Imágenes in vivo se realizó con el recurso compartido IVIS en la Universidad de Colorado Cancer Center (con el apoyo de subvención P30-CA046934). Citometría de flujo se realizó en la citometría de flujo de recursos compartidos de la Universidad de Colorado Cancer Center (apoyado por P30CA046934 subvención). Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (RO1CA137078 a DKG). ABLS es miembro del Programa de Desarrollo Pediátrico científico, apoyado por becas de la Academia Americana de Pediatría, la Sociedad Americana de Pediatría y el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano (K12-HD000850).

Todos los experimentos con animales siguen las normas reglamentarias aprobadas por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Colorado. El protocolo fue aprobado demostrado por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Colorado. 1. Fosfato proteína Western Blot <ol><li> Preparación de lisados <ol><li> Líneas celulares que expresan la cultura de la tirosina quinasa del receptor de interés. Las células de la cosecha y la placa de 3-5 x 10 6 células / muestra en el medio de cultivo de 400 l en un 48 pocillos placa de cultivo de tejidos. Incubar a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 2-3 h. </li><li> Añadir 100 l de solución de 5x TKI en medio de cultivo y se incuba durante 60 min. </li><li> Preparar tampón de lisis con 50 mM de HEPES (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, 10% (v / v) de glicerol, 1% (v / v) de Triton X-100, y los inhibidores de la proteasa. Si los cultivos no serán tratados con pervanadato antes de la cosecha, añadir inhibidores de la fosfatasa (orthova de sodio 1 mMnadate y 0,1 mM de molibdato de sodio) al tampón de lisis. </li><li> Preparar pervanadato (PV) solución de inhibidor de la fosfatasa inmediatamente antes de su uso. Prepare una solución de 0,3% de peróxido de hidrógeno (PRECAUCIÓN) en frío-buffer fosfato salino (PBS) en un tubo oscuro en el hielo (1:100 dilución de una solución madre al 30%). Hervir una alícuota de 0,2 M ortovanadato de sodio (OV, PRECAUCIÓN) solución madre durante 5 min. Diluir 1:10 en PBS para hacer una solución 20 mM de VO a temperatura ambiente (RT). Mezcle de peróxido de hidrógeno 0,3% y 20 mM de VO 1:01 y se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Diluir PV en medio completo (60 l PV + 940 l medio). Añadir 100 l de diluirse PV / pocillo. Se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 3 minutos y luego coloque la placa sobre hielo. </li><li> Recoger las células en tubos de microcentrífuga fríos a 2.500 rpm durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 120 l de tampón de lisis. Incubar en hielo durante 15 min. Aclarar el lisado en una microfuga en frío a 6000 rpm durante 3 min. Traslado supernatant a un tubo frío fresco. Almacenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> La inmunoprecipitación <ol><li> Decantar proteína G Sepharose bolas en microcentrífuga a 1000 rpm durante 1 min. Aspirar el sobrenadante y lavar los granos 2X con 1 ml de PBS frío. Añadir un volumen igual de PBS para hacer una suspensión al 50%. Añadir anticuerpo primario y 20 l 50% de proteína G bolas a cada muestra. Incubar durante 2 horas - O / N a 4 ° C en un rotador. </li><li> Pulso por bolas en una microcentrífuga frío a 9.000 rpm. Aspirar el sobrenadante y lavar los granos 2X con 150 l de tampón de lisis frío. Gira en microfuga en frío a 1000 rpm durante 1 min. Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 20 l de 2X SDS Sample Buffer con 2-mercaptoetanol (PRECAUCIÓN). Utilizar inmediatamente o almacenar a -80 ° C. </li><li> Muestras Hervir durante 5 minutos y se ejecutan en un gel-tris glicina SDS-PAGE. Transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa y detectar fosfato proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western. </li><li> Enjuague blot con agua y luego incubar en 2% de SDS, 62,5 mM de Tris (pH 6,8), 0.1 M β-mercaptoetanol (PRECAUCIÓN) durante 30 min a 50 ° C. Enjuague 2x con agua y lavar para 60-90 min en 5-6 cambios de TBS-T para eliminar la solución decapante. </li><li> Detectar total de proteínas por Western blot. </li></ol></li></ol> 2. Ensayo Methylcellulose <ol><li> Alícuota de 4 ml de metilcelulosa medio de base humana en 50 ml tubos cónicos con un gran calibre aguja estéril extremo romo. (Nota:. Metilcelulosa puede ser en alícuotas y se almacenó a -20 º C. Descongelar a temperatura ambiente O / N antes de su uso) </li><li> Añadir 500 l de 10x de TKI o vehículo en el medio de crecimiento a 4 ml de metilcelulosa y la mezcla de vórtice durante 10 segundos. </li><li> Cosecha y celdas de conteo. Preparar una suspensión de células en medio de crecimiento en una concentración, que es 10 veces mayor que la concentración final de células. Añadir suspensión de células 500 l a la mezcla de metilcelulosa. Vortex durante 10 segundos y dejar reposar durante 10 minutos para eliminar las burbujas. </li><li> Elaborar 4 ml de mezcla de metilcelulosa con una jeringa de 5 ml y larg estérile parió aguja punta roma. Evite la elaboración de burbujas. Dispensar 1 ml de la mezcla de metilcelulosa en el centro de tres 35 mm placas de cultivo de tejidos. Agitar los platos hasta que el fondo está completamente cubierto con metilcelulosa. </li><li> Para