The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

1. Preparación de polimérica acuosa sistema de dos fases (ATPS) <ol><li> Pesar 0,5 g de polietilenglicol (PEG) (MW: 35.000) y añadirlo a 9,5 ml de medio de crecimiento completo en un cónica 15 ml estéril para preparar 10 ml de 5% (w / v) PEG fase acuosa. Nota: Adición de la mitad del medio a la cónica primero seguido de la adición del polímero y luego la cantidad restante de medio minimiza la adhesión del polímero a las paredes cónicas y ayuda a que el polímero se disuelve más rápido. </li><li> Pesar 0,128 g de dextrano (DEX) (MW: 500.000) y añadirlo a 0,872 ml de medio de crecimiento completo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril para preparar 1 ml de 12,8% (w / v) de fase acuosa DEX. </li><li> Vortex tanto soluciones durante aproximadamente 1 min para disolver los polímeros en el medio. </li><li> Mantenga ambas soluciones en un baño de agua a 37 ° C durante 1 hora para asegurar la disolución y mezclas homogéneas. Mantenga las tapas por encima del nivel del agua para evitar la posibilidad de contaminación de las soluciones del bañoagua. </li><li> Cargar la solución de fase de PEG en una jeringa de plástico estéril y pasarlo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras de tamaño de poro para eliminar las impurezas. Nota: llene la jeringa con la solución de PEG, colocarlo en el inserto del filtro en la parte superior de un tubo cónico y el uso de la fuerza, empuje lentamente la solución a través del filtro. Es normal experimentar la resistencia contra el movimiento del émbolo de la jeringa. Pérdida menor de la solución de polímero se produce como parte de la solución permanecerá en el filtro, pero la concentración de polímero no va a cambiar. </li><li> Pipetear 10 l de la solución de fase DEX y diluir en 10 l de medio en un tubo separado para dar lugar a 6,4% (w / v) solución de fase DEX. Aspirar 100 l de la solución de fase de PEG y dispensar en una placa de Petri. <ol><li> Dispensar 0,5 l de la 6,4% (w / v) solución de fase de DEX en la solución de fase de PEG. Confirmar visualmente con éxito la formación de ATPS mediante la observación de una gota DEX bajo un microscopio. El límite gotadebe permanecer visible, indicando la presencia de dos fases acuosas estables, separadas. </li></ol></li><li> Almacenar la madre acuosa PEG y soluciones de fase de DEX en 4 ° C hasta su uso. Nota: Se recomienda que las soluciones de polímero se preparan fresco antes de cada experimento y se usan dentro de las 24 horas de almacenamiento. </li></ol> 2. Preparación para la impresión de cáncer esferoides celulares <ol><li> Se cultivan las células de cáncer de interés (por ejemplo, células MDA-MB-157 de cáncer de mama) a un 90% -100% monocapa confluente. Para MDA-MB-157 células, utilizar un medio compuesto por DMEM que contenía 10% de FBS, 1% de glutamina, y 1% de antibiótico. <ol><li> Cosecha células utilizando un tampón de disociación celular (de acuerdo con el protocolo del fabricante) y cargar la suspensión en una cónica 15 ml. Centrifugar durante 5 min a 173,3 xg, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de medio de crecimiento completo. </li></ol></li><li> Las celdas de carga en un hemocitómetro y contarlas para calcular el número requeridode células para una densidad celular esferoide deseado. Una monocapa confluente de células MDA-MB-157 células cultivadas en un matraz T75 generalmente da ~ 7 x 10 6 células. Nota:. Densidad celular requerida para un volumen de gota para generar un solo esferoide dependerá del tipo de célula 22 Por ejemplo, una densidad de 1,5 x 10 4 o mayor para la MDA-MB-157 células se recomienda por 0,3 l gota fase de DEX a asegurar la formación de un solo esferoide. </li><li> Centrifugar las células para una segunda vez durante 5 min a 173,3 xg y resuspender en un volumen apropiado de medio de crecimiento para concentrar la suspensión a una densidad celular deseada. Nota: Por ejemplo, si se cosecharon 7 x 10 6 células cancerosas, el volumen total de suspensión de células requerido para formar un esferoide de la densidad de 1,5 x 10 4 células en una gota de fase DEX 0,3 l será 140 l. Sin embargo debido a la dilución con la solución de fase DEX en el siguiente paso, sólo utilizar 70 l de medio de cultivo celular para resuspender las células. </li><li&gt; Añadir a la suspensión de células resultante un volumen igual de la 12,8% (w / v) solución de fase acuosa preparada en la DEX 1.2. Para el ejemplo de esferoide densidad de 1,5 x 10 4 células, 70 l de la solución de fase DEX se añaden a 70 l de