Esta investigación fue financiada por NIH 1R01HL140239-01 a AMC. Nos gustaría dar las gracias al Centro de Imágenes Celulares de la Universidad drexel.

1. Crecimiento de células epiteliales mamarias y medios de ensayo
<ol><li>Células epiteliales mamarias MCF10A NOTA: La línea celular epitelial mamaria inmortalizada no tumorigénica se deriva de una paciente con enfermedad fibroquística43. Las células no expresan el receptor de estrógeno.<ol>
<li>Para preparar 20 μg/mL factor de crecimiento epidérmico (EGF), disolver 100 μg de EGF liofilizado en 500 μL de dH estéril2O para hacer 200 μg/mL EGF. Añadir 500 μL de 200 μg/mL de EGF en 4,5 ml de BSA estéril del 0,1% en dH2O para hacer una solución de stock de EGF de 20 μg/mL. Almacene los alíquesas de EGF preparados de 20 μg/ml a -20 °C durante un tiempo de hasta 12 meses.</li>
		<li>Para preparar hidrocortisona de 500 μg/ml, diluya 1 mg de hidrocortisona en 1 ml de etanol absoluto (200 a prueba). Añadir 1 ml de DMEM F:12 estéril a esta mezcla para hacer una solución de 500 μg/mL de material hidrocortisona. Almacene los alíquesas de acciones de hidrocortisona a -80 °C durante un tiempo de hasta 12 meses.</li>
		<li>Para preparar 10 μg/ml de toxina del cólera, disolver 1 mg de polvo liofilizado de toxina del cólera en 1 ml de dHestéril 2O para hacer una solución de 1 mg/ml de caldo de toxina de cólera. Almacene las alícuotas de material de toxinas de cólera a -80 °C durante un plazo de hasta 12 meses.</li>
		<li>Para preparar el medio de crecimiento, añadir 500 μL de FEAG (20 μg/ml), 500 μL de hidrocortisona (500 μg/ml), 5 μL de toxina del cólera (1 mg/ml), 500 μL de insulina bovina (10 mg/ml), 10 ml de penicilina y estreptomicina, y 25 ml de suero de caballo a 500 ml de DMEM F:12 para una concentración final de 20 ng/mL de EGF, hidrocortisona de 500 ng/ml, toxina de cólera de 10 ng/ml, insulina bovina de 10 ng/ml, penicilina v/v 2% y estreptomicina, y 5% v/v de suero de caballo. La concentración de antibióticos se incrementó al 2% para tener en cuenta la disminución de la esterilidad en el proceso de bioimpresión; sin embargo, la concentración de antibióticos se puede reducir al 1%.</li>
		<li>Para preparar el medio de ensayo, añadir 500 μL de hidrocortisona (500 μg/ml), 5 μL de toxina del cólera (1 mg/ml), 500 μL de insulina bovina (10 mg/ml), 10 ml de penicilina y estreptomicina, y 25 ml de suero de caballo a 500 ml de DMEM F:12 para una concentración final de hidrocortisona de 500 ng/ml, toxina de cólera de 10 ng/ml, 10 ng/ml de insulina bovina, 2% de penicilina v/v y estreptomicina, y 5% de suero de caballo v/v.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 NOTA: La línea de células epiteliales de cáncer de mama triple negativo (que carece de receptor de estrógeno, receptor de progesterona y receptor de factor de crecimiento epidérmico 2) se crea a partir del derrame pleural de una paciente femenina con adenocarcinoma mamario metastásico44. Las células representan un cáncer de mama agresivo, invasivo y mal diferenciado.<ol>
<li>Para preparar el medio de crecimiento y ensayo, añadir 50 ml de suero bovino fetal, 10 ml de penicilina y estreptomicina, y 25 ml de suero de caballo a 500 ml de DMEM para una concentración final 10% v/ v suero bovino fetal, 2% v / v penicilina y estreptomicina, y 5% v / v suero de caballo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultivo de células epiteliales mamarias
<ol><li>Semillas 500.000 células MCF10A o MDA-MB-231 en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm (P100) con 10 ml de MCF10A o MDA-MB-231. Las células MCF10A y MDA-MB-231 alcanzan >90% de confluencia en 48 horas.</li>
	<li>Para pasar las células epiteliales mamarias, primero lave las células con 10 ml de PBS caliente.</li>
	<li>Desasociar las células epiteliales mamarias añadiendo 2 ml de 0.05% trypsina-EDTA al plato. Coloque el plato en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 durante 20-25 minutos.</li>
	<li>Agregue 5 ml de MCF10A o MDA-MB-231 Growth Medium a las células trippsinizadas para neutralizar la trippsina. Pipetear la mezcla de medios celulares hacia arriba y hacia abajo para resuspend células y romper cúmulos celulares.</li>
	<li>Añada la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y a una centrífuga a 1.200 x g durante 3 minutos. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspend el pellet de celda en 5 ml de MCF10A o MDA-MB-231 Medio de crecimiento.</li>
	<li>Placa 1 mL de suspensión celular en 5 nuevos platos de cultivo de tejido de 10 cm junto con MCF10A o MDA-MB-231 Medio de crecimiento. Coloque los platos en una incubadora de 37 °C, 5% CO2. Las células estarán listas para ser aprobadas de nuevo en 2-3 días. Las células MCF10A se pueden mantener hasta el paso número 35, después de lo cual muestran cambios morfológicos. Las células MDA-MB-231 se pueden mantener hasta el paso número 24, después de lo cual muestran cambios morfológicos.</li>