cada placa de metilcelulosa, preparar una placa de cultivo de tejido estéril de 10 cm con dos de 35 mm de tejido placas adicionales cultura llena de agua estéril para asegurar un ambiente húmedo. Culturas Coloque en agua con camisa incubadora a 37 ° C en 5% de CO2 durante 10 a 14 días. </li><li> Recuento de las colonias después de 1-2 semanas. Las colonias deben ser más de 20 células y no se superponen. Las colonias pueden ser contadas usando un microscopio invertido equipado con una platina de microscopio con una rejilla o utilizando un contador automático de colonias. Los cambios en el tamaño de la colonia o la morfología en respuesta al tratamiento con ITC también deben ser evaluados. Para mejorar la detección por el contador de colonias, las colonias de manchas mediante la adición de 60-100 l de (3 - (4,5-Dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro de Sollución (MTT, 5 mg / ml en H2O, se almacena a -20 ° C, proteger de la luz, PRECAUCIÓN) gota a gota sobre la superficie de cada placa e incubar durante 8 horas a 37 ° C en 5% de CO 2. </li></ol> 3. Ensayo en agar blando <ol><li> Preparar 1% de agar noble para la capa inferior, el 0,7% de agar noble de la capa superior y medio de crecimiento de 2x. Equilibre medio de crecimiento de 2x en un 42 ° C baño de agua. Calor 1% y 0,7% de agar noble en un horno de microondas (aproximadamente 1 min/100 ml) y equilibrar en un baño de agua de 42 ° C. Mezcle partes iguales de un 1% de agar y medio 2x y por separado 0,7% de agar y medio 2x en 50 ml cónicas. Plan de 10 ml de la mezcla de la placa de agar blando / seis pocillos para cada capa. </li><li> Etiqueta de 6 placas de cultivo de tejidos. Llene cada pocillo con 1,5 ml de 1% de mezcla de agar blando. Evite burbujas durante la siembra. Placas secas con tapas fuera de campana estéril durante 30 minutos. </li><li> Contar las células. Preparar una suspensión de células en medio de crecimiento en una concentración, que es 500x más alto que el concentrati final de célulasen. Añadir suspensión de células a 0,7% mezcla de agar, mezclar bien y dispensar 1,5 ml de la mezcla de células de agar en la parte superior de la capa de agar 1%. Deje que la capa superior se solidifique durante 30 min. </li><li> Preparar el medio de cultivo que contiene 1x TKI o control del vehículo. Añadir 2 ml de medio con la concentración deseada de TKI en la parte superior de la capa de agar superior. </li><li> Incubar los cultivos durante 10 días a 37 ° C en 5% de CO 2. Retire y sustituya el medio superponiendo cada 3 días. </li><li> Cuando las colonias son visibles a simple vista, medio aspirado de superposición y añadir 200 l de solución de azul nitro-tetrazolio (1 mg / ml de NBT en H 2 O, se almacenan a 4 ° C, proteger de la luz, PRECAUCIÓN). Volver a la incubadora durante 24-48 horas. Mover a 4 ° C durante al menos 2 horas antes del recuento. Placas teñidas pueden almacenarse a 4 ° C durante un mes. Recuento de las colonias utilizando un microscopio o un contador de colonias automático. </li></ol> 4. Evaluación de la inhibición fosfato proteína in vivo <ol><li> Recoger cells crecimiento en fase logarítmica por centrifugación en una centrífuga de mesa a 1.500 rpm durante 5 min. Lavar las células una vez con PBS estéril y resuspender en PBS a una concentración apropiada (típicamente 1-5 x 10 7 células / ml). Trasplante de células en un volumen de 100 l en 6-12 semanas de edad ratones GSN por inyección intravenosa en la vena de la cola usando una jeringa de insulina 28 g. Colocar el animal en una inmovilización, calentar la cola en un vaso de agua tibia para dilatar las venas, y limpie la cola con un hisopo de clorhexidina antes de la inyección. Después de la inyección, aplique presión en el sitio de la inyección con una gasa estéril hasta que el sangrado se detenga. Trasplante de al menos 3 animales / grupo. Mantener los ratones en agua que contiene 1 mg / ml de sulfato de gentamicina. </li><li> Catorce días después del trasplante, el tratamiento de los animales con TKI o sólo vehículo y muestras de la cosecha para el análisis de la inhibición de destino. Pesar animales y tratar con una dosis adecuada (mg / kg de peso corporal) de ITC o vehículo. Administrar el tratamiento en un volumen de 5 ml / kg de peso corporal por vía intraperitoneal (ip) inyección o 10 ml / kg de peso corporal por sonda oral. Para la inyección ip, restringir el ratón de forma manual y se inyecta en el cuadrante inferior derecho del abdomen mediante una aguja de 29. Para una sonda nasogástrica, restringir el ratón manualmente y mantener al animal en posición vertical. Colocar el tubo de sonda en la boca sobre la lengua y en la parte posterior de la boca. Aplique ligera presión para pasar el tubo a través del esófago hasta el estómago. Presione el émbolo de la jeringa para administrar el tratamiento. Si el émbolo no deprime fácilmente la aguja de sonda debe ser retirado y colocado de nuevo. Preparar formulaciones TKI inmediatamente antes de su uso. </li><li> Si se desea el tratamiento con pervanadato, preparar la solución PV 20 min antes de la cosecha como se describió anteriormente (etapa 1.1.4) y se diluye en medio con 1 mM de MgCl 2 y 100 U / ml de DNasa (120 l PV + 880 l de medio). Nota: PV es estable durante al menos 