suspensión celular. </li><li> Mezclar bien la suspensión de células para asegurar una distribución uniforme de células y la mezcla de solución de DEX. Pipeteado arriba y abajo deben hacerse con cuidado para evitar la formación de burbujas. </li></ol> 3. Preparación para la impresión de los esferoides cocultivaron <ol><li> Se cultivan las células de cáncer (por ejemplo, MDA-MB-157 células de cáncer de mama humano) y células de apoyo (por ejemplo, fibroblastos humanos) a un 90% -100% monocapa confluente. Cosecha de cada tipo de células usando un tampón de disociación celular (de acuerdo con el protocolo del fabricante). <ol><li> Cargar cada suspensión en un cónica 15 ml, centrifugar durante 5 min a 173,3 xg, y el sobrenadante aspirado de cada cónica. Resuspender las células de cada cónica en 1 ml de g completamedio recimiento. Nota: Los tintes fluorescentes tales como calceína AM (tinción de células vivas) y colorantes nucleares (Hoechst) se pueden utilizar para distinguir los dos tipos de células. </li></ol></li><li> Cargar cada tipo de célula por separado en un hemocitómetro y contarlas para calcular el número requerido de cada tipo de célula para una relación deseada de las células de cáncer de células de soporte en co-cultivadas esferoides. Monocapas confluentes de células MDA-MB-157 células y los fibroblastos cultivados en matraces T75 suelen dar ~ 7 x 10 ~ 6 y 6 x 10 6 células, respectivamente. </li><li> Añadir el volumen correcto de la suspensión de células de sostén a las células cancerosas suspensión para dar una relación deseada de la cantidad de dos tipos de células. Por ejemplo, utilizar una proporción de 50 células cancerosas a 1 celular de fibroblastos. </li><li> Centrifugar la cónica que contiene la suspensión celular se mezcló durante 5 min a 173,3 células XG y resuspender en un volumen apropiado para dar como resultado la densidad final que comprende de volúmenes iguales de medio de crecimiento y el 12,8% (w / v) DEX acuosasolución de fase (preparado en 1.2). </li><li> Pipetear suavemente la suspensión celular resultante de arriba a abajo para asegurar la homogeneidad de la suspensión. </li></ol> 4. Impresión de esferoides tumorales en una placa de 96 pocillos <ol><li> Un día antes de los experimentos, recubrir placas no tratadas, de fondo redondo de 96 pocillos con 1% (w / v) Pluronic a 37 ° C durante 24 hr. Este recubrimiento evita la unión de células durante el período de cultivo. </li><li> Dispensar 50 l de la filtró 5% (w / v) PEG fase acuosa en cada pocillo de una (placa de destino) placa de 96 pocillos. </li><li> Con una pipeta, mezclar la suspensión celular (preparado en el paso 2 o el paso 3 de los mono y co-cultivo, respectivamente) y añadir 20 l de la suspensión de todos los demás bien de una columna de una placa de 384 pocillos (placa de fuente) . </li><li> Encienda el manipulador de líquidos y &quot;casa&quot; la cabeza de pipeteado para registrar las coordenadas. A continuación, compile un protocolo previamente definido (por debajo de 4,6) para asegurar el material de laboratorio y los parámetros se definen correctaly. Este paso &quot;homing&quot; puede ser diferente para diferentes manejadores de líquidos. Nota: El flujo del protocolo, se muestra paso a paso a continuación en 4.6, será similar independientemente del manipulador de líquidos robótico utilizado; Sin embargo, la interfaz de programación puede ser diferente debido a la utilización de un software diferente. </li><li> Colocar la placa fuente, la placa de destino, y las cajas de puntas de pipeta en las posiciones definidas en la estación de trabajo del manipulador de líquidos como se muestra en la Figura 1. </li><li> Ejecutar el protocolo que incluye los siguientes pasos: <ol><li> Cargar una columna de barriles de la cabeza de pipeteado del manipulador de líquidos con la mezcla de puntas de pipeta (8 tips) desde la estación de trabajo (Figura 1). </li><li> Mezclar la suspensión celular en pocillos de la placa fuente (Figura 1). Seleccionar un volumen de mezcla más pequeño que el volumen de suspensión celular en pocillos para evitar la formación de burbujas. </li><li> Expulsar puntas en una caja de vertederos vacío (Figura 1). </li&gt; <li> Cargar una columna de barriles de la cabeza de pipeteado con 10 l de dispensación puntas de pipeta (Figura 1). </li><li> Aspirar 0,3 l de la suspensión de células de la placa fuente (Figura 1) en cada punta de la pipeta. </li><li> Dispensar la suspensión de células en los pocillos de una columna de la placa de destino (Figura 1). Utilice una altura de dispensación de 0,5 mm y una velocidad de flujo de dispensación de menor que 1 l / seg. </li><li> Repetir los pasos 4.6.1 a través de 4.6.6 hasta que la impresión de la columna por columna en toda la placa de destino es completa. </li></ol></li><li> Retire con cuidado la placa de destino de la superficie de trabajo y colocarla en una incubadora húmeda a 37 ° C y 5% de CO 2. Mantener la placa horizontal al introducirla a la incubadora para evitar la interrupción de las gotas de la fase de ejecución directa que contienen células. </li><li> Incubar la placa durante 24 horas para permitir la agregación de células en un esferoide dentro de la gota fase DEX. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Tratamiento de Drogas de esferoides de células cancerosas Tenga en cuenta que el siguiente protocolo es para un tratamiento farmacológico de 4 días e incluye una renovación con el fármaco fresco después de día 2. Puede ser modificado para otros períodos de tratamiento. <ol><li> Confirmar visualmente la formación de esferoides en placas de 96 pocillos después de 24 horas. Si es necesario, pozos de imagen para la medición del tamaño de esferoides promediando los diámetros más pequeños y más grandes de cada esferoide. </li><li> Preparar la solución de stock de un fármaco deseado mediante su disolución en un disolvente recomendado por el fabricante a una concentración de solubilidad predeterminado. Por ejemplo, el cisplatino se disuelva en agua a 2 mg / ml. Nota: Proteja la solución madre de la droga de la luz si el fármaco es sensible a la luz. </li><li> Utilizando la técnica de dilución en serie, preparar concentraciones de fármaco diluido con medio de cultivo celular a partir de la solución madre preparada en la etapa anterior. Cada dilución se debe hacer dos veces la concentración deseada. Dilratios de ution variarán dependiendo de la concentración de stock de partida y concentraciones de trabajo deseada. </li><li> Añadir 50 l de solución de fármaco preparada en el paso anterior a cada pocillo. Esto se puede hacer robóticamente o mediante pipeteo manual. Nota: Cada concentración del fármaco se diluye en medio a la concentración deseada por la fase acuosa PEG 50 l ya en cada pocillo. <ol><li> Utilice esferoides de dos columnas de una placa de 96 pocillos (n = 16) para cada concentración. </li><li> En los pocillos de control, añadir sólo 50 l de medio de cultivo fresco a los 50 l de la fase acuosa PEG existentes. </li></ol></li><li> Incubar esferoides con el fármaco durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, protegido de la luz. </li><li> Después de 48 h de incubación, preparar diluciones frescas de la droga a concentraciones deseadas y renovar de drogas mediante la adición de 50 l de solución de fármaco fresco a cada pocillo. Nota: Los pozos ya contienen la concentración de fármaco deseado a partir de la primera droga tratamiento. Por lo tanto en esta fase de renovación, cada concentración se prepara a la concentración deseada, ya que no se producirá una dilución. </li><li> Incubar esferoides con el medicamento durante otras 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, protegido de la luz. </li></ol> 6. Análisis de la viabilidad celular en esferoides <ol><li> Después de 48 horas de incubación con el fármaco renovado (es decir, el tiempo total de tratamiento de esferoides con un fármaco es 4 días), medir el volumen total de medio en un pocillo mediante pipeteo manual. Nota: El volumen típico en un pocillo es de ~ 140 l (una pequeña disminución se produce debido a la evaporación). </li><li> Calcular el volumen de reactivo de la viabilidad celular (por ejemplo, PrestoBlue) como la concentración de 10% del volumen total así. Añadir este volumen de reactivo de la viabilidad celular a cada pocillo. Nota: Con un volumen de medios de comunicación existentes de 140 l en un pozo, se requiere un volumen de 15,6 l para dar una concentración 10% del total así. Esto se calculadividiendo el volumen de medios existente por 9 (140 l / 9 = 15,6 l). </li><li> Se incuba la placa con el reactivo de la viabilidad celular a cada pocillo durante 6 horas a 37 ° C, protegido de la luz. </li><li> Colocar la placa en un lector de micro-placa y leer la señal de fluorescencia a 560 nm y 590 nm de excitación y de emisión de longitudes de onda, respectivamente. </li><li> Calcular el porcentaje de viabilidad de las células en los esferoides por la normalización de la señal fluorescente de los pocillos tratados con el de los pocillos de control después de promediar los valores de las mismas condiciones de tratamiento. </li></ol>