</ol>3. Formación de esferoides epiteliales mamales
<ol><li>Congele 200 puntas de pipeta de μL durante 30 minutos antes de iniciar el ensayo. Mantenga la solución de matriz reducida del factor de crecimiento (por ejemplo, Matrigel) (10 mg/ml) en hielo durante todo el proceso.</li>
	<li>Pipeta lentamente 30 μL de solución de matriz helada utilizando puntas de pipeta heladas de 200 μL en cada pozo de un tobogán de cámara de 8 pozos. Comience por los lados y arrastre la punta de la pipeta a lo largo de las esquinas, añadiendo una gota final al centro del pozo para asegurar el recubrimiento uniforme de cada pozo. Evite burbujas de aire durante este paso para garantizar una capa de solución de matriz uniforme. Utilice nuevas puntas de pipeta para cada pozo.</li>
	<li>Incubar diapositivas de cámara en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 durante 15-20 minutos para polimerizar la solución de matriz.</li>
	<li>Células MCF10A resuspend trypsinizadas en mcf10A assay Medium en 200,000 células/mL o células resuspend trypsinized MDA-MB-231 en MDA-MB-231 Medio de crecimiento a 200,000 células/ml.</li>
	<li>Si utiliza células MCF10A, prepare el medio de crecimiento esferoide MCF10A fresco añadiendo 5 μL de EGF (20 μg/ml) y 100 μL de solución matricial a 5 ml de Assay Medium para una concentración final de solución de matriz del 2%.</li>
	<li>Retire la diapositiva de cámara precodada con solución de matriz de la incubadora. Agregue 50 μL de suspensión celular MCF10A o MDA-MB-231 (10.000 células) a cada pozo. Si utiliza células MCF10A, agregue 450 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium. Si utiliza células MDA-MB-231, agregue 450 μL de MDA-MB-231 Growth Medium premezclado con solución de matriz del 2% (9 μL). Coloque inmediatamente la diapositiva de la cámara en una incubadora de 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Reemplace el medio cada 4 cuatro días. Pipeta cuidadosamente 200 μL de medios antiguos de una esquina de cada pozo utilizando una punta de pipeta de 200 μL. Durante este proceso, incline la diapositiva de la cámara a 45° para asegurarse de que los esferoides no se alteran. Añadir 200 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium recién preparado o MDA-MB-231 Growth Medium mezclado previamente con una solución de matriz del 2% a cada pozo en la esquina en gotas para asegurarse de que los esferoides permanezcan unidos a la capa de matriz. Sólo ~ 50% de los medios se reemplazan de modo que todas las citoquinas producidas por los esferoides no están completamente agotados. NOTA: Los esferoides epiteliales de mama MCF10A tardan hasta 8 días en polarizar y formar centros huecos. Los esferoides epiteliales mamario MDA-MB-231 tardan hasta 5 días en formarse y no tienen centros huecos.</li>
</ol>4. Formación de redes celulares endoteliales
<ol><li>Cultivo de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC)<ol>
<li>Añadir el contenido de un único kit de crecimiento endotelial medio-2 que contiene factor de crecimiento de insulina, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento endotelial vascular, ácido ascórbico, factor de crecimiento epidérmico, heparina y gentamicina-anfotericina B, junto con 50 ml de suero bovino fetal, 5 ml de penicilina-estreptomicina y 5 ml de glutamina de 200 mM a 500 ml de basal basal endotelial medio-2 (EBM-2) para crear un medio de crecimiento endotelial completo (EGM-2).</li>
		<li>Semillas 500.000 células endoteliales en un plato de cultivo tisular de 10 cm en 10 ml de EGM-2. Coloque las células en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 hasta que alcancen >80% de confluencia (alrededor de 48 horas).</li>
		<li>A las células de paso, lave las células endoteliales con 10 ml de PBS caliente. Desenganche HUVEC añadiendo 2 ml de 0.05% Trypsin-EDTA al plato de cultivo de tejido de 10 cm. Monitoree de cerca las células por microscopía de contraste de fase. Las células están listas cuando son en bolas, pero permanecen unidas al plato.</li>
		<li>Aspirar cuidadosamente la trypsin fuera del plato. Añadir 8 ml de EGM-2 al plato. Lave las células del plato pipeteando el EGM-2 hacia arriba y hacia abajo sobre toda la superficie del plato.</li>
		<li>Alternativamente, agregue 5 ml de EGM-2 a las células trippsinizadas para neutralizar la trypsina. Pipetear la mezcla de medios celulares hacia arriba y hacia abajo para resuspend células y romper cúmulos celulares. Añada la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y a una centrífuga a 1.200 x g durante 3 minutos. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspend el pellet celular en 10 mL de EGM-2.</li>
