Este trabajo fue financiado por la Universidad de Calgary, en virtud de un nuevo investigador subvención de puesta en marcha con el Dr. Ungrin.

NOTA: placas de micropocillos están disponibles en diferentes formatos, dependiendo de los resultados deseados. Especificaciones así como directrices aproximadas para el número mínimo y máximo de las células que se deben utilizar con cada formato se muestran en la Tabla 1. Los micropocillos más pequeños se estrechan a un punto agudo, por lo que no hay límite de tamaño menor, aunque la variabilidad entre los esferoides se hace más significativa en tamaños más pequeños. La producción rutinaria de esferoides de un promedio de tan sólo 20 células cada uno es directo 8. El tamaño más grande de micropocillos no es completamente cónica, por lo tanto, los intentos de formar esferoides de pequeños números de células puede resultar en múltiples esferoides más pequeñas en cada micropocillo. Debido a ligeras diferencias en las propiedades de la superficie, con la preparación de la solución de tensioactivo (paso 1.2) no es opcional cuando se utiliza placas AggreWell 400EX. Este protocolo se basa en el uso de placas de AggreWell 400 - para otros formatos de contrasULT Tabla 1. El número de células que se cargan en cada pocillo se determina multiplicando el número de micropocillos que contiene el número de células que se agrupan para cada esferoide. Por ejemplo, para generar esferoides de 1000 células cada uno, cada pocillo se debe cargar con esferoides (1200 veces 1000 células cada uno) = 1,2 x 10 6 células. La densidad celular debe calcularse teniendo en cuenta que las células se cargan en un volumen de 0,4 ml. Así que para el ejemplo de esferoides formados a partir de 1000 células cada uno, 1,2 x 10 6 células en 0,4 ml se traduce en una densidad de 3 x 10 6 células por ml. 1. Los micropocillos se preparan para recibir las células <ol><li> Microplacas son estériles como siempre, y sólo deben ser retirados de sus envases en un ambiente estéril, tal como un gabinete de bioseguridad de flujo laminar. La esterilidad se debe mantener durante todo el protocolo. En caso de que se vea comprometida la esterilidad, los pocillos se esterilizarse utilizando etanol al 70% en agua usando ellos siguientes pasos opcionales. <ol><li> Añadir 0,5 ml de etanol al 70% a cada pocillo no utilizada. Algunos micropocillos se atrapar burbujas de aire, aunque esto se puede reducir mediante la adición de líquido a un lado, y permitiendo que se propague a través de la superficie, en lugar de dejarlo caer verticalmente sobre la superficie. Vuelva a colocar la tapa. </li><li> Mientras que el vapor de etanol debe impregnar rápidamente cualquier burbuja, si hay un gran número puede ser conveniente para eliminarlos. Centrifugar durante 2 min a 2.000 x g. Tenga en cuenta que es importante para asegurar que el rotor se equilibra correctamente a esta velocidad. </li><li> El uso de un microscopio invertido bajo aumento, verificar las burbujas se han eliminado de los micropocillos. </li><li> Incubar durante 5 minutos con la tapa en a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el etanol. Placa ahora se puede lavar con agua estéril o PBS para su uso inmediato, o se seca al aire para el almacenamiento. </li></ol></li><li> Con el fin de asegurar que las células no interactúan con la superficie de micropocillos, se puede preparar usando un agente tensioactivo. En general, esaconsejable realizar este paso inicialmente, y posteriormente comparar esferoides generados con y sin tensioactivos micropocillos recubiertos. <ol><li> Añadir 0,5 ml de solución de lavado a cada pocillo. Algunos micropocillos se atrapar burbujas de aire, aunque esto se puede reducir mediante la adición de líquido a un lado, y permitiendo que se propague a través de la superficie, en lugar de dejarlo caer verticalmente sobre la superficie. Vuelva a colocar la tapa. </li><li> Centrifugar durante 2 min a 2000 xg para eliminar las burbujas. Tenga en cuenta que es importante para asegurar que el rotor se equilibra correctamente a esta velocidad. </li><li> El uso de un microscopio invertido bajo aumento, verificar las burbujas se han eliminado de los micropocillos. </li><li> Se incuba durante al menos treinta minutos con la tapa puesta, a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C. Las placas pueden ser almacenados a cuatro grados con la solución de tensioactivo en los pocillos hasta que se necesite si está sellado adecuadamente para evitar que se sequen. </li><li> Lavar la placa con agua estéril o PBS inmediatamente antes de su uso. No permita que las placasa secarse después del revestimiento. