El objetivo general del siguiente video es demostrar el uso de la biblioteca epigenética de shRNA agrupada para realizar una selección negativa. Este cribado permite identificar dianas epigenéticas específicas a través de la secuenciación. Este procedimiento podría ayudar a identificar los factores epigenéticos responsables de mediar la resistencia adquirida a la citarabina en la LMA Los pasos son los siguientes.
Selección del promotor más potente para obtener la expresión persistente y prolongada de los shRNAs. El protocolo actual se centra en el cribado de ARNi utilizando la biblioteca de SHRNA del factor epigenético en la línea celular MV4-11 resistente a la citarabina. Los promotores utilizados para este propósito son EF-1 alfa humano, CMV humano y SFFV, promotores que expresan la proteína de fluorescencia verde.
Tome el recuento de celdas utilizando el método de exclusión azul tripano. Suspender las células en medio 10%RPMI que contenga 8 microgramos por ml de polibreno. Sembrar 1 millón de células en 1,5 ml de medio por pocillo de una placa de seis pocillos en triplicados.
Agregue diferentes volúmenes de lentivirus concentrados. Por ejemplo, los lentivirus, por ejemplo, de 10, 20 y 40 microlitros, dependiendo del título de los lentivirus a cada pozo. Agite suavemente la placa para mezclar el contenido.
Realizar la espinfección por centrifugación a 920 g a 37 grados centígrados durante 90 minutos. Incuba inmediatamente las placas en una incubadora de dióxido de carbono. Observe el GFP al final de 48 horas y cuantifique el mismo al final de 72 horas.
A continuación, siga los pasos que se muestran en el diagrama de flujo para elegir el promotor que muestre una expresión GFP coherente en toda la cultura. Preparación de la biblioteca de shRNA del factor epigenético humano lentiviral agrupado. Cultivo de células 293T a un número de paso bajo con una buena tasa de proliferación en tres placas de cultivo celular de 10 centímetros con 8ml de medio 10% DMFM en cada placa.
Una vez que las células alcancen el 60% de confluencia, reemplácelas por medio fresco por completo. Prepare la mezcla de transfección como se describe que contiene medio libre de suero, plásmido de empaque lentiviral PAX2, plásmido de envoltura pMD2. G, plásmidos de biblioteca agrupados y, finalmente, el reactivo de transfección.
Toca la mezcla para mezclarla bien e incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. Agregue la mezcla de transfección a las células 293T y mezcle suavemente girando las placas. Incubar las placas en una incubadora de dióxido de carbono.
Cambie el medio después de 24 horas. Después de 48 horas, verifique la expresión de GFP bajo un microscopio de fluorescencia para garantizar una alta eficiencia de transfección en células 293T. Recolecte los sobrenadantes del virus después de 48, 60 y 72 horas y guárdelos a 4 grados, y agregue un medio fresco, 8 ml, en cada punto de tiempo después de recolectar el virus.
Filtre los virus agrupados con un filtro de 0,4 micras. Para obtener un título alto de virus, concentre los virus agrupados por ultracentrifugación. Transfiera los sobrenadantes de virus filtrados a 70 tubos de Ti y centrífuga a 18, 000 g durante 2 horas.
Use rotor y centrífuga preenfriados a 4 grados. Saque los tubos de la centrífuga con cuidado y retire el sobrenadante por completo. Resusped el pellet suavemente en 400 microlitros de DMEM sin FBS y antibióticos usando una micropipeta, incubar en hielo durante 1 hora.
Alícuota los virus y congela a menos 80 grados. Calcule la concentración del virus como se muestra. Estimación de la eficiencia de transducción de lentivirus.
Transducir células 293T con un virus concentrado en diferentes volúmenes, 2, 4 y 8, para confirmar la preparación exitosa del lentivirus. Valor del virus concentrado a 100X para realizar un experimento de titulación en la línea celular objetivo. Sembrar 1 millón de líneas celulares objetivo en 1,5 ml de medio 10%RPMI que contiene 8 microgramos por ml de polibreno en un pocillo de una placa de seis pocillos.