		<li>Añadir 1 ml de suspensión celular a 9 ml de EGM-2 en un plato de cultivo de tejido de 10 cm. Coloque los platos en una incubadora de 37 °C, 5% CO2. Intercambio 2/3 del medio con EGM-2 fresco cada 2 días. Las células estarán listas para pasar en 3-5 días. HUVEC se puede mantener hasta el paso 8 después del cual no pueden formar redes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formación de redes de células endoteliales (HUVEC)</li>
	<li>Congele 200 puntas de pipeta de μL durante 30 minutos antes de iniciar el ensayo. Mantenga la solución de matriz reducida del factor de crecimiento (10 mg/ml) en hielo durante todo el proceso.</li>
	<li>Pipeta lentamente 30 μL de solución de matriz helada utilizando puntas de pipeta heladas de 200 μL en cada pozo de un tobogán de cámara de 8 pozos. Comience por los lados y arrastre la punta de la pipeta a lo largo de las esquinas, añadiendo una gota final al centro del pozo para asegurar el recubrimiento uniforme de cada pozo. Evite burbujas de aire durante este paso para garantizar una capa de solución de matriz uniforme. Utilice nuevas puntas de pipeta para cada pozo.</li>
	<li>Incubar portaobjetos de cámara en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 durante 15-20 minutos para polimerizar Matrigel.<ol>
<li>Pre-manchar un plato de 10 cm de HUVEC con 10 μL de rastreador de células rojas (1:1000) durante 30 minutos en 37 °C, 5% co2 incubadora.</li>
		<li>Lave las células endoteliales con 10 ml de PBS caliente. Desenganche HUVEC añadiendo 2 ml de 0.05% Trypsin-EDTA al plato de cultivo de tejido de 10 cm. Coloque el plato en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 durante 5 minutos para separar completamente las células.</li>
		<li>Añadir 5 ml de EGM-2 al plato para neutralizar la trypsina. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 25 ml. Centrífuga HUVEC a 1.200 x g durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspend el pellet celular en 5 ml de EBM-2 sin suero.</li>
		<li>Cuente celdas usando Trypan blue para determinar celdas viables. Cree una solución de 1 x10 6 celdas/ml.</li>
		<li>Añadir 100.000 HUVEC a cada pozo con 200 μL de EBM-2 libre de suero. Si se agregan más celdas, crearán una monocapa de superficie en lugar de una red de tubos.</li>
		<li>Incubar HUVEC en una incubadora de 37 °C, 5% CO2. Después de 6 horas, imagen HUVEC redes por microscopía de contraste fase. Las redes ya están listas para la cocultura con esferoides de pecho.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Bioimpresión de esferoides epiteliales mamario en redes HUVEC preformadas
NOTA: Se debe utilizar un sistema de biodeposición de boquilla dual para el proceso de biofabricación. En este caso, el sistema tenía tres brazos de movimiento para permitir el control espacial a escala de micron de la deposición de material, así como dos motores accionados por tornillo para depositar bioink de jeringas de 10 ml. El sistema debe funcionalizarse con un sistema de filtración de aire particulado de alta eficiencia, así como capacidades de esterilización UV para mantener un entorno estéril durante la bioimpresión. El bioimpresora está esterilizado uv durante una hora antes del proceso de impresión.
<ol><li>Cree esferoides epiteliales mamarios y redes HUVEC como se describió anteriormente. Calcule el número de esferoides epiteliales mamales en cada pozo contando esferoides en imágenes de microscopía de contraste de fase representativa.</li>
	<li>Corte 0,5 cm del extremo de una punta de pipeta de 1000 μL. Utilice la punta de la pipeta cortada para canalizar cuidadosamente todos los esferoides de la tobogán de cámara de 8 pozos y en un tubo de 50 ml. Esferoides resuspend en el bioink seleccionado a 100 esferoides/100 μL. NOTA: Concentraciones de esferoides más altas pueden resultar en agrupación esferoide y evitar la visualización de interacciones entre los esferoides y las redes endoteliales.</li>
	<li>Pase la mezcla de esferoides a través de un colador de células de 70 μm para eliminar cualquier esferoide grande o agrupado.</li>
	<li>Cargue los esferoides agrupados en una jeringa estéril de 10 ml y colóquela con una aguja estéril del calibre 25. Conecte la jeringa al sistema de biodeposición.</li>
	<li>Aspirar el medio de las redes HUVEC en el tobogán de cámara de 8 pozos.</li>
	<li>Extruya 100 μL de esferoides epiteliales mamales en 6 pozos de redes HUVEC a un caudal de 1 mL/min. Mantenga 2 pozos de redes HUVEC como controles.</li>
