Con este protocolo, podemos observar directamente la escisión del ADN específico del sitio mediante endonucleasas de restricción a nivel de una sola molécula. Nuestro enfoque multiplexado nos permite medir el tiempo que tardan cientos de REasas individuales en completar el ciclo catalítico. La multiplexación nos permite generar distribuciones de tiempo de permanencia hasta la escisión bien pobladas que podemos ajustar con la distribución de probabilidad gamma para obtener información sobre el mecanismo de escisión del ADN.
Comience preparando un tubo nuevo para cada oligonucleótido resuspendido a 50 microlitros del oligonucleótido y 50 microlitros de solución DTT recién preparada en cada tubo, pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Pipetear suavemente todo el volumen de cada mezcla de muestra en una columna preparada y centrifugar a 750 g durante dos minutos. Después de la centrifugación, almacene las muestras que no se vayan a utilizar inmediatamente a 20 grados centígrados para evitar la oxidación de los grupos tiol y la formación de enlaces disulfuro.
Pipetear una alícuota de 50 microlitros del caldo de puntos cuánticos en un dispositivo de diálisis para cada construcción que se vaya a fabricar, asegurándose de no tocar la membrana con la punta de la pipeta. Diálisis contra un volumen de tampón CHES que sea al menos 1.000 veces el volumen de la muestra agitando a 100 RPM durante 15 minutos. Con una pipeta, recupere con cuidado los puntos cuánticos suspendidos del dispositivo de diálisis y transfiéralos a un tubo nuevo que contenga un volumen igual de solución Sulfo-SMCC recién preparada, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 1.000 RPM para permitir que el Sulfo-SMCC reaccione con las aminas primarias en los puntos cuánticos. Luego, use una pipeta para transferir cuidadosamente cada muestra a un dispositivo de diálisis nuevo. Para eliminar el exceso de Sulfo-SMCC, dialice contra un volumen de tampón CHES que sea al menos 1.000 veces el volumen contenido en el dispositivo de diálisis agitando durante 15 minutos.
Cambie el tampón dos veces y realice la diálisis con tampón CHES nuevo tres veces en total, lo que permite que la diálisis continúe durante 15 minutos después de cada cambio de tampón. A continuación, repita la diálisis con PBS. Con una pipeta, recupere cuidadosamente la solución que contiene los puntos cuánticos del dispositivo de diálisis y transfiera cada muestra a un tubo nuevo que contenga una cantidad equimolar de oligonucleótido dilatado diluido en PBS.
Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación a 1.000 RPM. Agregue BSA a cada muestra para obtener una concentración final de 0,5 miligramos por mililitro. A continuación, utilice una pipeta para transferir cuidadosamente cada muestra a un dispositivo de diálisis nuevo y dializarla con el tampón de almacenamiento.
Después de la diálisis, recupere cuidadosamente cada muestra y colóquela en un tubo nuevo. Almacene las muestras a 4 grados centígrados. Combine una muestra de oligonucleótidos marcados con puntos cuánticos con un exceso molar diez veces mayor de oligonucleótido biotinilado.
Calienta la mezcla en un bloque de calor a 75 grados centígrados y mantenla a esa temperatura durante 5 minutos. Luego apague el bloque de calor y deje que la mezcla se enfríe lentamente. Guarde la construcción completa a 4 grados centígrados Con una multiherramienta rotativa de mano equipada con una broca de rueda cónica con punta de diamante, taladre dos orificios en las esquinas opuestas del portaobjetos de cuarzo para que sirvan como entrada y salida.
Asegúrese de asegurar la corredera en su lugar, lubrique la broca y deslícela constantemente con agua mientras perfora. Después de cada experimento, recupere el portaobjetos de cuarzo preparado empapando el dispositivo usado en acetona para disolver el adhesivo y el epoxi. Deseche los componentes restantes.
Combine 25 microlitros de solución de estreptavidina con 80 microlitros de PBS y 20 microlitros de tampón de bloqueo. Cubra un cubreobjetos tratado con PEG con esta mezcla e incube en un ambiente húmedo durante 30 minutos. Durante la incubación del cubreobjetos, prepare el espaciador de imágenes para crear un canal de flujo.
Corte una pieza cuadrada de 1 pulgada de material espaciador de imágenes, luego marque un canal de 2 milímetros de ancho alineado con los extremos de los orificios perforados en el portaobjetos de cuarzo. Corta el canal del material espaciador con un bisturí. Limpie bien el portaobjetos de cuarzo con acetona para eliminar cualquier resto de adhesivo de experimentos anteriores.
