Los autores desean agradecer al Laboratorio Kucenas valiosa para los debates y quórum Technologies, Inc. para soporte técnico excelente. El trabajo fue apoyado por el Fondo UVa para la Excelencia en Ciencia y Tecnología (FEST) (SK).

1. Preparación y montaje de embriones de pez cebra de Ablación e imágenes en vivo <ol><li> Preparar un balance de 0,8% agarosa de baja fusión en el agua del huevo. Alícuota en 13X mm cultura tubos desechables 100 y se almacena a 4 ° C hasta que se necesite. </li><li> Adultos de pez cebra Cross contiene transgenes integrados establemente para etiquetar fluorescente neuronas motoras y tipos de células gliales de interés. Recoger los embriones de pez cebra en el agua del huevo y colocar en 28.5 ° C incubadora para una correcta estadificación posterior 3. </li><li> Aproximadamente a las 24 horas después de la fecundación (HPF), eliminar el agua de huevo y añadir 0,002% 1-fenil 2-tiourea (PTU) en el agua de huevo. Embriones Volver a la incubadora. </li><li> Entre el 24 y el 96 HPF, los embriones deben ser examinados para la presencia de transgenes deseados en un microscopio de disección fluorescente. Coloque embriones seleccionados en agua PTU huevo fresco y volver a la incubadora. </li><li> Cuando las larvas han llegado a 6 días después de la fertilización (dpf) (o la edad deseada), sacarlos de la incubadora, Seleccionar unas pocas larvas para el montaje, y transferirlos a un plato más pequeño. </li><li> Eliminar el agua de la fuente y reemplace inmediatamente con aproximadamente 0,02% en agua Tricane huevo PTU. Permita que las larvas se siente en anestesia aproximadamente 5 min. </li><li> Colocar una alícuota de 0,8% agarosa de baja fusión en un vaso de precipitados con agua del grifo y microondas durante 30 segundos, o hasta que la agarosa se funde. Deje que el recipiente se enfríe hasta que la agarosa en el tubo de cultivo se siente tibia al tacto (no caliente). </li><li> Seleccione una larva anestesiados y transferirlo a un único o múltiples pocillos de 35 mm plato con fondo de cristal. Quite el agua que se ha transmitido con la larva, luego cubra inmediatamente la larva con suficiente calor agarosa para llenar la parte de vidrio de fondo del plato, pero no crear una gran cúpula. </li><li> A medida que la agarosa se endurece, utilizar una aguja de disección para posicionar la larva en su lado en la parte inferior del plato, a continuación, incline la larva sólo ligeramente en su parte posterior. Es imprescindible para la lesión y la posterior formación de imágenes, quela larva montado estar en contacto con el vidrio en la parte inferior del plato. Utilice la aguja de disección para mantener la larva en esta posición hasta que la agarosa se solidifica y la larva se inmoviliza. </li><li> Una vez que la agarosa esté completamente endurecido, lentamente pipetear agua Tricane suficiente (esto puede ser la misma Tricane utilizado para la anestesia) en el plato para cubrir completamente la agarosa y larva. </li></ol> 2. Calibración láser y pruebas <ol><li> Encienda todos los instrumentos confocal microscopio, los láseres de diodo apropiados para emocionantes transgenes pez cebra, y el nitrógeno bombeado por láser de colorante. Asegúrese de que el rayo &quot;en blanco&quot; splitter está en su lugar, el atenuador de láser está completamente abierta, y la celda de colorante 435 nm cumarina está en su lugar. En el equipo, abra el software de imágenes. </li><li> Mover un objetivo de inmersión en agua 1.2NA 63x en su posición y aplicar una pequeña gota de medio de inmersión para los objetivos de agua sobre el objetivo. Un objetivo 63x permitirá una buena precisión la ablación con láser, y el agua immersion permite para una distancia de trabajo más grande, que es necesaria cuando se trabaja con 6-7 larvas de pez cebra dpf. </li><li> Obtener un portaobjetos de vidrio con una cara de espejo para utilizar para la calibración del láser. Coloque la tapa, espejo lateral hacia abajo, sobre la platina del microscopio. </li><li> Con el ocular de bajo iluminación de campo claro, encontrar y centrarse en un rasguño o grabar en el espejo. La luz campo claro estará brillando hacia abajo sobre la lámina de vidrio, pero sólo pasará a través del objetivo en lugares donde el espejo ha sido rayados o grabado de distancia, haciendo que el espejo para mirar negro a través del ocular, y los grabados se vea como manchas o las líneas de luz. </li><li> Ver y enfocar los grabados en la pantalla del ordenador con software de imágenes. Abra la ventana que controla la calibración láser y la configuración de energía. Establecer el número de pulsos a &quot;1&quot; y la placa de la atenuación de la transmisión% &quot;3&quot;. El número de impulsos representa el número de veces que el láser se disparará dentro de cada región de interés (ROI) y el% de transmisión representa la potencia del láser. Asegúrese de que el ajuste de la calibración correcta se selecciona para el objetivo de inmersión en agua 1.2NA 63x. </li><li> Seleccione la herramienta elipse desde la barra de herramientas y haga clic en la imagen en la pantalla del ordenador para crear un ROI circular. Haga esto 3 veces más hasta que haya 4 ROI circular espaciados al azar sobre la imagen. </li><li> Algunos sistemas pueden incluir un dispositivo de seguridad que no permite que el láser para disparar