	<li>Añadir 400 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium si utiliza esferoides MCF10A impresos en redes HUVEC o añadir 400 μL MDA-MB-231 Medio de crecimiento mezclado previamente con solución matriz del 2% si utiliza esferoides MDA-MB-231 impresos en redes HUVEC. El medio de crecimiento de esferoides respectivo debe utilizarse en pozos de control HUVEC.</li>
	<li>Incubar co-cultivos en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 durante 24 – 96 horas sin un cambio de medios. Las coculturas seguirán siendo viables en el medio original hasta por cuatro días.</li>
</ol>6. Microscopía confocal
<ol><li>Inmunofluorescencia y preparación del tampón de lavado PBS-Glycine<ol>
<li>Preparar inmunofluorescencia (IF) buffer 10x solución de stock mediante la adición de 2,5 g de azide sódico, 5 g de albúmina sérica bovina, 10 ml de Tritón X-100, y 2,05 ml de Tween-20 en 500 ml de 10x PBS. Ajuste el pH a 7,4. Almacene la solución de stock durante un año a 4 °C para evitar la sedimentación.</li>
		<li>Cree un búfer IF en funcionamiento diluyendo 50 ml de 10x Tampón IF en 450 ml de agua desionizada estéril. Almacene la solución de trabajo a temperatura ambiente durante un tiempo de hasta una semana.</li>
		<li>Prepare 10x solución de almacenamiento en búfer PBS-Glycine añadiendo 37,5 g de glicina a 500 ml de 10x PBS. Ajuste el pH a 7,4. Almacene la solución de stock durante un tiempo de hasta 6 meses a 4 °C para evitar la sedimentación.</li>
		<li>Cree una solución PBS-Glycine en funcionamiento diluyendo 50 ml de tampón PBS-Glycine de 10x en 450 ml de agua desionizada estéril. Almacene la solución de trabajo a 4 °C durante una semana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etiqueta Muestras bioimpresas e imagen por microscopía confocal<ol>
<li>Aspirar medio de co-cultivos 3D bioimpresos y enjuagar 3 veces con PBS caliente. Corrija los co-cultivos 3D bioimpresos con un 4% de paraformaldehído durante 1 h a temperatura ambiente. Enjuague muestras 3 veces durante 20 minutos con 1x PBS-Glycine.</li>
		<li>Bloquee muestras con búfer IF mezclado con 10% suero de cabra durante 90 minutos (bloque primario), seguido de 40 minutos con buffer IF más 10% suero de cabra y fragmento Affinipure Fab (1:100, bloque secundario).</li>
		<li>Si utiliza esferoides MCF10A, etiquete muestras con un anticuerpo primario para integrina α6 (1:100) en búfer de bloqueo secundario durante la noche a 4 °C, seguido de un anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 (1:200) y Hoescht 33342 (1:1000) para 1 h a temperatura ambiente protegido de la luz. Las líneas celulares MCF10A expresan altos niveles de integrina α6, que es esencial para mostrar polarización esferoide y morfología.</li>
		<li>Si utiliza esferoides MDA-MB-231, que expresan bajos niveles de integrina α6, etiquete muestras con fhalloidina Alexa Fluor 488 (1:100) y Hoescht 33342 (1:1000) en búfer de bloqueo secundario durante 4 horas a temperatura ambiente protegida de la luz. La faloidina permite la visualización del filamento actin para que se pueda evaluar la morfología amorfa e invasiva esferoide.</li>
		<li>Lave muestras con 1X PBS-glicina 3 veces durante 20 minutos.</li>
		<li>Prepare muestras para el montaje retirando la diapositiva de la cámara con la herramienta del fabricante. Agregue una pequeña gota de solución antifadios a cada pozo. Coloque una funda de 22 mm x 60 mm en cada tobogán de cámara y selle cuidadosamente los bordes con esmalte de uñas transparente.</li>
		<li>Muestras de imagen utilizando un microscopio confocal como pilas Z de ~10 rebanadas en pasos de 5 μm. Si lo desea, comprima planos Z en un solo plano mediante el comando Enfoque extendido en el software de imágenes celulares.</li>
		<li>Cuantificar la adhesión esferoide a las redes endoteliales utilizando la imagen J. El número de esferoides adherentes se puede cuantificar utilizando el plugin analyze con el tamaño de partícula y la circularidad adecuados. Normalice el número de esferoides conectados al área de imagen.</li>
		<li>Para garantizar la reproducibilidad, cuantifique el número de esferoides adheridos en 4 x 4 imágenes en mosaico de co-culturas. Si el número de esferoides es estadísticamente significativamente menor que otros experimentos, el experimento debe repetirse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo es el primero de su tipo en bioimprimir esferoides en su arquitectura 3D para co-cultivo con células endoteliales también en su arquitectura 3D. Los pasos críticos del protocolo incluyen la formación inicial de esferoides epiteliales mamales y redes HUVEC. Se debe tener extrema precaución en la alimentación de esferoides epiteliales mamarios, ya que se interrumpen fácilmente de la solución de matriz. Del mismo modo, los esferoides epiteliales mamales deben tratarse con cuidado cuando se pipetizan f...