Agregue cuatro volúmenes diferentes, 1, 1.5, 2, 2.5 microlitros de virus 100X. Realizar la espinfección por centrifugación de la placa a 920 g durante 90 minutos a 37 grados centígrados. Después de 72 horas, mida el porcentaje de células GFP positivas por citometría de flujo.
Determinar el volumen de los virus para obtener una eficiencia de transducción del 30%. Esta baja eficiencia de transducción es para garantizar la integración de shRNA único por célula. Transducción de la biblioteca epigenética agrupada de SHRNA en la línea celular resistente a los medicamentos.
Calcule el número de células que se tomarán para el experimento como se indica a continuación en función del número de integrantes virales. Resuspendir 11 millones de células en 16 ML de medio 10%RPMI. Agregue polibreno, ocho microgramos por ml y mezcle bien, y luego agregue el volumen requerido de virus para obtener una eficiencia de transducción del 30% como se calculó anteriormente.
Sembra todas las células en una placa de seis pocillos a una densidad de 1 millón de células por 1,5 ml por pocillo. Centrifugar la placa durante 90 minutos a 920 g a 37 grados centígrados. Incubar la placa durante la noche en una incubadora de dióxido de carbono.
Después de 24 horas, cambie el medio y transfiera las células transducidas a un matraz T-75. Después de 48 horas, verifique la GFP bajo un microscopio de fluorescencia para garantizar una transducción exitosa. Después de 72 horas, cuantifique la GFP mediante citometría de flujo.
Enriquecimiento de las células GFP positivas. Expanda las células transducidas cultivándolas a una densidad de 0,5 millones por ml durante 5 a 7 días, y realice la clasificación de flujo con el ajuste de clasificación de flujo establecido como de alta pureza y bajo rendimiento. Cultive las células clasificadas en un medio 10%RPMI.
Después de 72 horas, realice la estimación posterior a la clasificación del porcentaje de células GFP positivas para garantizar una eficiencia de clasificación de más del 95%. Detección de abandonos para identificar los factores epigenéticos que median la resistencia a los medicamentos. Cultive las células transducidas por la biblioteca de shRNA en 10%RPMI durante un máximo de 5 días.
Centrifugar 10 millones de células por duplicado. Deseche el sobrenadante y almacene los gránulos a menos 80 grados. Estas muestras servirán como referencia de referencia para la biblioteca epigenética de SHRNA.
Cultive las células transducidas restantes como duplicados, R1 y R2, cada uno mantenido en un recuento de células que proporciona una representación 500X de la biblioteca. Trate uno de los duplicados con el medicamento, 10 citarabina micromolar, y el otro sin el tratamiento farmacológico. Cambie el medio para los matraces con y sin el medicamento cada 72 horas.
Repita el cambio de medio tres veces para una exposición acumulativa al medicamento de 9 días. Después del 9º día de tratamiento farmacológico, verifique la viabilidad de las células mediante el método de exclusión de azul tripano. Girar hacia abajo las células viables restantes, lavar con PBS estéril y centrifugar a 280 g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Deseche el sobrenadante y almacene los gránulos a menos 80 para la extracción de ADN. Amplificación de los shRNAs integrados por PCR. Extraer adn de las células basales transducidas, células tratadas y no tratadas, seguido de verificar la concentración con fluorómetro, calcular la cantidad de ADN requerida como se muestra y someter las muestras a la primera ronda de PCR.
La mezcla de reacción de PCR se representa en la tabla 2 con las condiciones del termociclador. Configure múltiples reacciones que contengan 850 nanogramos de ADN por tubo para un total de 43 reacciones. Agrupa los productos de PCR y depuralos.
Eluya los productos en un búfer de 50 microlitros y cuantifiquelos, y finalmente, guárdelos a menos 20. Para la PCR de segunda ronda, utilice cebadores de índice inverso y los reactivos se tabulan en la tabla 4. Configure cuatro reacciones con 500 nanogramos del producto primario de PCR en un volumen total de reacción de 50 microlitros para cada muestra junto con el control negativo.