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de células NOTA: Los detalles de la preparación celular variarán algo con el tipo específico de célula en estudio. Sin embargo, hemos observado estas condiciones para ser eficaz con una amplia gama de células, incluidas las líneas discutidas aquí, así como las células madre embrionarias humanas y murinas (ESC), células madre pluripotentes inducidas humanas (IPSC), fibroblastos, endodermo primitivo putativo, y células del estroma. Otros grupos han utilizado este sistema con éxito para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la condrogénesis de células madre mesenquimales 9, generación normalizada de los precursores neuronales a partir de células madre pluripotentes 10, análisis toxicológicos en hepatocitos 11 y la evaluación de la regeneración de la médula espinal en salamandras 12. El protocolo específico para trabajar con células HT29 se muestra aquí. <ol><li> Comience con un frasco T75 de células HT29, se cultivaron en DMEM+ 10% de FBS </li><li> Aspirar medio de crecimiento del frasco, y añadir 3 ml de tripsina. </li><li> Se incuban las células durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Detener la digestión de tripsina mediante la adición de 3 ml de medio de crecimiento. Tomar una alícuota para el recuento de células y transferir el resto en un tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 200 x g. </li><li> Mientras que la centrifugación está en curso, contar las células. </li><li> Tripsina Aspirar / mezcla de medio y reemplazar con medio de crecimiento fresco, volumen determinado por la densidad celular obligatorio calculado anteriormente. </li><li> (OPCIONAL) Pase la suspensión de células a través de un colador para eliminar los grumos. NOTA: las condiciones de cosecha celular varían un poco entre líneas. Si un protocolo de disociación para, por ejemplo pasar las células de interés está disponible, que se debe utilizar como punto de partida. Con las líneas celulares sensibles uso de tripsina puede resultar en la muerte celular excesiva. En estos casos hemos observado buenos resultados usando TrypLE como dissociati alternativaen reactivo 8. Si las células se vuelven agrupada durante la disociación y pierden viabilidad, la adición de DNasa a la solución de enzima puede resolver este. Reducir los tiempos de disociación y el empleo de un paso de trituración para romper los agregados celulares también puede aumentar la viabilidad. </li></ol> 3. Formación esferoide NOTA: Los esferoides pueden generarse en una variedad de formulaciones de medio, sin embargo los ensayos iniciales deben llevarse a cabo usando el medio en el que las células se cultivaron, para distinguir consecuencias de la transición a un sistema de cultivo de 3 dimensiones de las consecuencias de los cambios en la composición del medio. <ol><li> Añadir 0,4 ml de medio de crecimiento a cada pocillo. </li><li> Centrifugar durante 2 min a 2000 xg para eliminar las burbujas. Tenga en cuenta que es importante para asegurar que el rotor se equilibra correctamente a esta velocidad antes de la centrifugación. </li><li> El uso de un microscopio invertido bajo aumento, verificar las burbujas se han eliminado de los micropocillos. </li><li> Añadir 0,4 mlsuspensión de células a la densidad requerida (calculada anteriormente). Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo, sin la introducción de burbujas de aire en los micropocillos. Es importante asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente por todo el pozo, con el fin de obtener esferoides consistentes. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 200 x g. Si la placa no se hace a nivel de auto durante la centrifugación, las corrientes de convección Puede ocurrir que en la distribución desigual de las células a través de las cúpulas. Por lo tanto, la placa debe ser equilibrado internamente, así como en contra de la otra placa, de manera que el peso se distribuye uniformemente a ambos lados de la placa de soporte. </li></ol> NOTA: Si no se observa evidencia de la distribución desigual de células, puede ser necesaria la aplicación de una pequeña cantidad de la lubricación de los puntos de giro en el soporte de la placa - consultar con el fabricante de la centrífuga para obtener instrucciones. NOTA: Una vez que las células han sido centrifugada en los micropocillos, que son razonablemente resistenciatante del lavado a fondo de los movimientos menores de la placa. Movimientos bruscos que resultan en chapoteo del medio deben ser evitados, pero la transferencia de la placa de centrífuga al microscopio o una incubadora no deberían resultar en el desplazamiento celular significativa. <ol start="6"><li> Usando un microscopio invertido, compruebe que las células se han agrupado dentro de los pocillos, y que se distribuyen de forma homogénea en el pozo. </li><li> Incubar toda la noche a 37 ° C. </li><li> Usando un microscopio invertido, observar el proceso de la formación de esferoides. Algunas líneas de células se forman esferoides compactos dentro de las 24 horas, otros pueden tardar más tiempo. La progresión de clúster a agregarse en las células HT29 se muestra en la Figura 2. </li><li> Recuperar esferoides de los micropocillos y traslado al cultivo en suspensión por chorro suavemente con una pipeta. Alternativamente, mantener esferoides in situ con reemplazo de medio 8 - la duración depende de su tamaño inicial y la tasa de crecimiento, que defINE el tiempo hasta que se superan los micropocillos en el que se formaron. <ol><li> Para reemplazar medio sin perder esferoides, medio aspirado en el borde del pozo utilizando una pipeta Pasteur. Lentamente la punta hacia abajo hasta que comience a dibujar líquido del menisco, y siga el menisco hacia abajo a medida que cae. A continuación, añadir medio fresco contra la pared del pozo en el mismo lugar. Unos pocos esferoides pueden perderse, sin embargo si el medio siempre se aspiró y se reemplazó en la misma posición, este número seguirá siendo pequeña en comparación con los grandes números en el pozo. </li></ol></li></ol>