1 hora después de la dilución. </li><li> Sacrificio de animales por el CO 2 narcosis en la aptiempo (s) apropiada post-tratamiento. Diseccionar fémures quitando pieles, piel y músculo de la pierna entera para que los huesos están completamente expuestos. Retire los fémures por el recorte con tijeras de disección justo debajo de la articulación de la cadera y de nuevo por encima de la articulación de la rodilla. Transferencia a una placa de Petri y la médula ósea a ras con 1 ml de PBS frío o solución PV diluido mediante una jeringa y una aguja 27. Si el tratamiento con PV, se incuban a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min. </li><li> Preparar lisados ​​y analizar los niveles de fosfo-proteínas y total de proteínas como se indica anteriormente (pasos 1.1.6-1.2.5). </li><li> Cuantificar relativa fosfato proteína y los niveles totales de proteínas de cada muestra utilizando densitometría. Calcular relativa phospho-protein/total-protein al valor medio phospho-protein/total-protein para los animales tratados con el vehículo. </li></ol> 5. Evaluación de la actividad anti-leucemia de ITC en todos los modelos de xenoinjertos <ol><li> Si es necesario, exponer ratones a 200 cGy de radiación en un irradiador RS-2000 un día PRIOr para trasplante. Los ratones trasplantados con líneas celulares de leucemia, como se describe anteriormente (paso 4.1). Trasplante de al menos 6 ratones por grupo. Identificar ratones mediante punch oreja. Alternativamente, un marcador negro se puede utilizar para identificar los ratones con marcas de control en sus colas. Agregar a enriquecimiento jaulas para reducir el potencial de agresión compañero de jaula durante el estudio. </li><li> Tratar a los ratones con un TKI o el vehículo sólo se ha descrito anteriormente (paso 4.2). Supervisar el estado de salud de los ratones diariamente a través de la exploración física y la determinación del peso. Síntomas esperados de la leucemia (reducido nivel de actividad, pérdida de peso, parálisis de las extremidades posteriores, y las infecciones de los ojos). La pérdida de peso superior al 10% y un 15% por lo general se asocia con la muerte del ratón dentro de dos días, y suele ser un criterio indirecto de la muerte, de acuerdo con los requisitos estándar IACUC. </li><li> Monitorear el injerto y el desarrollo de la leucemia a través de un sistema in vivo imágenes de bioluminiscencia en hasta 2 veces por semana. Preparar una solución madre 200X-D luciferina (30 mg / ml) en Steriagua le. Mezclar suavemente por inversión hasta D-luciferina se haya disuelto completamente. Utilizar inmediatamente o alícuota y congelar a -20 ° C. Antes de la formación de imágenes in vivo usando un sistema de imágenes de bioluminiscencia en, descongelar las partes alícuotas de D-luciferina a TA y se diluye 1:02 en PBS a una concentración final de 15 mg / ml y esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. </li><li> Se anestesia a los ratones antes de formación de imágenes con 1,5% de isoflurano inhalado en oxígeno. Monitorear la anestesia suficiente, que se caracteriza por la relajación muscular, pérdida de movimiento y pérdida de la respuesta a la estimulación del dedo del pie-pinch. </li><li> Inmediatamente antes de formación de imágenes, administrar 150 mg / kg de peso corporal de D-luciferina mediante inyección IP (10 l de 15 mg / ml de luciferina / g de peso corporal). </li><li> Utilice un sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo para capturar 2 serie de imágenes secuenciales con 30, 60 y 90 exposiciones sec y una imagen final con una exposición de 120 seg. Después de las imágenes, vuelva ratones para jaulas y supervisar la recuperación de la anestesia. Dependiendo de laintensidad de bioluminiscencia, tiempos de exposición pueden ser variadas. Tiempos de exposición óptima, deben ser predeterminados para un determinado modelo y de mantener la coherencia de tal manera que las intensidades de señal para los puntos de tiempo individuales son comparables a través de todo el estudio. </li><li> Determinar la intensidad de la bioluminiscencia para cada ratón utilizando viva imagen 3.2 de adquisición y análisis de software. Determinar valores de flujo total medido en fotones / segundo por regiones de interés (ROI) de tamaño idéntico sobre cada ratón dibujo. </li><li> Sacrificio ratones por exposición de CO 2 y dislocación cervical si moribundo, exhibiendo la parálisis, en el caso de la pérdida de peso mayor que 15%, o al final del estudio. Diseccionar ratones y anote observaciones (por ejemplo, la ampliación del bazo, el hígado o los ganglios linfáticos, palidez de la médula ósea). Diseccionar fémures y la médula ósea a nivel con PBS frío utilizando una aguja de 27. </li><li> Recoger las células en una microcentrífuga a 2500 rpm durante 5 min. Resuspender las células en PBS que contenía 2% de FBS y se incuba durante 5 min a TA.Recoger las células y tinción con 20 mg / ml de DAPI (diclorhidrato de 4,6-diamidino-2-fenilindol, 1:1.000) y FITC-conjugado α-hCD45 (1:100) o IgG de ratón anticuerpo de control de isotipo 1 (1:100) . Evaluar el injerto leucemia mediante citometría de flujo. Puerta en la población viable (DAPI negativo) y determinar el porcentaje de células CD45 + (blastos% de médula ósea). </li></ol>

