Este protocolo es útil en muchos estudios biológicos y toxicológicos de abejas tratadas con pesticidas. Ayuda a detectar las respuestas celulares del tejido de las abejas melíferas de los acaricidas que se utilizan en las colonias de abejas para el tratamiento contra los ácaros Varroa. Es una herramienta poderosa para la detección de efectos inferiores a los pequeños en el tejido en combinación con el comportamiento de las abejas u otros insectos beneficiosos.
Para comenzar, tome con cuidado una abeja obrera con fórceps y póngala en hielo o congelador a menos 20 grados centígrados durante dos minutos para inmovilizarla. Fije la abeja en la placa de Petri diagonalmente a través de la parte posterior superior del tórax dos veces de izquierda a derecha y de derecha a izquierda. Pobre solución salina de insectos para cubrir el cuerpo.
Coloque la placa de Petri bajo el microscopio estereoscópico, enfoque y ajuste. Para diseccionar el intestino medio, comience con el abdomen insertando un punto de las tijeras debajo de la tergita A5 en el centro del lado derecho del cuerpo de la abeja. Corte a la tergita A2. Mantenga la hoja interna de las tijeras paralela al costado del cuerpo para evitar dañar los órganos internos.
Gire las tijeras hacia la izquierda y corte. Abra suavemente la parte izquierda del abdomen y fíjelo. Usando fórceps con una mano, tire suavemente del estómago de la abeja hacia arriba, y con tijeras en la otra mano, corte al final del esófago.
Tire del estómago y el intestino medio lejos del abdomen y corte en el recto. Use una pipeta con solución salina de insectos y retire cualquier heces o partes del tejido. Para la disección de las glándulas hipofaríngeas, inmovilice una abeja obrera en hielo como se describió anteriormente.
Corte la cabeza y colóquela en una placa más pequeña con la antena hacia arriba. Asegure la cabeza con dos clavos, uno a través del ojo compuesto izquierdo y el segundo a través del ojo compuesto derecho. Haga un corte a través del primer ojo compuesto en el lado interno de los alfileres, continúe hasta el labrum y luego haga otro corte en el otro lado a través del segundo ojo compuesto.
Corte las antenas. Quítese la máscara y córtela donde aún esté sujeta. Tome los fórceps y retire cuidadosamente las glándulas junto con el cerebro y parte de los ojos compuestos.
Para la tinción de hematoxilina y eosina, coloque las secciones desparafinadas y rehidratadas en hematoxilina durante cinco minutos. Luego, colóquelos con cuidado bajo agua corriente del grifo durante dos minutos. Luego, póngalos en agua destilada durante un minuto y eosina durante cuatro minutos.
Coloque los portaobjetos 96% etanol durante un minuto, luego 2-propanol durante dos minutos, y finalmente en el agente de limpieza durante dos minutos. Agregue el medio de montaje y un vidrio de cubierta y déjelos secar. Observe bajo un microscopio de luz.
Prepare frascos de Coplin. Preparar proteinasa-K. Después de desparafinar y rehidratar las secciones, coloque las diapositivas en PBS durante cinco minutos.
Coloque los portaobjetos planos en el recipiente y agregue proteinasa-K. Lave los toboganes con agua destilada. Enfriar en peroxidasa endógena a temperatura ambiente.
Enjuague los portaobjetos con PBS o agua. Coloque las guías planas en el recipiente y aplique el tampón de equilibrio durante 10 segundos a temperatura ambiente. Después de limpiar alrededor del tejido, agregue la enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal a cada sección e incube en una cámara humidificada durante una hora a 37 grados centígrados.
Antes de la incubación, coloque toallas de papel humedecidas dentro de la bandeja alrededor de los portaobjetos y cúbralas con una envoltura de plástico. Después de la incubación, coloque las muestras en la rejilla y déjelas en un tampón de parada-lavado. Después de lavar los portaobjetos en PBS y limpiar alrededor de los pañuelos desechables, agregue dos gotas de conjugado anti-digoxigenina peroxidasa tibia a las secciones e incube durante 30 minutos en un recipiente humidificado.
Después del lavado en PBS, prepare el sustrato de peroxidasa de fuerza de trabajo, cubra las secciones con sustrato de peroxidasa y tiñe durante cinco minutos. Coloque el portaobjetos bajo el microscopio y determine el tiempo óptimo de tinción. Después de lavar los portaobjetos en una rejilla para manchas y agua destilada, incubar los portaobjetos en agua destilada durante cinco minutos.
Contra-tinción usando hematoxilina durante dos minutos. Lave los toboganes colocándolos bajo agua corriente del grifo durante tres minutos y luego en agua destilada. Monte las guías debajo de los cubreobjetos de vidrio y el medio de montaje y déjelas secar planas.
Observe bajo un microscopio de luz. El porcentaje de células afectadas se calculó utilizando un microscopio óptico. Los resultados indicaron que el tratamiento con ácido oxálico afectó significativamente a las células del intestino medio.
La inmunotinción mostró productos de reacción rojos o marrones positivos en los núcleos apoptóticos de las glándulas hipofaríngeas. El producto de reacción positiva después del tratamiento con imidacloprid o cumaphis se determinó en la mayoría de las células glandulares. Al levantar la máscara de la cabeza de abeja, tenga cuidado de no dañar o arrancar las partes de las glándulas hipofaríngeas.
Esta técnica detecta cambios subclínicos en las abejas y también es adecuada para la detección de otros efectos ambientales en las abejas y algunos otros organismos vivos.