<ol>
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D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. 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J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

Dr. Ungrin tiene un interés financiero en la tecnología AggreWell como inventor.

Hemos establecido un sistema por el cual un gran número de esferoides uniformes pueden ser generados a partir de múltiples líneas celulares de diferentes fuentes. Aún tenemos que encontrar una línea de células adherentes que no forma esferoides en estas condiciones. Hemos observado anteriormente la pérdida de células en las poblaciones propensas a anoikis 5,8, sin embargo hasta la fecha esta cuestión no se ha planteado con líneas tumorales. El sistema es escalable de forma arbitraria con área de superficie, con un comportamiento consistente a través de micropocillos en 24 pocillos y formato de 6 pocillos, así como biorreactores prototipo que contienen 50.000 micropocillos cada uno actualmente en fase de desarrollo. En caso de esferoide asimetría ser una preocupación, el tiempo de incubación en el paso 4.8 se puede aumentar a dos o tres días. Los esferoides también se pueden incubar durante un período después de la extracción de los micropocillos para aumentar la simetría, sin embargo en este caso debe tenerse cuidado de mantener densidades de cultivo suficientemente baja, como esferoides en contacto uno con el otro wiLL menudo fusionar en estructuras más grandes. Por esta razón, hemos mantenido previamente culturas dentro de los micropocillos en la que se formaron los agregados, con la limitación principal es el tamaño del esferoide. Esto a su vez es una función tanto de la tasa de crecimiento y el tamaño inicial de 8, y si se ha previsto la cultura extendido dentro de la placa de micropocillos, esto se debe considerar de antemano. Opciones para prevenir el crecimiento excesivo, si se producen, son ya sea a partir de esferoides pequeños, o el empleo de las cúpulas más grandes de la placa AggreWell 800. En caso de esferoides dejar de aumentar de manera coherente con el tiempo, una causa potencial puede ser la muerte celular. Particularmente en agregados más grandes de las células metabólicamente muy activos, limitaciones de transporte de masa en la entrega de oxígeno y nutrientes esenciales puede resultar en un núcleo necrótico 2 - por lo tanto un esferoide no cohesivo puede ser simplemente una consecuencia de la muerte celular excesiva. Alternativamente, las mediciones de la cohesión mecánicasión de esferoides se han utilizado para evaluar las fuerzas de unión intercelulares, en relación con el potencial metastásico de una línea celular dada 13. Sería interesante investigar la relación entre la forma esferoide y el potencial metastásico, tal vez utilizando parámetros morfométricos tales como redondez y el perímetro de relación de área. Además de investigar las propiedades mecánicas y morfométricos de esferoides, el montaje en el sistema de micropocillos permite la producción a gran escala de esferoides mixta de composición, que consiste en combinaciones de múltiples tipos de células y / o biomateriales 6,7. Las interacciones de las células tumorales con otros tipos de células son importantes para modelar más de cerca el comportamiento de los tumores in vivo 14, por lo que puede ser de interés para generar esferoides de células tumorales en combinación con los fibroblastos y las células endoteliales, por ejemplo. Las micropartículas de diversos biomateriales también se pueden incorporar, y pueden afectar SPHpropiedades eroid tanto directamente a través de sus interacciones con las células 7,15, y también como depósitos para la liberación controlada de factores de crecimiento y citoquinas en el interior del esferoide 16. Si hay alguna duda sobre la esterilidad, por ejemplo, cuando se trabaja con una placa de micro en el que previamente se han utilizado algunos pozos, que pueden haber pasado algún tiempo en una incubadora como parte de un experimento anterior, los pozos pueden esterilizarse con etanol al 70% en el agua. Una vez esferoides se han formado, que también pueden ser separadas de las células no incorporadas residuales haciendo pasar la suspensión a través de un filtro de células. Las células individuales pasarán a través, mientras que se mantendrán los esferoides. Si el esferoide es sospechoso de derramamiento de células potencialmente metastásicos en el transcurso de la cultura, puede ser deseable llevar a cabo este procedimiento varias veces - inicialmente para eliminar las células no incorporadas, y posteriormente para aislar purified poblaciones de las células desprendidas de los esferoides.