<ol>
	<li>Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics.+2010.">Cancer Statistics. 2010.</a> CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).</li><li>Kaatsch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+childhood+cancer.">Epidemiology of childhood cancer.</a> Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).</li><li>Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia:+where+are+we+going+and+how+do+we+get+there?.">Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?.</a> Blood. 120, 1165-1174 (2012).</li><li>Forman, S., Rowe, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myth+of+the+second+remission+of+acute+leukemia+in+the+adult.">The myth of the second remission of acute leukemia in the adult.</a> Blood. 121, 1077-1082 (2013).</li><li>Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinase+inhibitors+in+acute+and+chronic+leukemias.">Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias.</a> Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).</li><li>Mikalsen, S., Kaalhus, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+pervanadate+and+permolybdate.+Connexin43,+phosphatase+inhibition,+and+thiol+reactivity+as+model+systems.">Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems.</a> J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).</li><li>Zips, D., Thames, H., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+anticancer+agents:+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation.</a> In Vivo. 19, 1-7 (2005).</li><li>Christoph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+leukemia+cell+lines+in+vitro+and+in+mouse+xenografts:+Effects+of+monoclonal+and+polyclonal+cell+populations+on+intensity+and+kinetics+of+photon+emission.">Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission.</a> J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).</li><li>Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+measurements+of+human+tumour+cells+by+soft+agar+assays+are+influenced+by+the+culture+conditions.">Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions.</a> Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).</li><li>Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+soft-agar+methods+for+assaying+chemosensitivity+of+human+tumours+in+vitro:+malignant+melanomas.">Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas.</a> Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).</li><li>Rudin, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+drug+discovery+and+development.">Molecular imaging in drug discovery and development.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).</li><li>Barrett, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescent+imaging+of+primary+patient+acute+lymphoblastic+leukemia:+a+strategy+for+preclinical+modeling.">Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling.</a> Blood. 118, 112-117 (2011).</li><li>Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Este manuscrito describe una estrategia eficaz para la evaluación de inhibidores de tirosina quinasa nuevos en el tratamiento de la leucemia aguda. Usando este enfoque, las actividades bioquímicas y anti-leucemia se evalúan primero en ensayos basados ​​en células in vitro y luego en modelos de xenoinjerto in vivo. El análisis por inmunotransferencia se utilizó con éxito para demostrar la inhibición de la tirosina quinasa diana en células de leucemia después del tratamiento con TKIs y para...