Los modelos tumorales vascularizados in vitro 3D son herramientas esenciales para el estudio mecanicista del crecimiento del cáncer y la metástasis. Para el cáncer de mama en particular, las células epiteliales mamarias cultivadas en Matrigel se organizan en esferoides polarizados que se asemejan más a la arquitectura in vivo mammary acinus1,2,3,4,5,6,7,8. Cultivo celular epitelial mamario 3D también afecta la función celular, con cultivos 3D que muestran diferencias en la modulación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF)8,9; función de oncogeno, incluyendo ErbB210; crecimiento y apoptosis señalización11,12; y resistencia a la quimioterapia13,14. Las células endoteliales vasculares responden de manera similar a los estímulos ambientales en 3D frente al cultivo tradicional 2D15,16,17,18. Sin embargo, gran parte de la comprensión de las interacciones endoteliales vasculares y epiteliales mamarias proviene del cultivo 2D utilizando insertos medianos o transwell acondicionados, o modelos 3D en los que los dos tipos de células están físicamente separados19,20,21,22,23. Estos modelos de co-cultivo proporcionan una visión fisiológica limitada, ya que tanto el cultivo 3D como el contacto célula-celular son críticos para el endotelial vascular – interacciones celulares epiteliales mamarias24,25,26.
Los modelos oncológicos 3D han sido fabricados utilizando una variedad de técnicas, incluyendo la formación de esferoides colgantes, bioimpresión, montaje magnético y cultivo dentro de hidrogeles o en andamios diseñados5,27,28,29. Más recientemente, se crearon modelos de tumores 3D con múltiples tipos de células dispuestas en sus respectivas estructuras 3D. En un ejemplo de una plataforma tumoral en un chip, el cáncer, las células endoteliales y estromales se mezclaron en una matriz y luego se inyectaron en las tres cámaras del tejido central en un dispositivo de polidimetilesiloxano (PDMS). Las cámaras de tejido estaban bordeadas por dos canales exteriores que representaban una arteria y una venul. Después de 5-7 días de cultivo, las células endoteliales formaron una red microvascular y las células cancerosas proliferaron para formar pequeños tumores cerca de la vasculatura. Esta plataforma se utilizó entonces para examinar drogas y combinaciones de drogas30. Se han creado plataformas adicionales de tumor en un chip para estudiar metástasis y tipos de cáncer con estímulos mecánicos específicos (por ejemplo, tensión mecánica en el pulmón)31,32. Sin embargo, estas plataformas generalmente no incluyen vasculatura y cáncer en sus respectivas estructuras 3D.
La biofabricación muestra una gran promesa en el avance de modelos tumorales vascularizados in vitro en 3D, ya que permite un estricto control espacial sobre la ubicación celular. A pesar del crecimiento de la bioimpresión en la última década, pocos estudios se centran específicamente en tumores33,34. En un ejemplo, la impresión 3D de células HeLa en un hidrogel gelatina/alginato/fibrinógeno se utilizó para crear un modelo de cáncer cervical in vitro. Las células tumorales fueron bioimpresas como células individuales y luego se les permitió formar esferoides, que mostraron una mayor tasa de proliferación, mayor expresión de metaloproteinasa de matriz y mayor quimioterasis que las células en el cultivo2D 35. En estos estudios, como en muchos otros36,37,las suspensiones celulares disociadas fueron bioimpresas, y luego se proporcionaron los cultivos celulares con las señales mecánicas y bioquímicas requeridas para permitir que las células formen una estructura 3D. Sin embargo, el autoensamblaje celular puede tardar días o semanas, puede requerir señales ambientales espaciales y temporales complejas o no puede ocurrir cuando dos tipos de células son co-cultivadas. Por ejemplo, las células epiteliales mamarias indujeron la muerte celular en células endoteliales en el co-cultivo 2D, y las células epiteliales mamarias disociadas no formaron esferoides 3D cuando se bioimprimieron en hidrogeles de alginato/gelatina38. Las células epiteliales o cancerosas de mama disociadas formaron esferoides en bioinks a base de alginato solo cuando se encerraban en moldes circulares de PDMS. En otros casos, los esferoides se formaron utilizando gotas suspendidas en placas circulares de pozos de fijación ultrabaja y luego se mezclaron en bioinks a base de alginato39,40.
Ahora describimos un método alternativo de biomanufacturación de tejidos 3D en este protocolo. En lugar de semillas disociadas y esperar a que estas células formen las estructuras 3D, describimos cómo crear y bioimprimir esferoides tumorales 3D en una red de tubos vasculares para crear un modelo de co-cultivo tumoral que se puede utilizar casi inmediatamente. Los esferoides tumorales pueden cultivarse in vitro o derivarse de tejidos humanos (organoides). Del mismo modo, los tubos vasculares se pueden cultivar o pueden derivarse de fragmentos microvasculares de tejido adiposo. Los bioinks pueden ir desde el alginato biológicamente inactivo hasta el altamente activo Matrigel41. Dado que este modelo de co-cultivo tumoral 3D se puede crear con una variedad de estructuras celulares y bioinks, puede incorporar múltiples tipos de células, matrices extracelulares y gradientes de quimiocina15,42. Mientras que en su formulación actual, las redes endoteliales no pueden ser perfundidas, futuras iteraciones podrían integrar este método con microfluidos o sistemas -on-chip. La bioimpresión de esferoides epiteliales de mamas 3D en redes endoteliales permite una biofabricación rápida de modelos mamarias humanos para pruebas de drogas y medicina de precisión personalizada27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