Hay un creciente cuerpo de evidencia de que las células tumorales se comportan de manera diferente en las tres culturas dimensiones que lo hacen cuando cultivadas en plástico, y que los agentes terapéuticos presentes en las plataformas de cultivo de tejidos convencionales pueden perder eficacia cuando la transición a un sistema más fisiológicamente relevantes 1. Es por lo tanto deseable para estudiar el comportamiento de las células cancerosas en estas condiciones, tanto para obtener información sobre su biología subyacente, y también para aumentar la tasa de éxito de la transición de nuevos agentes terapéuticos de la planta de filtrado a la clínica. Un sistema de modelo útil con una larga historia emplea agrupaciones tridimensionales de las células cancerosas conocidas como esferoides tumorales 1,2. Idealmente, las técnicas para la formación de esferoides permitirían la producción de un gran número de esferoides homogéneos, cuyo tamaño y composición son controlados por el experimentador. Aunque la gota pendiente y bien-placa enfoques 3,4 son capaces de cumplir con algunos de estos rerequisitos, el rendimiento es generalmente limitada, y la generación de un gran número de esferoides se convierte en una tarea de trabajo intensivo. Recientemente hemos desarrollado un sistema para resolver problemas similares en el campo de la medicina regenerativa 5. El empleo de la agregación forzada dentro de una serie de pozos a escala micrométrica densamente empaquetadas (véase la figura 1), este enfoque permite la generación de esferoides de números arbitrarios de células, incluidas las mezclas de múltiples tipos de células 6, así como la incorporación de diversos biomateriales 7. Los esferoides se forman en grandes números - miles a cientos de miles o más - y pueden ser extraídos inmediatamente o mantenerse en los micropocillos en el que se formaron con intercambio de medio de al menos un 8 a dos (observación no publicada) semanas. Este sistema está por lo tanto muy adecuado para la generación de un gran número de uniforme y esferoides tumorales reproducibles para la evaluación de la efectiveness de nuevos agentes antitumorales o investigaciones biológicas básicas.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

Esferoides tumorales se reconoce cada vez más como un importante modelo in vitro para el comportamiento de las células tumorales en tres dimensiones. Más fisiológicamente relevante de cultivos adherentes hojas convencionales, que recapitulan más exactamente la complejidad y las interacciones presentes en tumores reales. Con el fin de aprovechar este modelo para evaluar mejor la biología del tumor, o la eficacia de nuevos agentes terapéuticos, es necesario ser capaz de generar esferoides de forma reproducible, de una manera controlada y en cantidades significativas. El sistema AggreWell consta de una matriz de alta densidad de micropocillos en forma de pirámide, en el que se centrifuga una suspensión de células individuales. Los números de células agrupación en la parte inferior de cada micropocillo, y el número y la proporción de distintos tipos de células involucradas depende sólo de las propiedades de la suspensión introducida por el experimentador. Por lo tanto, somos capaces de generar esferoides tumorales de tamaño y composición arbitraria ena necesidad de modificar la tecnología de la plataforma subyacente. Los cientos de micropocillos por centímetro cuadrado de superficie de cultivo a su vez, aseguran que los niveles de producción extremadamente altas pueden alcanzarse a través de un proceso sencillo,-no laboral intensiva. Por tanto, esperamos que este protocolo será ampliamente útil para los investigadores en el campo esferoide tumor.