cuando la trayectoria de la luz a los oculares está abierta. Si este es el caso, cerrar manualmente la trayectoria de la luz a los oculares en este momento. </li><li> Disparar el láser. Esto creará 4 aguafuertes lugar pequeño, 1 en cada ROI circular. Si el láser no se dispara, verifique que el láser esté encendido y conectado correctamente y que la trayectoria de la luz a los oculares se cierra. Si se dispara el láser de grabado, pero no se ve, verifique que el &quot;blanco&quot; divisor de haz está en su lugar. Si todo está en su lugar, aumentar la potencia del láser y &quot;frap&quot; hasta que el aguafuertes are visibles. Si es necesario grabar el vidrio de un establecimiento de más de 10 la potencia del láser, esto puede indicar que el cartucho de plasma láser necesita ser reemplazado. </li><li> Si las manchas grabadas aparecen centradas en el ROI seleccionada, no se requiere calibración (proceder a 2,12). Si las manchas no están centrados, el ajuste de calibración debe ser actualizado. </li><li> Para calibrar, haga clic en la actualización de la configuración de calibración. El láser se activará y aparecerá una imagen que contiene un único punto grabado. Si no aparece el momento, cancelar la calibración, aumentar la potencia del láser, y comenzar la calibración de nuevo. </li><li> Haga clic en el centro de la mancha. El láser se disparará de nuevo, y aparecerá otro punto. Haga clic en ese punto, y repetir este proceso hasta que la calibración se ha completado y 9 puntos aparecen en forma de cuadrícula. Repita los pasos 2.6 a 2.9 para comprobar que la calibración se ha realizado correctamente. </li><li> Retire la lámina de vidrio de la platina del microscopio y limpiar el objetivo. Abra el paso de luz a la OCUlars, y vuelva a colocar el divisor de haz &quot;en blanco&quot; con el &quot;100% ILL&quot; divisor de haz. </li></ol> 3. Transección del nervio Uso Ablación Láser y Time-lapse de imágenes confocal de Conductas de células gliales <ol><li> Retire el escenario se utiliza para mantener la lámina de vidrio y reemplazar con un escenario adecuado para la celebración de 35 mm con fondo de cristal platos. Continúe utilizando el objetivo de inmersión en agua 1.2NA 63x. </li><li> Aplique una pequeña gota de medio de inmersión en agua con el objetivo, y colocar el plato con larva montado en el escenario. Estabilizar el plato con clips. </li><li> Con el ocular de campo amplio y la iluminación, el enfoque de la larva y localizar los nervios motores. Digitalizar los nervios en hemisegments 10-20 y seleccione un nervio motor de transección. </li><li> Traiga un live-vista del nervio en la pantalla de ordenador con software de imágenes. Seleccionar Z-planos y adquirir una imagen de los axones y células gliales del nervio no lesionado. </li><li> Preparar los ajustes de imagen de lapso de tiempo en el software de imágenes para capturarZ-proyecciones de todos los tipos de células en intervalos de 5-30 min, dependiendo del experimento. Lo mejor es crear todos los ajustes necesarios para el lapso de tiempo antes de realizar la ablación, lo que no hay retraso en el inicio del lapso de tiempo una vez que la lesión es completa. </li><li> Quite el &quot;100% ILL&quot; divisor de haz y reemplazar con el &quot;blanco&quot;. Cierre el paso de luz a los oculares. </li><li> Vuelva a la visualización en directo del nervio. Utilice el canal de fluorescencia correspondiente para ver los axones que se secciona. </li><li> Usando la herramienta de elipse, crear un retorno de la inversión elíptica delgada en el área de la ablación, a continuación, crear regiones de interés más pequeña dentro de la región seleccionada. </li><li> En la ventana que controla los ajustes del láser, ajuste el número de pulsos a &quot;2&quot; y la placa de la atenuación de la transmisión% &quot;18&quot;. Encienda el láser dentro de la ROI seleccionada. Si los restos de fluorescencia en el rendimiento de la inversión, aumentar la potencia del láser, espere unos 10 segundos y disparar el láser de nuevo. Haga esto hasta que llegue a una configuración que hace que fluorescence a desaparecer dentro de la ROI. </li><li> Espere al menos 10 segundos y compruebe el área de ablación de nuevo por fluorescencia. Tenga en cuenta que un retorno de la inversión puede parecer inicialmente ablación, cuando en realidad es photobleached. Si la rentabilidad de fluorescencia, aumentar la potencia del láser y disparar el láser de nuevo. Repita este procedimiento hasta fluorescencia desaparece en el rendimiento de la inversión y no vuelve dentro de 10 seg. Lo mejor es comenzar con una potencia de láser menor y aumentar la potencia necesaria. La potencia necesaria puede variar en función de distintos sistemas de microscopía, la edad de tinte cumarina, montaje de muestras, la edad de las larvas y el grosor del tejido. Una vez que una potencia del láser ideales se ha establecido, este ajuste de potencia puede ser utilizado de nuevo en los nervios posteriores en el mismo experimento. </li><li> Una vez que la ablación se ha completado, comenzará time-lapse. </li><li> Cuando el lapso de tiempo, se debe utilizar el software de imágenes para compilar datos y crear color compuesto Z-proyecciones para cada momento. Crear una película QuickTime para analizar el comportamientode los axones y células gliales simultáneamente. </li></ol>