La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es la neoplasia maligna más frecuente en los niños 1,2. La tasa de supervivencia general de los casos de LLA pediátrica de linaje B (B-ALL) es de aproximadamente 85%, pero los subtipos biológicos específicos, entre ellos T-LLA de linaje (LLA-T), que el pronóstico sigue siendo pobre, incluso con protocolos terapéuticos actuales. El tratamiento posterior de la LLA recidivante sigue siendo un desafío 3. Aunque la mayoría de los pacientes adultos con leucemia aguda lograr una remisión con quimioterapia por adelantado, muchos pacientes todavía sufren recaídas 4. Regímenes quimioterapéuticos actuales en el tratamiento de la leucemia aguda son conocidos por causar efectos secundarios a corto y largo plazo de toxicidad asociada. Por lo tanto, las terapias menos tóxicas que atacan específicamente las células cancerosas con un efecto mínimo sobre los tejidos normales son muy necesarios. En los últimos años, se ha puesto énfasis en el desarrollo de la novela, agentes molecularmente orientados con especificidad para las células cancerosas, a menudo utilizando la química iterativapara generar múltiples compuestos activos que luego deben ser comparadas y priorizaron 5. Este manuscrito describe una estrategia eficiente para la evaluación preclínica de ITC para el tratamiento de la leucemia aguda, que puede ser utilizado para la evaluación de un único compuesto o para la comparación directa de múltiples compuestos con el fin de facilitar el desarrollo de fármacos. El método presentado aquí consta de cuatro pasos. En primer lugar la bioquímica (1) y anti-leucemia (2) las actividades de los compuesto (s) se evalúan en cultivo celular, a continuación, la inhibición de la diana se confirma en modelos animales (3), y, finalmente, la eficacia terapéutica de la TKI (s) se determina en modelos de xenoinjerto de leucemia ortotópico (4). Para estos estudios, es importante elegir líneas celulares pertinentes, que son representantes de los subtipos biológicos más comunes. Las líneas celulares se deben seleccionar, que tanto, expresan la diana de interés y carecen de la diana de interés, para investigar si los efectos biológicos están medIATED por la inhibición de la diana. Esto es particularmente relevante para el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas, que tienen fuera de objetivo efectos que pueden ser importantes para la actividad anti-tumoral. También es necesario escoger una línea celular que es dependiente de la diana para los efectos funcionales, tales como la proliferación o la supervivencia. Estudios de validación de destino preliminares (fuera del alcance de este artículo) utilizando la interferencia de ARN u otros medios específicos para inhibir el objetivo se pueden utilizar para identificar líneas de células dependiente de la diana. También es deseable elegir líneas celulares que pueden formar xenoinjertos murinos, de tal manera que los resultados del cultivo celular puede ser más directamente traducido a experimentos in vivo. Para la evaluación de la actividad bioquímica mediada por TKIs en células de leucemia, una disminución en la fosforilación del receptor se puede utilizar como un indicador de inhibición de destino. Ensayos de análisis de transferencia de Western o ELISA se pueden emplear, dependiendo de la disponibilidad y la especificidad de los anticuerpos.Si los anticuerpos con especificidad suficiente para el objetivo están disponibles, ensayos de ELISA son preferibles ya que son más cuantitativa y eficiente. En los casos en que los anticuerpos con especificidad suficiente para ELISA no están disponibles, el análisis de transferencia Western puede ser necesario. En este caso, la inmunoprecipitación de una gran cantidad de lisado puede ser útil para la detección de objetivos que están en baja abundancia. Este enfoque es particularmente relevante para la medición de fosfo-proteínas, que pueden tener una vida media corta para permitir cambios rápidos en la señalización en respuesta a los estímulos ambientales. Algunas proteínas fosforiladas son extremadamente lábil, muy probablemente como resultado de la formación de complejos con fosfatasas. Para la detección robusto y consistente de estas proteínas fosforiladas, también puede ser posible para el tratamiento de las células con pervanadato, un inhibidor de la fosfatasa de la proteína tirosina irreversibles 6, para estabilizar el fosfato proteína antes de la preparación de lisados ​​de células enteras. Adeterminar si la actividad bioquímica resulta en efectos anti-tumorales, procesos biológicos dependiente de la diana se pueden monitorizar en experimentos basados ​​en células. Para las líneas celulares de leucemia, actividad anti-leucemia mediada por TKIs se puede evaluar usando ensayos de formación de colonias realizadas en metilcelulosa o agar blando 7. Agar blando puede ser preferible, ya que es un medio sólido que es más susceptible a la manipulación, si es necesario un tratamiento repetido con un TKI. Mientras que muchas líneas celulares de leucemia aguda myloid (LMA) formarán colonias en agar blando, la mayoría de todas las líneas celulares solo se forman colonias en metilcelulosa, que es un medio semi-sólido. Aunque es posible para refrescar medio y / o TKIs en cultivos de metilcelulosa, sólo pequeños volúmenes se pueden utilizar y con frecuencia limitada. Del mismo modo, es más difícil para teñir colonias sin interrumpir en metilcelulosa. Los estudios preliminares deben definir la capacidad de líneas de células apropiadas para formar colonias en metilcelulosa y / o agar blando y Tque la densidad óptima de células en cultivo tales que las colonias no se solapan y en número suficiente para obtener datos estadísticamente relevantes (normalmente 50-200 colonias por placa de 35 mm). Mientras que los ensayos in vitro son robustos y rentables, y tienen menos consecuencias éticas que los experimentos con animales enteros, el avance de los compuestos terapéuticos requiere prueba de eficacia y seguridad en modelos animales. Para los estudios in vivo, las líneas celulares de leucemia aguda humanos pueden ser trasplantadas en ortotópicamente NOD.Cg-Prkdc SCID I l2rg tm1Wjl / SZJ (GSN) ratones y TKIs se pueden administrar fácilmente por inyección o una sonda nasogástrica. Algunas líneas celulares pueden requerir la exposición de ratones sin garantía soberana a una dosis baja de línea celular dependiente de la radiación con el fin de xenoinjertos de establecer, y en este caso los ratones no pueden tolerar la alimentación oral forzada sin un período de recuperación de 5 a 10 días después de la irradiación. Este manuscrito describe la generación de B-ALL y T-ALL xenoinjertos utilizandolíneas celulares específicos (697 y Jurkat) como ejemplos, pero pueden establecerse xenoinjertos en ratones GSN utilizando una amplia variedad de líneas celulares. En el caso de que otras líneas celulares son más aplicables, el requisito para la irradiación, el número óptimo de células a trasplante, y el momento de aparición de la enfermedad y la progresión se debe determinar experimentalmente. Idealmente, estos modelos tendrán penetrancia completa (cada animal trasplantado desarrolla la leucemia), la cinética consistentes (leucemia progresa de manera similar en todos los animales), y una ventana de tratamiento razonable (idealmente 20-30 días entre el inicio del tratamiento y la eliminación del estudio debido a la enfermedad) . El número de células trasplantadas se puede aumentar para mejorar la penetración y la consistencia cinética o disminuye para mejorar la ventana de tratamiento si es necesario. Para determinar si TKIs median la inhibición diana in vivo, las muestras se obtuvieron de ratones con xenoinjertos de leucemia después del tratamiento con ITC o sólo vehículo. Idealmente, la una dosisd programa de administración para estos experimentos se guían por los estudios farmacocinéticos, que a menudo pueden ser realizados por laboratorios comerciales y están fuera del alcance de este artículo. Si se dispone de datos farmacocinéticos, la concentración de compuesto requerida