Esferoides de múltiples líneas tumorales de orígenes anatómicos diferentes pueden ser generados fácilmente y se extrajeron en cultivo en suspensión. Figura 3 ilustra el control de tamaño consistente obtener a través de este método, con poblaciones esferoide muy uniforme en cada condición. Borrar las diferencias entre la línea de comportamiento también son visibles, con células de cáncer de colon HT29 y células de cáncer de esófago TE6 forman esferoides densamente empaquetadas con límites bien definidos, mientras que las células de cáncer de próstata LNCaP dieron lugar a esferoides menos coherentes con límites irregulares (véase la discusión de las posibles razones ). Las fuerzas internas más fuertes en los agregados más coherentes también dio lugar a colapso a una forma más simétrica incluso mientras que aún en los micropocillos en el que se formaron, mientras que los agregados LNCaP, en particular en el tamaño más grande, conservan visiblemente la geometría piramidal cuadrada de la micropocillos. La relación entre el número de células de entrada y las fís<html> iCal tamaño del esferoide resultante dependerá de un número de variables. Volúmenes teóricos basados ​​en el producto del volumen por célula y el número de células empleadas pueden ser reducidos por la pérdida de células, que a su vez pueden incluir la pérdida de células durante la fase de suspensión de una sola célula, así como la pérdida de excesivamente pequeños agregados debido a insuficiente número de vecinos y de excesivamente grandes agregados ocasionadas por el transporte limitaciones y necrosis en el núcleo. El tamaño también se verá influenciada por cualquier proliferación que pueden ocurrir durante el proceso de agregación. Como estos parámetros variarán de línea celular a línea celular, si se desean esferoides de dimensiones físicas específicas el número correcto de células para introducir debe determinarse experimentalmente. Como una primera aproximación, se espera que el diámetro del esferoide a aumentar con la raíz cúbica del número de células incorporadas - por ejemplo, un aumento de 8 veces en el número de células debería dar como resultado una duplicación del diámetro esferoidal. <html> _content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de la producción de esferoide. El sistema de micropocillos se compone de una serie de micropocillos-piramidal cuadrados estrechamente empaquetados (625 por cm 2 para la <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m de tamaño de 400), en el cual las células pueden ser centrifugadas. Las células se unen por las paredes laterales inclinadas, y el tamaño del esferoide resultante se controla mediante la variación de la densidad de la suspensión celular empleada. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Asamblea de células agrupadas en esferoides. Esferoides se forma a partir de setecientos HT29 células cada uno. Inmediatamente después de la centrifugación (A), las células se agrupan libremente en la parte inferior de cada micropocillo. Tenga en cuenta que los grupos se compensan de manera uniforme hacia la parte inferior derecha en este caso. Esto es aceptable siempre y tamaños de clúster permanecen consistentes a través de la matriz. Si las diferencias de tamaño importante grupo son vistos desde un lado de la matriz a la otra, ver nota en el paso 3.5. Después de la incubación durante 24 h (B), las fuerzas de adhesión intercelulares han causado las agrupaciones a agregarse y formar esferoides coherentes, que puede entonces ser extraído (C). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Figura 3. Spheroids generados en placas de micropocillos. Esferoides se formaron a partir de setecientos (A, C, E) o mil quinientos (B, F, D) las células de cáncer de colon HT29 (A, B), las células de cáncer de próstata LNCaP (C, D) o las células del cáncer de esófago TE6 (E, F). Tenga en cuenta la consistencia de esferoides dentro de una preparación, y también la variación entre las líneas celulares - en particular, los agregados sueltos LNCaP como en comparación con el HT29 lleno más densamente y células TE6. La barra de escala representa 200 micras. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Formato de micropocillos </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Ancho de micropocillos (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Micropocillos por cm 2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> Micropocillos por pocillo </td><td> 1200 </td><td> 4700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Células mínimos por micropocillos * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Células máximos por micropocillos * </td><td> 2000 </td><td> 2000 </td><td> 10000 </td></tr><tr><td> Células por pocillo mínimos * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Máximo células por pocillo * </td><td> 2.4 x 10 6 </td><td> 9.4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - volumen de etanol al 70% (ml) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - El enjuague volumen de solución (ml) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - El volumen de precarga media (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3.5 - El volumen de carga de la célula (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * Los números de células por micropocillo son sólo una aproximación ya que este valor puede variar con el tamaño de las células específicas empleadas, y debe ser determinada empíricamente </td></tr></tbody></table> Tabla 1. AggreWell opciones y modificaciones del protocolo.