Despegue un lado del respaldo del espaciador de imagen y colóquelo con cuidado en la corredera de cuarzo, teniendo cuidado de no cubrir los orificios de entrada y salida. Lave el cubreobjetos con agua y séquelo con aire comprimido. Retire el otro lado del soporte del espaciador de imágenes y colóquelo entre el portaobjetos de cuarzo y el cubreobjetos recubierto de estreptavidina funcionalizada con pinzas de plástico para presionar el conjunto y eliminar las burbujas de aire del adhesivo.
Corte el extremo del tubo en ángulo para asegurar el libre flujo de la solución. A continuación, inserte un tubo de polietileno de 30 centímetros de largo en cada orificio del portaobjetos de cuarzo. Sostenga los tubos en su lugar con una rejilla para tubos, luego use epoxi para sellar los tubos en su lugar y los bordes del dispositivo ensamblado.
Una vez que se haya fijado el epoxi, inserte la aguja roma en una jeringa vacía en el tubo de salida del dispositivo y sumerja el extremo del tubo de entrada en un recipiente lleno de tampón de bloqueo. Tire hacia atrás del émbolo de la jeringa para llenar el dispositivo con tampón de bloqueo. A continuación, deje incubar el dispositivo durante al menos 30 minutos antes de utilizarlo.
Fije el dispositivo microfluídico a la placa de la platina del microscopio con cinta adhesiva. Ponga el objetivo en contacto con la parte inferior del dispositivo y coloque el objetivo de modo que el campo de visión esté dentro del canal microfluídico. Después de conectar el tubo de salida a la bomba de jeringa, enjuague el canal microfluídico con tampón de bloqueo nuevo tirando hacia atrás del émbolo de la jeringa.
Verifique que no haya burbujas atrapadas en el tubo o en el canal. Diluya 1 microlitro del sustrato de ADN preparado en 1 mililitro de tampón de bloqueo. Coloque el tubo de entrada en el sustrato de ADN diluido y haga fluir 800 microlitros de la solución de sustrato a través del canal a una velocidad de 200 microlitros por minuto.
Deje que la solución de ADN se incube en el canal durante 15 minutos después de que se detenga el flujo. Después de la incubación, haga fluir al menos 800 microlitros de tampón de bloqueo a través del canal a una velocidad de 200 microlitros por minuto para enjuagar el ADN no unido fuera del canal. Ajuste el enfoque del microscopio para que los puntos cuánticos atados a la superficie sean claramente visibles.
Enjuague el dispositivo microfluídico con 800 microlitros de tampón experimental sin magnesio a un caudal de 200 microlitros por minuto. Añadir la REase a una alícuota de tampón experimental sin magnesio y mezclar suavemente mediante pipeteo. Caudal 800 microlitros de 400 unidades por mililitro de EcoRV a través del canal a un caudal de 200 microlitros por minuto.
Comience el experimento haciendo fluir el tampón experimental que contiene magnesio y fluoresceína a un caudal de 200 microlitros por minuto. Comience a capturar datos inmediatamente después de poner en marcha la bomba de jeringa. Detenga la adquisición de datos después de fluir 800 microlitros de búfer.
Después de introducir el sustrato de ADN en la celda de flujo y lavar el exceso de ADN y puntos cuánticos, normalmente hay miles de puntos cuánticos individuales en un campo de visión. Están firmemente unidos a la superficie del vidrio y no sufren un oscurecimiento notable ni un blanqueo significativo durante todo el experimento. Cuando la REasa ha fluido a través del canal en ausencia de magnesio, al menos el 95% de los puntos cuánticos presentes al comienzo del experimento aún se pueden ver al final del período de observación.
Sin embargo, cuando el tampón que contiene magnesio fluye inmediatamente después de la REasa, hasta la mitad de los puntos cuánticos desaparecen al final del período de observación, de manera similar a lo que se observa cuando la REasa y el magnesio fluyen juntos a través del canal. La desaparición de los puntos cuánticos ocurre rápidamente y da lugar a una fuerte disminución de la trayectoria de intensidad, lo que proporciona una indicación clara del momento en el que se escinde una determinada molécula de ADN. Este experimento se llevó a cabo con el bien estudiado tipo II P REase EcoRV.
Se utilizaron tanto el ajuste de la curva de mínimos cuadrados no lineales como la estimación de los parámetros de máxima verosimilitud para extraer los valores de n y beta de los datos. Los dos métodos de estimación de parámetros estuvieron de acuerdo. Usando el ajuste de mínimos cuadrados no lineales, n fue 3,52 y beta fue 5,78 segundos.
Utilizando la estimación de máxima verosimilitud, n fue de 3,41 y beta de 6,06 segundos. Este ensayo puede proporcionar evidencia de la presencia de pasos intermedios a lo largo de la vía de escisión. La realización de este ensayo en condiciones de reacción cambiantes puede ayudar a establecer la naturaleza de los intermedios de reacción que no se pueden observar directamente.