La bioimpresión está emergiendo como una herramienta prometedora para fabricar modelos de cáncer humano 3D que recapitulan mejor las señas de identidad críticas de la arquitectura de tejidos in vivo. En la bioimpresión actual de extrusión capa por capa, las células individuales se extruyen en un bioink junto con señales espaciales y temporales complejas para promover el autoensamblaje del tejido jerárquico. Sin embargo, esta técnica de biofabricación se basa en interacciones complejas entre células, bioinks y señales bioquímicas y biofísicas. Por lo tanto, el autoensamblaje puede tomar días o incluso semanas, puede requerir bioinks específicos, y no siempre puede ocurrir cuando hay más de un tipo de célula involucrado. Por lo tanto, desarrollamos una técnica para bioimprimir directamente esferoides epiteliales de mama 3D preformados en una variedad de bioinks. Los esferoides epiteliales 3D preformados bioimpresos mantuvieron su viabilidad y arquitectura polarizada después de la impresión. Además imprimimos los esferoides 3D en redes celulares endoteliales vasculares para crear un modelo de co-cultivo. Por lo tanto, la novedosa técnica de bioimpresión crea rápidamente un modelo mamario humano 3D más fisiológicamente relevante a menor costo y con mayor flexibilidad que las técnicas tradicionales de bioimpresión. Esta versátil técnica de bioimpresión se puede extrapolar para crear modelos 3D de otros tejidos en bioinks adicionales.