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Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Esferoides presentan un modelo realista para entender mejor la fisiología del tumor y la eficacia del fármaco y proporcionar una herramienta útil para el descubrimiento de fármacos anti-cáncer. Dichas aplicaciones se beneficiarían mucho de técnicas sencillas de generación y mantenimiento esferoide que sólo requieren material de laboratorio estándar, herramientas de manejo de líquidos y equipos de control. El uso de un sistema de dos fases acuosa células cancerosas espontáneamente agregados dentro de la fase...

Ensayos basados ​​en células constituyen un instrumento importante para el desarrollo y descubrimiento de nuevos fármacos contra el cáncer. 1,2 Históricamente, se han empleado cultivos monocapa de células cancerosas para investigar la eficacia de los compuestos candidatos contra determinados tipos de células cancerosas. La facilidad de mantenimiento de los cultivos en monocapa en placas de cultivo estándar, la compatibilidad de placas estándar con herramientas robóticas comerciales para la adición de reactivos, y con los equipos de control para el análisis de aguas abajo de las respuestas celulares a los compuestos químicos son los principales beneficios que hacen que las culturas 2D una herramienta atractiva para las pruebas de drogas. 3 Desafortunadamente, ensayos de células monocapa a menudo fallan para predecir la eficacia de los compuestos in vivo, por lo que el desarrollo de fármacos y el descubrimiento de un proceso extremadamente costoso. 4,5 A pesar de la inversión y el esfuerzo significativo por las compañías farmacéuticas y unidades académicas, sólo ~ 1% de lucha contra el cáncer fueron aprobados fármacos en ensayos clínicospor la FDA en los últimos dos decenios. 6 Disparidad entre las culturas en 2D y el complejo entorno 3D de células cancerosas en vivo es una de las principales deficiencias de los sistemas de cultivo en monocapa. 7 Por lo tanto, el cribado de compuestos candidatos contra las células tumorales en un entorno que se asemeja más el ambiente del tumor 3D puede acelerar el desarrollo de nuevos fármacos para quimioterapia. 8 Esferoides celulares de cáncer presentan un modelo de tumor 3D relevante in vitro. 9,10 esferoides son grupos compactos que se forman a través del conjunto espontánea o inducida de células cancerosas en las superficies no adherentes o en suspensión usando técnicas tales como matraz de centrifugación, recubrimiento líquido, micro microfabricado . bien arrays, microfluídica, y las gotas que cuelgan 11-16 esferoides imitan las características clave de los tumores sólidos, incluyendo la geometría y el transporte limitado de oxígeno, nutrientes y compuestos de la droga en la zona central; Por lo tanto, se regeneran más estrechamente respon drogasSE de tumores sólidos en comparación con los cultivos monocapa. 17-19 A pesar de esta marcado beneficio, esferoides no se utilizan habitualmente para el cribado de compuestos químicos contra las células cancerosas. Dificultad de producir esferoides de tamaño uniforme en un entorno estándar de alto rendimiento que es compatible con la robótica disponibles en el mercado y herramientas de detección / imagen impide la incorporación de la cultura esferoide en línea de desarrollo de fármacos. Aunque los materiales y las placas personalizados se han convertido recientemente disponible en el mercado para hacer frente a esta necesidad, las consideraciones de costo disuaden de su uso generalizado. Dos de las principales técnicas con la capacidad de producir esferoides tamaño consistentes en alto rendimiento de utilizar una nueva plataforma de gota colgante y micro pozos microfabricados. 13,16,20 Sin embargo, ambos enfoques requieren placas y dispositivos que son caros de fabricar e inconveniente para los usuarios de puntos finales especiales en centros de investigación básicos y las industrias farmacéuticas donde lo más importante efse hacen fuertes para el descubrimiento de nuevos fármacos contra el cáncer. A pesar de algunas mejoras en la estabilidad de las gotas que contienen células con un diseño reciente de colgar placas de caída, sólo uno de cada otro agujero de la placa todavía se utiliza durante el cultivo para evitar la propagación / fusión de gotas. 