Cargue todo el producto para electroforesis utilizando gel de agarosa 2% TBE y confirme el tamaño de la banda con una escalera de moléculas KB. Visualice los productos de PCR en el sistema de documentación del gel. Elimine la banda específica y purifique con un kit de purificación en gel.
Los cálculos para la purificación con el kit se proporcionan en la tabla 3. Elute en un volumen final de 30 microlitros de tampón de elución con la concentración aproximada de cada eluyente alrededor de 80 a 90 nanogramos por microlitro. Secuenciación de próxima generación y análisis de datos.
Los productos purificados en gel se someten a secuenciación de próxima generación para obtener recuentos de lectura para las necesidades de shRNA agotadas. Recorte las secuencias del adaptador, alinee las lecturas filtradas con las secuencias de referencia, cargue los archivos utilizando SAMtools para obtener un resumen de alineación. Cargue los archivos fastQ recortados en CRISPRCloud2 y realice el análisis según las instrucciones.
Haga clic en el enlace proporcionado para el CRISPRCloud2. Seleccione el tipo de pantalla como pantallas supervivencia y abandono. Establezca el número de grupos y escriba el nombre de cada grupo.
Cargue la biblioteca de referencia como formato de archivo FASTA. Los datos cargados se procesan y los resultados están disponibles en la URL dada. Datos representativos.
Esta figura muestra células parentales y resistentes MV4-11 tratadas con concentración creciente de citarabina, 0,1 micromolares a 1.000 micromolares y evaluación de viabilidad mediante ensayo MTT. Esta figura muestra diagramas de flujo representativos de la GFP cuantificadas por citometría de flujo al final de 72 horas para los promotores humanos EF-1 alfa, CMV humano y SFFV. El CMV humano muestra nuestro pico heterogéneo, mientras que el EF-1 alfa y el SFFV humanos muestran un único pico homogéneo.
Esta figura muestra el gráfico de barras para las tres eficiencias de promotor diferentes en MV4-11. La GFP impulsada por SFFV mostró silenciamiento de la GFP en cultivo prolongado. Las células GFP impulsadas por hEF-1 alfa mostraron una expresión sostenida después de la clasificación de estas células.
El panel izquierdo muestra la eficiencia de transfección de la biblioteca de shRNA agrupada transfectada en 293T al final de 48 horas bajo microscopía de fluorescencia. El panel derecho muestra la eficiencia de transducción del virus de la piscina en células 293T con volúmenes de virus variables, 2, 4 y 8 microlitros. Esta cifra representa la eficiencia de transducción en líneas celulares resistentes a MV4-11 con volúmenes variables de virus, como 1, 1.5, 2, 2.5 microlitros para lograr una eficiencia de transducción del 30%.
Esta figura muestra la clasificación de las células positivas GFP con una eficiencia de transducción del 30% con alta pureza y un ajuste de clasificación de bajo rendimiento. La figura muestra una ilustración esquemática del tratamiento farmacológico para las células clasificadas GFP positivas para una exposición prolongada a citarabina de 9 días, seguida de la verificación de la viabilidad y la recolección de las células para el ADN. Esta figura muestra las regiones de unión del cebador utilizado en la primera y segunda ronda de PCR.
Esta figura ilustra el tamaño de la banda del producto de PCR al final de la primera ronda de PCR, el par de bases 397 y el segundo par de bases del producto de PCR 399, que fue eluido en gel, purificado y dado para NGS. Esta figura ilustra la representación de los shRNAs enriquecidos o agotados dirigidos a los factores epigenéticos que podrían mediar la resistencia a la citarabina en la LMA. Conclusión. Este protocolo destaca la importancia de la detección de derribo dirigida para interrogar sistemáticamente genes esenciales y no esenciales y demuestra el uso de este enfoque como una plataforma funcional, que permite la identificación de objetivos responsables de la resistencia a los medicamentos.