Las células epiteliales mamarias deben autoorganización en esferoides 3D después de 5-8 días de cultivo en solución de matriz y en medio de cultivo con 2% solución de matriz. Los esferoides epiteliales de mama MCF10A no tumorigénicos deben aparecer redondos y tener un centro hueco, con integrina α6 polarizada al borde exterior del esferoide(Figura 1,inset muestra centros huecos). Las células epiteliales de cáncer de mama MDA-MB-231 altamente invasivas forman esferoides irregulares....

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Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

El objetivo de este protocolo es bioimprimir directamente las células epiteliales mamarias como esferoides multicelulares en redes endoteliales preformadas para crear rápidamente modelos de co-cultivo endotelial mamario 3D que pueden ser utilizados para estudios de detección de fármacos.

Bioimpresión directa de esferoides multicelulares de mama 3D en redes endoteliales

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.8K vistas.  Drexel University. El objetivo de este protocolo es bioimprimir directamente las células epiteliales mamarias como esferoides multicelulares en redes endoteliales preformadas para crear rápidamente modelos de co-cultivo endotelial mamario 3D que pueden ser utilizados para estudios de detección de fármacos.

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Investigación

Bioingeniería

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with poor clinical outcomes and currently lacks effective treatment. Both the three-dimensional (3D) environment and the dynamic mechanical forces are very important factors in this metastatic cascade. However, traditional cell cultures fail to recapitulate this natural tumor microenvironment. Thus, in vivo-like models that can emulate the intraperitoneal environment are of obvious importance. In this study, a new microfluidic platform of the peritoneum was set up to mimic the situation of ovarian cancer spheroids in the peritoneal cavity during metastasis. Ovarian cancer spheroids generated under a non-adherent condition were cultured in microfluidic channels coated with peritoneal mesothelial cells subjected to physiologically relevant shear stress. In summary, this dynamic 3D ovarian cancer-mesothelium microfluidic platform can provide new knowledge on basic cancer biology and serve as a platform for potential drug screening and development.