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Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Se introduce un protocolo para la generación de números grandes (miles a cientos de miles) de talla y esferoides tumorales composición controlado uniforme, utilizando placas de micropocillos disponibles en el mercado.

La producción de grandes cantidades de esferoides tumorales Tamaño controlados utilizando placas de micropocillos

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

production-large-numbers-size-controlled-tumor-spheroids-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.3K vistas.  University of Calgary.  Se introduce un protocolo para la generación de números grandes (miles a cientos de miles) de talla y esferoides tumorales composición controlado uniforme, utilizando placas de micropocillos disponibles en el mercado. 

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Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Investigación

Bioingeniería

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nutriente Reglamento mediante la alimentación continua de expansión a gran escala de células de mamífero en esferoides

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Producción Robótica de Cancer Cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Creación de tejido cardiaco que exhibe la integración mecánica de esferoides usando bioprinting 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Montaje y Seguimiento de Desarrollo Comunitario Microbiano dentro de una Plataforma de Matriz de Micropedulos

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was pretreated with NaOH and washed to a neutral pH. Cellulase was added to the pretreated bamboo powder to generate the hydrolysate, which contained 30 g/L glucose and 15 g/L xylose and was used as the carbon source to prepare a medium for chemical production. When cultured in microaerobic conditions, 12.7 g/L 2,3-butanediol was produced by wildtype K. pneumoniae. In aerobic conditions, 13.0 g/L R-acetoin was produced by the budC mutant of K. pneumoniae. A mixture of 25.5 g/L 2-ketogluconic acid and 13.6 g/L xylonic acid was produced by the budA mutant of K. pneumoniae in a two-stage, pH-controlled fermentation with high air supplementation. In the first stage of fermentation, the culture was maintained at a neutral pH; after cell growth, the fermentation proceeded to the second stage, during which the culture was allowed to become acidic.

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo powder was pretreated with NaOH and enzymatically hydrolyzed. The hydrolysate of bamboo was used as the feedstock for 2,3-butanediol, R-acetoin, 2-ketogluconic acid, and xylonic acid production by Klebsiella pneumoniae.

Producción de productos químicos por<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Usando hidrolizado de bambú como materia prima

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Protocolo genérico para la optimización de la producción de proteína heteróloga utilizando tecnología Microbioreactor automatizada

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Producción automatizada a gran escala de esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo para bioimpresión 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, chitosan microgels are commonly fabricated using emulsion methods that require organic solvent rinses, which are toxic and harmful to the environment. The present protocol presents a rapid, non-cytotoxic, non-emulsion-based method for fabricating chitosan-genipin microgels without the need for organic solvent rinses. The microgels described herein can be fabricated with precise size control. They exhibit sustained release of biomolecules, making them highly relevant for tissue engineering, biomaterials, and regenerative medicine. Chitosan is crosslinked with genipin to form a hydrogel network, then passed through a syringe filter to produce the microgels. The microgels can be filtered to create a range of sizes, and they show pH-dependent swelling and degrade over time enzymatically. These microgels have been employed in a rat growth plate injury model and were demonstrated to promote increased cartilage tissue repair and to show complete degradation at 28 days in vivo. Due to their low cost, high convenience, and ease of fabrication with cytocompatible materials, these chitosan microgels present an exciting and unique technology in tissue engineering.

The present protocol describes a non-emulsion-based method for the fabrication of chitosan-genipin microgels. The size of these microgels can be precisely controlled, and they can display pH-dependent swelling, degrade in vivo,&#160;and be loaded with therapeutic molecules that release over time in a sustained manner, making them highly relevant for tissue engineering applications.

Fabricación de microgeles de quitosano-genipina de tamaño controlado y sin emulsión para aplicaciones de ingeniería de tejidos

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...