para la inhibición eficaz objetivo en cultivo de células y la concentración máxima en suero después de una única dosis de TKI se puede utilizar para definir una dosis de partida para los estudios en animales. Los estudios farmacocinéticos también pueden informar al momento de la recolección de la muestra después del tratamiento para los estudios farmacodinámicos y la vía de administración. La inhibición de la diana puede evaluarse en cualquier órgano afectado, pero los tejidos que se recolectan y procesan con mayor facilidad son preferibles. Líneas celulares de leucemia más agudos establecen en el hígado, médula ósea, bazo, sangre periférica, y el sistema nervioso central, aunque los órganos específicos afectados y el grado de injerto en estos órganos varía entre modelos. El protocolo presentado aquí evalúa fosfinhibición o-proteína en la médula ósea utilizando análisis de transferencia de Western, pero órganos sólidos pueden ser más fáciles de cosechar constantemente y requieren un procesamiento mínimo o nada de antes de la congelación, lo que permite menos oportunidad para la degradación de fosfo-proteínas durante la recogida y procesamiento de la muestra. La inmunohistoquímica también se puede utilizar para evaluar tumores sólidos o órganos afectados por la leucemia. Finalmente, la eficacia terapéutica de la TKI (s) se determina en modelos de xenoinjerto de leucemia ortotópico. Para estos estudios, el momento de inicio del tratamiento puede variar, de modo que la enfermedad está más o menos establecido. El tratamiento puede comenzar inmediatamente después del trasplante para los estudios iniciales y luego se retrasó en estudios posteriores hasta que se detecta la carga de morbilidad significativa para aproximarse más a un modelo de tratamiento de diagnóstico. Idealmente, estos modelos animales también tienen la capacidad para la medición no invasiva de la carga de morbilidad. Hemos optimizado los métodos de introducción de la lucifer luciérnagaASE gen en líneas celulares de leucemia utilizando partículas similares a virus, lo que permite el análisis no invasivo, longitudinal de inicio de la enfermedad y la progresión y la evaluación de la carga de la enfermedad en la médula ósea y los órganos sólidos. Fundamental para este enfoque es el uso de líneas celulares de luciferasa-etiquetados monoclonales para evitar la variabilidad en el desarrollo de la leucemia que expresan luciferasa asociado con el uso de líneas celulares policlonales y no está relacionado con el tratamiento con un TKI 8. Tomados en conjunto, estos pasos se pueden utilizar para la evaluación de una sola TKI o para la comparación directa y la clasificación de múltiples TKIs. Mientras que los protocolos presentados aquí se centran en el desarrollo de TKIs, estos métodos se pueden adaptar a otros objetivos y consideraciones para el desarrollo del ensayo se describen. Por lo tanto, esta estrategia puede ser más ampliamente aplicable a la evaluación pre-clínica de agentes dirigidos molecularmente para el tratamiento de la leucemia aguda.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:167px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:233px;">#02194057</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS07, H302-H318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#S6508</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302+ H312+H332 </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:443px;">2-Mercaptoethanol </td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M7522</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ColonyGel Human Base Medium </td>
			<td style="width:167px;">ReachBio</td>
			<td style="width:233px;">#1101</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M5655</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Difco Noble Agar </td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:233px;">#214883</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrotetrazolium Blue Chloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#N6639</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">D-Luciferin Firefly, Potassium Salt</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#122796</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">4&#39;,6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D9542</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC CD45 </td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#347463</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC Mouse IgG1 Isotype control</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#51-35404X-2</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sparhawk</td>
			<td style="width:233px;">#NDC58005-633-04</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitors </td>
			<td style="width:167px;">Roche </td>
			<td style="width:233px;">#11836153001</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D4263 </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protein G Beads</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:233px;">#10-1242</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Isofluran</td>
			<td style="width:167px;">VETONE</td>
			<td style="width:233px;">#NDC13985-030-60</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 35 mm &#215; H 10 mm</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D7804-500EA</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm </td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D8429-1CS</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6-well plates</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#353046</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">14 gauge x 4 inch blunt-end needles</td>
			<td style="width:167px;">Cadence science</td>
			<td style="width:233px;">#7956</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">5 ml syringe with luer-lok</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309646</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">GelCount automated colony counter</td>
			<td style="width:167px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">In vivo bioluminescence imaging system</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#IVIS200</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scout pro portable balances, scale</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:233px;">#SP202</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:443px;">Broome style rodent restrainer</td>
			<td style="width:167px;">Plas-labs</td>
			<td style="width:233px;">#551-BSRR</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ear punch, punch diameter: 2 mm</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#24210-02</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Chlorhexidine swabs, Prevantics</td>
			<td style="width:167px;">PDI</td>
			<td style="width:233px;">#B10800</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Monoject </td>
			<td style="width:233px;">#8881500042</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile</td>
			<td style="width:167px;">Instech</td>
			<td style="width:233px;">#FTP-20-38</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">1 mL Luer-Lok disposable syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309628</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x &#189;, permanently attached needle</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#329465</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine bonn scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#14084-08</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Student fine scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#91460-11</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Moria ultra fine forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11370-40</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine graefe forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11150-10</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10003-12</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10011-00</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia

