of feedback mechanisms in the neuroendocrine control of reproduction and tissue plasticity provided by sex steroids in vertebrates.

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

The article describes a quick protocol to gonadectomize and sample blood from the small teleost fish, using Japanese medaka (Oryzias latipes) as a model, to investigate the role of sex steroids in animal physiology.

Gonadectomie et procédures de prélèvement sanguin dans le modèle de téléostéen de petite taille Medaka japonais (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate pesticide exposure of bees via pollen. Described herein is an effective pollen-trapping method for collecting corbicular pollen from honey bees returning to their hives. This collection method results in large quantities of corbicular pollen that can be used for research purposes. Honey bees collect pollen from many plant species, but typically visit one species during each collection trip. Therefore, each corbicular pollen pellet predominantly represents one plant species, and each pollen pellet can be described by color. This allows the sorting of samples of corbicular pollen by color to segregate plant sources. Researchers can further classify corbicular pollen by analyzing the morphology of acetolyzed pollen grains for taxonomic identification. These methods are commonly used in studies related to pollinators such as pollination efficiency, pollinator foraging dynamics, diet quality, and diversity. Detailed methodologies are presented for collecting corbicular pollen using pollen traps, sorting pollen by color, and acetolyzing pollen grains. Also presented are results pertaining to the frequency of pellet colors and taxa of corbicular pollen collected from honey bees in five different cropping systems.

We describe methods for collecting corbicular pollen from honey bees as well as protocols for color sorting, acetolysis, and microscope slide preparation of pollen for taxonomic identification. In addition, we present pellet color and taxonomic diversity of corbicular pollen collected from five cropping systems using pollen traps.

Collecte et identification du pollen des colonies d’abeilles mellifères

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...