To study ovarian tumor progression in a physiologically relevant model, multicellular spheroids were cultured in a microdevice under simulated fluid flow. This dynamic 3D model emulates the intraperitoneal environment with the cellular and mechanical components where ovarian cancer metastasis occurs.

Modelización del comportamiento del cáncer de ovario en un esferoide multicelular Microdevice 3D dinámico peritoneal

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Creación de tejido cardiaco que exhibe la integración mecánica de esferoides usando bioprinting 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting de cartílago y piel análogos de tejido utilizando un pasivo novela mezcla de unidad técnica de Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the living body than two-dimensional cell culture. In this study, we fabricated an electrical motor-driven lab-on-a-CD (compact disc) platform, called a centrifugal microfluidic-based spheroid (CMS) culture system, to create three-dimensional (3D) cell spheroids implementing high centrifugal force. This device can vary rotation speeds to generate gravity conditions from 1 x g to 521 x g. The CMS system is 6 cm in diameter, has one hundred 400 &#956;m microwells, and is made by molding with polydimethylsiloxane in a polycarbonate mold premade by a computer numerical control machine. A barrier wall at the channel entrance of the CMS system uses centrifugal force to spread cells evenly inside the chip. At the end of the channel, there is a slide region that allows the cells to enter the microwells. As a demonstration, spheroids were generated by monoculture and coculture of human adipose-derived stem cells and human lung fibroblasts under high gravity conditions using the system. The CMS system used a simple operation scheme to produce coculture spheroids of various structures of concentric, Janus, and sandwich. The CMS system will be useful in cell biology and tissue engineering studies that require spheroids and organoid culture of single or multiple cell types.

We present a motor-powered centrifugal microfluidic device that can cultivate cell spheroids. Using this device, spheroids of single or multiple cell types could be easily cocultured under high gravity conditions.

Plataforma Lab-on-a-CD para generar esferoides tridimensionales multicelulares

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protocolos de Bioimpresión 3D de Bioinks basados en Gelatin Methacryloyl Hydrogel

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

Bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejido neural

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Biofabricación asequible asistida por microscopía de oxígeno de esferoides multicelulares

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Producción automatizada a gran escala de esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo para bioimpresión 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Hidrogeles bioimpresos fotoajustables para sondear las respuestas celulares al endurecimiento de la MEC

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture platforms and dynamically triggering changes, such as increasing microenvironmental stiffness, enables researchers to model changes in the extracellular matrix (ECM) that occur during fibrotic disease progression. Herein, a method is presented for 3D bioprinting a phototunable hydrogel biomaterial capable of two sequential polymerization reactions within a gelatin support bath. The technique of Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting was adapted by adjusting the pH of the support bath to facilitate a Michael addition reaction. First, the bioink containing poly(ethylene glycol)-alpha methacrylate (PEG&#945;MA) was reacted off-stoichiometry with a cell-degradable crosslinker to form soft hydrogels. These soft hydrogels were later exposed to photoinitator and light to induce the homopolymerization of unreacted groups and stiffen the hydrogel. This protocol covers hydrogel synthesis, 3D bioprinting, photostiffening, and endpoint characterizations to assess fibroblast activation within 3D structures. The method presented here enables researchers to 3D bioprint a variety of materials that undergo pH-catalyzed polymerization reactions and could be implemented to engineer various models of tissue homeostasis, disease, and repair.

Autor destacado: Comprensión de las enfermedades pulmonares crónicas mediante hidrogeles fotoajustables impresos en 3D 

This article describes how to 3D bioprint phototunable hydrogels to study extracellular matrix stiffening and fibroblast activation.

Bioimpresión 3D de hidrogeles fotoajustables para estudiar la activación de fibroblastos

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...

Methods Article

Bioimpresión directa de esferoides multicelulares de mama 3D en redes endoteliales