Los receptores de tirosina quinasas han sido implicados en el desarrollo y progresión de muchos tipos de cáncer, incluyendo tanto la leucemia y tumores sólidos, y son dianas terapéuticas druggable atractivos. Aquí se describe una estrategia de cuatro pasos eficiente para la evaluación pre-clínica de los inhibidores de tirosina quinasa (TKIs) en el tratamiento de la leucemia aguda. Inicialmente, el análisis de transferencia Western se usa para confirmar la inhibición de destino en células de leucemia cultivadas. La actividad funcional se evaluó después usando ensayos clonogénicos en metilcelulosa o cultivos de agar blando. Compuestos experimentales que demuestran la actividad en ensayos de cultivo de células se evaluaron in vivo utilizando ratones NOD-SCID-gamma (GSN) los ratones trasplantados ortotópicamente con líneas celulares de leucemia humana. In vivo estudios farmacodinámicos iniciales evaluar la inhibición de destino en blastos leucémicos aisladas de la médula ósea. Este enfoque se utiliza para determinar la dosis y pauta de administración requerida para la inhibición eficaz objetivode iones. Estudios posteriores Evaluar la eficacia de la TKIs en vivo utilizando luciferasa que expresan las células de leucemia, permitiendo de este modo para la supervisión bioluminiscente no invasiva de la carga de la leucemia y la evaluación de la respuesta terapéutica in vivo usando un sistema de imágenes de bioluminiscencia en. Esta estrategia ha sido eficaz para la evaluación de TKIs in vitro e in vivo y puede ser aplicado para la identificación de agentes dirigidos molecularmente con potencial terapéutico o para la comparación directa y la priorización de múltiples compuestos.