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos más importantes de este diseño experimental son: 1) correctamente larvas de montaje para la lesión y posterior de imágenes in vivo y 2) calibrar el láser y la selección de los ajustes de potencia correctos con el fin de crear un corte transversal del nervio limpio que resulta en un daño mínimo del tejido extra- . Para ayudar a asegurar una axotomía exitoso para imágenes in vivo y análisis posterior, monte larvas múltiples, ya sea en platos individuales con fondo de crista...

El pez cebra se han utilizado ampliamente para estudiar el desarrollo del sistema nervioso a causa de su transparencia óptica y la facilidad de transgénesis, que cuando se combina, para permitir la proyección de imagen espectacular de los comportamientos dinámicos de células en un embrión vivo. Además, dado que el pez cebra y los mamíferos comparten casi todos los genes necesarios para la formación del sistema nervioso, la información celular y molecular recogido en este organismo modelo es directamente relacionar con otras especies de vertebrados. Aunque increíblemente poderosa para los estudios de desarrollo neural, el pez cebra y sus atributos únicos tienen el potencial de también dilucidar los mecanismos que mantienen y reconstruir el sistema nervioso después de la lesión. Larvas de pez cebra mantener su translucidez en los estadios larvales finales de los años y la pigmentación puede ser efectivamente bloqueada, ya sea con el uso de inhibidores farmacológicos de la producción de melanina o mutantes genéticos que carecen de células de pigmento. Por lo tanto, el uso de este organismo modelo para el estudio de lesiones y regeneration en animales mayores es posible y ofrece la oportunidad única de investigar directamente los mecanismos celulares y moleculares que reconstruir el sistema nervioso. En este manuscrito, se describe la forma de perjudicar de manera eficiente y reproducible nervios en el SNP de larvas de pez cebra. Este paradigma de lesión se presta al estudio no sólo la degeneración, sino también las respuestas de glía periférica y células inmunes, así como las interacciones entre estas poblaciones durante la regeneración. El SNP es una red compleja de nervios motores y sensoriales que es necesario para pasar información entre el sistema nervioso central (SNC) y la piel, músculo y órganos del cuerpo, lo que permite un organismo para interactuar con su entorno y sobrevivir. A lo largo de estos nervios, glía periférica, incluyendo las células mielinizantes y no mielinizante de Schwann y células gliales perineural, así como el tejido conectivo, encierran los axones y en última instancia formar el nervio madura. Lesión de los nervios inicia un proceso known como la degeneración walleriana 10. Este mecanismo de fragmentación axonal, la contratación inmune, limpieza de escombros y la regeneración es muy estereotipada y regulada genéticamente 1. Estudios previos en los sistemas de mamíferos han descrito las funciones de las células de Schwann del nervio durante la degeneración y la regeneración 1, 2, 6, 8. En estos estudios de tejido fijado o cultivo de células, las células de Schwann no sólo macrófagos reclutados al sitio de la lesión para ayudar en la limpieza de escombros, sino también ayudaron en sí mismos la fagocitosis de mielina. Si bien estos estudios han sido muy informativo, nunca tenemos ante respuestas gliales visualizados a la lesión axonal periférica en vivo, en tiempo real, y no hay otros estudios han investigado la relación entre los diferentes tipos de glía periférica durante estos eventos. Recientemente, varios laboratorios han investigado la degeneración walleriana utilizando el pez cebra y el daño axonal láser mediada similar a lo que se describe aquí <sup&gt; 4, 5, 7, 9. En algunos de estos estudios, los axones sensoriales superficiales se axotomizado en larvas jóvenes utilizando una hecha a la medida, de dos fotones microscopio confocal 4, 5, 9. En otro estudio, que es muy similar a la nuestra, los axones más profundas dentro del nervio motor ventral fueron seccionados en larvas de 5 días de edad mediante un sistema de ablación por láser disponible comercialmente 7. En ambos montajes experimentales, la atención se centró en la degeneración walleriana y ambos axones y células inmunes fueron fotografiados. Para ampliar estos estudios, se describe hiriendo axones motores en larvas de mayor edad, con más maduros, los nervios mielinizados y análisis de la respuesta de toda la glía periférica del nervio asociado durante la degeneración y la regeneración. Para ello, nos transecto nervios motores de 6 y 7 días después de la fertilización (dpf) larvas y visualizar las respuestas de las poblaciones gliales individuales, así como investigar las interacciones entre esas poblaciones a lo largo de los axones lesionados. Usando tra dobles y tripleslíneas nsgenic que glía periférica etiqueta, incluyendo las células de Schwann y células gliales perineural, así como un marcador de los axones, que utilizan un sistema de ablación por láser disponible comercialmente que consiste en un átomo de nitrógeno bombeado por láser de colorante (longitud de onda 435 nm) conectada a un sistema confocal de disco giratorio para crear transections axón. Este montaje experimental nos permite visualizar, larvas de pez cebra en vivo, dañar la imagen de lapso de tiempo las respuestas de las poblaciones gliales distintos tractos de axones motores periféricos específicos y al daño axonal y su relación entre sí. Este protocolo puede ser adaptado, además, para crear lesiones nerviosas en el pez cebra de diferentes edades, con diferentes líneas de transgénicos o mutantes genéticos para abordar diferentes cuestiones científicas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