16 Esto disminuye significativamente el rendimiento experimental. Además de Drogas y la renovación es difícil con manual o pipeteo robotizado y esferoides deben ser transferidos a una placa estándar para el análisis bioquímico, porque esta configuración de la placa no es fácilmente compatible con los equipos de control convencional, tal como lectores de placas. 21 Micro-pozos fabricados utilizando litografía blanda también permitir tamaño controlado producción esferoide. 13,20 Sin embargo, la incompatibilidad de esta plataforma con herramientas de pipeteo estándar evita el tratamiento de esferoides individuales con diferentes compuestos de fármacos / concentraciones, exponiendo todos los esferoides a una sola condición de tratamiento. Por lo tanto, este método no es apropiado para altala investigación de compuestos rendimiento que exige la prueba simultánea de múltiples compuestos / concentraciones. Para superar estos obstáculos, una nueva técnica para la producción de alto rendimiento de esferoides de células de cáncer de tamaño uniforme en placas de 96 pocillos estándar ha sido desarrollado. 22,23 El enfoque se basa en un sistema acuoso polimérico de dos fases (ATPS) con polietilenglicol ( PEG) y dextrano (dex) como polímeros formadores de fase. 24 ATPSs Recientemente se han utilizado en una variedad de aplicaciones biológicas celulares nuevas que permitan micropatterning celular y localizada entrega de reactivos biológicos a las células en medios altamente acuosas. 25-32 Para formar una esferoide, las células cancerosas se mezclan con la fase acuosa DEX y una gota sub-microlitros de la suspensión resultante se pipetean en una solución de fase acuosa PEG de la inmersión pocillo que contiene. La caída sigue siendo inmiscible de la fase de inmersión y las células se limita a facilitar la formación de un esferoide. Diablilloortantly, la fase de inmersión altamente acuosa proporciona nutrientes a las células del esferoide y minimiza el problema bien conocido de la evaporación medios de comunicación común a algunos otros ensayos que causa cambios en la osmolalidad medios de comunicación y las fluctuaciones de las concentraciones de fármaco. Esta técnica permite la producción esferoide y el tratamiento de drogas sólo utilizando reactivos comercialmente disponibles y herramientas de pipeteado en placas de 96 pocillos estándar. Es importante destacar que, el análisis de las respuestas celulares de esferoides se realiza en la misma placa utilizando ensayos bioquímicos estándar y lectores de placas. La facilidad de trabajar con SDFA y adaptabilidad del enfoque para el manejo de líquidos robótico hace alta generación de rendimiento tanto de mono-cultura y la co-cultura esferoides una técnica de laboratorio sencillo. Este nuevo enfoque será un gran paso adelante hacia la integración de esferoides de células cancerosas en los procesos de desarrollo y descubrimiento de fármacos con un mejor rendimiento de las pruebas y la rentabilidad (aumento del número de compuestos y redu probadosconsumo ced reactivo) y la eficiencia (reducción de manos a tiempo). Un protocolo detallado para la producción robótico de esferoides de células de cáncer en placas de 96 pocillos utilizando el enfoque ATPS se describe a continuación. Además, se presentan los detalles del tratamiento farmacológico de esferoides resultantes y análisis de aguas abajo de respuestas celulares usando un ensayo bioquímico comercial.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mw: 35,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Mw: 500,000</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>5510 0500 9007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12306C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clacein AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>15663-27-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-13261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-108</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>542342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (10 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P10V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (70 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P70V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Handler</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SRT Bravo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Biotek Instruments</td>
			<td>Synergy H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