Los ensayos presentados aquí evaluar los efectos bioquímicos y funcionales mediados por TKIs y se pueden utilizar para clasificar nuevos compuestos basados ​​en el grado de inhibición de la diana in vitro e in vivo, la reducción de la formación de colonias, y el retraso en la leucemia en ratones trasplantados con GSN luciferasa- etiquetados células de leucemia. Se utilizó análisis por inmunotransferencia para determinar la inhibición de la forma fosforilada act...

Watch this Scientific Journal Video about Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia at JoVE.com

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Los receptores tirosina quinasas se expresan ectópica en muchos tipos de cáncer y han sido identificados como dianas terapéuticas en leucemia aguda. Este manuscrito describe una estrategia eficiente para la evaluación pre-clínica de inhibidores de tirosina quinasa para el tratamiento de la leucemia aguda.

Evaluación previa a la clínica de inhibidores de tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

pre-clinical-evaluation-tyrosine-kinase-inhibitors-for-treatment

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

18.0K vistas.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Los receptores tirosina quinasas se expresan ectópica en muchos tipos de cáncer y han sido identificados como dianas terapéuticas en leucemia aguda. Este manuscrito describe una estrategia eficiente para la evaluación pre-clínica de inhibidores de tirosina quinasa para el tratamiento de la leucemia aguda. 

Video: Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

El uso de la fMRI farmacológico-reto en la investigación preclínica: la aplicación al sistema de 5-HT

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

Investigación

Medicina

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Un modelo de tumor vesical ortotópica y la Evaluación de tratamiento intravesical SARNA

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

Análisis Cuantitativo multiespectrales después de un trasplante de tejido fluorescente para la visualización de los Orígenes celulares, tipos y Interacciones

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Manejo de la rata del algodón en Estudios para la evaluación preclínica de virus oncolíticos

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Preclínica modelo murino ortotópico de cáncer de próstata humano

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers utilize a syringe pump to directly administer volatile anesthetics into a gas stream. Unlike a traditional vaporizer, it can be used at very low flow rates, making it ideal for use on mice and rats. 
The equipment's capability to use low flow rates could result in a substantial cost savings due to the reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal scavenging filters1. A lower flow rate means less waste of anesthetic gas and likely reduces the risk of anesthetic exposure to laboratory personnel. Thus, the high levels of precision and safety associated with direct injection vaporizers, along with a reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal filters are beneficial for research requiring small animal anesthesia. 
The goal of this protocol is to demonstrate the use of a syringe-driven direct injection vaporizer as part of a digital, low-flow anesthesia system. The direct injection vaporizer is capable of accurately delivering anesthesia at very low flow rates compared to a traditional vaporizer, making it a promising alternative for controlled gas anesthetic delivery to rodents.

Here, we present a protocol to more safely and efficiently administer anesthetic gas to mice using a digital, low flow anesthesia system utilizing a syringe-driven direct injection vaporizer.

El uso de un sistema de bajo flujo Anestesia digital para ratones y ratas

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Un modelo agudo de retina para evaluar sanguíneos de la retina barrera violación, así como potenciales fármacos para el tratamiento

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart failure. Multiple small-animal models of heart transplantation have been used to study the acute and long-term effects of novel therapies. However, few are tested and demonstrated success in clinical trials. It is of critical importance to evaluate new therapies in a clinically relevant large-animal model for efficient and reliable translation of basic studies&#39;&#160;findings. Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and previously used to investigate novel cardioprotective strategies. This procedure focuses on acute ischemia-reperfusion injury and is a reliable method to investigate novel interventions which have been tested and validated in smaller experimental models, such as the murine model. We demonstrate its usefulness in assessing cardiac performance during the early post-transplantation period and other potential possibilities enabled by the model.

Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and utilized to investigate novel cardioprotective strategies.

Un modelo preclínico porcino de trasplante ortotópico de corazón

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

Modelo preclínico de donación cardíaca después de la muerte circulatoria

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

Evaluación hemodinámica invasiva para el sistema ventricular derecho y hipertensión arterial pulmonar inducida por hipoxia en ratones

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...