El sistema nervioso se describe a menudo como un componente de cableado del cuerpo a pesar de que es un sistema de órgano considerablemente líquido que reacciona a los estímulos externos en una manera estereotipada coherente, mientras que se mantiene la flexibilidad y plasticidad increíble. A diferencia del sistema nervioso central (SNC), el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación significativa, pero sólo han comenzado a comprender los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso del pez cebra como modelo de sistema, tenemos la oportunidad sin precedentes de estudios de regeneración con par de imágenes in vivo y la manipulación genética. Los nervios periféricos se componen de los axones rodeados por capas de células gliales y el tejido conectivo. Los axones se envainado por myelinating o no myelinating células de Schwann, que son a su vez envuelto en un fascículo por una vaina celular llamado el perineuro. Después de una lesión, los nervios periféricos adultos tienen la notable capacidad de remoHe dañado restos axonal y objetivos re-inervan. Para investigar las funciones de todos los glía periférica en PNS la regeneración, como se describe aquí un ensayo de transección axón que utiliza un láser de colorante bombeado por nitrógeno disponible en el mercado a axotomize nervios motores en el pez cebra transgénico vivo. Se describen además los métodos para acoplar estos experimentos para time-lapse de los nervios lesionados y control. Este paradigma experimental se puede utilizar no sólo para evaluar el papel que el juego glía en la regeneración de los nervios, pero también puede ser la plataforma para elucidar los mecanismos moleculares que gobiernan la reparación del sistema nervioso.

El ensayo descrito aquí se puede utilizar para evaluar la respuesta de las células gliales y otras poblaciones celulares del nervio asociadas a lesión axonal in vivo. Película 1 muestra un ejemplo de una lesión del nervio creado usando este método y la respuesta de las células gliales circundantes. Este experimento se realizó en Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) pez cebra, en el que la glía perineural expresar una membrana específica EGFP y el motor neuronas expresan cit...

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Aunque el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación después de una lesión significativa, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso directo, el pez cebra transgénico y un ensayo de corte transversal del nervio reproducible, podemos estudiar los comportamientos de células gliales dinámicos durante la degeneración del nervio y la regeneración.

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

motor-nerve-transection-time-lapse-imaging-glial-cell-behaviors-live

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K vistas.  University of Virginia. Aunque el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación después de una lesión significativa, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso directo, el pez cebra transgénico y un ensayo de corte transversal del nervio reproducible, podemos estudiar los comportamientos de células gliales dinámicos durante la degeneración del nervio y la regeneración.

Video: Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Los métodos para la manipulación experimental después de la transección del nervio óptico en el SNC de los mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Investigación

Neurociencias

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

Cultivo de rebanadas de Oculomotor Ex Vivo de ratones embrionarios con tecnología GFP para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento del nervio oculomotor

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Imágenes en vivo de lapso de tiempo y cuantificación de la dinámica de ramas dendríticas rápidas en el desarrollo de neuronas drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...