La estación de trabajo del manipulador de líquidos robótico se muestra en la Figura 1. La cabeza de pipeteado y todas las estaciones utilizadas en la impresión robótica de esferoides en la sección 4.6 se etiquetan. La imagen muestra el uso de dos estaciones diferentes de cajas de punta (un conjunto de consejos para la mezcla y el segundo conjunto para la aspiración / dispensación de mezcla de fase DEX-suspensión acuosa de células). Toda la instalación se encuentra en un armario estándar de s...

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Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Producción Robótica de Cancer Cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K vistas.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Video: Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Investigación

Bioingeniería

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is conducted by eliciting an illusion through use of a mirror as if the hemiplegic arm is moving in real-time while moving the healthy arm. It can facilitate brain neuroplasticity through activation of the sensorimotor cortex. However, conventional mirror therapy has a critical limitation in that the hemiplegic arm is not actually moving. Thus, we developed a real-time 2-axis mirror robot system as a simple add-on module for conventional mirror therapy using a closed feedback mechanism, which enables real-time movement of the hemiplegic arm. We used 3 Attitude and Heading Reference System sensors, 2 brushless DC motors for elbow and wrist joints, and exoskeletal frames. In a feasibility study on 6 healthy subjects, robotic mirror therapy was safe and feasible. We further selected tasks useful for activities of daily living training through feedback from rehabilitation doctors. A chronic stroke patient showed improvement in the Fugl-Meyer assessment scale and elbow flexor spasticity after a 2-week application of the mirror robot system. Robotic mirror therapy may enhance proprioceptive input to the sensory cortex, which is considered to be important in neuroplasticity and functional recovery of hemiplegic arms. The mirror robot system presented herein can be easily developed and utilized effectively to advance occupational therapy.

We developed a real-time mirror robot system for functional recovery of hemiplegic arms using automatic control technology, conducted a clinical study on healthy subjects, and determined tasks through feedback from rehabilitation doctors. This simple mirror robot can be applied effectively to occupational therapy in stroke patients with a hemiplegic arm.

Sistema de terapia robótica Espejo para la recuperación funcional de armas hemipléjica

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar Transendothelial resistencia eléctrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificación y análisis de un anticuerpo monoclonal de células de ovario de hámster chino utilizando un sistema automatizado de microbiorreactores

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con CHO utilizando un separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Producción automatizada a gran escala de esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo para bioimpresión 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Generación escalable de esferoides de célula uniforme mediante un dispositivo de ensamblaje acústico 3D

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Autor destacado: Desarrollo de un método de ensamblaje acústico sin andamios para el cultivo de esferoides celulares 3D de alta calidad 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Dispositivo de montaje acústico tridimensional para la fabricación en masa de esferoides celulares

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...