Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre perturbaciones en las redes de señalización que pueden causar el crecimiento del cáncer o el desarrollo de resistencia a terapias específicas. La principal ventaja de esta técnica es que puede proporcionar retroalimentación rápida y confiable sobre el estado de fosforilación de múltiples redes que con frecuencia se desregulan en el cáncer. La implicación de esta técnica se extiende hacia la terapia de cánceres farmacorresistentes porque la identificación de alteraciones y modificaciones post-traduccionales puede dilucidar cambios en la actividad de la vía de transducción de señales.
Mientras que esta técnica se utiliza en la fosforilación, también se puede utilizar para mirar otras modificaciones post-traduccionales como la glicosilación y la ubiculación. Comience por enjuagar completamente las células cultivadas durante la noche tres veces con 10 mililitros de PBS teniendo cuidado de eliminar todo el PBS después del último lavado. A continuación, agregue el volumen adecuado de tampón de lelisis del kit de ensayo de proteínas y utilice un rascador celular para separar las células.
Triturar la solución celular resultante aproximadamente 10 veces antes de transferir al menos una vez 10 a las células séptimas a un tubo de 1,5 mililitros. Incubar las células durante 30 minutos a cuatro grados centígrados con temblores. A continuación, cargue el izado en una jeringa equipada con una aguja de calibre 27 y aspire y dispense la muestra 10 veces para cortar las membranas celulares.
Cuando las membranas celulares se hayan interrumpido por completo, centrifuga el analizado y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros para la posterior cuantificación total de proteínas de acuerdo con los protocolos estándar. Para realizar un ensayo de fosfoquinasa humana, primero utilice pinzas de punta plana para colocar una membrana de matriz en cada pozo de una bandeja múltiple de cuatro pozos que contenga dos mililitros de tampón de matriz recién preparado uno por pozo con el número de membranas hacia arriba. Tras la inmersión, el tinte de la membrana desaparecerá.
Cubra la bandeja con una tapa e incubar las membranas en una coctelera de plataforma mecedora durante 60 minutos a temperatura ambiente. Durante esta incubación de bloqueo, diluir cada muestra de alsate a 50 a 100 microgramos de concentración de proteínas en un volumen máximo de 334 microlitros de tampón de lysis y llevar el volumen final de la muestra de proteína extraída hasta 1,5 mililitros con tampón de matriz fresca. A continuación, aspirar cuidadosamente el tampón de la matriz de cada pozo de la bandeja múltiple e incubar las membranas con 1,5 mililitros de muestra de proteína por pozo durante la noche a dos a ocho grados centígrados en una coctelera de plataforma mecedora.
A la mañana siguiente, transfiera cuidadosamente cada matriz a recipientes de plástico individuales que contengan 20 mililitros de tampón de lavado para tres lavados de 10 minutos en una plataforma de balanceo a temperatura ambiente. Después del último lavado, agregue 20 microlitros del cóctel de anticuerpos reconstituyos apropiados a dos mililitros de tampón de matriz, dos por pozo, y borre cuidadosamente el borde inferior de cada membrana en una toalla de papel para eliminar cualquier exceso de tampón de lavado. A continuación, vuelva a colocar cada matriz en el pozo adecuado de la bandeja de anticuerpos y cubra la bandeja para una incubación de dos horas a temperatura ambiente en una plataforma de balanceo.
Al final de la incubación, transfiera cuidadosamente cada matriz a un nuevo recipiente de plástico de ocho por 11 centímetros que contenga 20 mililitros de tampón de lavado para tres lavados de 10 minutos como se acaba de demostrar. Después del último lavado, añadir un mililitro de una solución de rábano de rábano de caballo estreptavidina adecuada a cada pocódromo de la bandeja multi-po y devolver las membranas a sus pomos apropiados para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, coloque cada membrana entre dos trozos de papel de filtro de cinco milímetros para eliminar cualquier exceso de tampón e incubar las membranas secas con una solución adecuada de detección de rábano de caballo peroxidasa durante tres minutos.
A continuación, coloque las membranas en protectores de láminas de plástico transparente individuales para obtener imágenes posteriores. Para evaluar la expresión de tirosina quinasa del receptor en cada muestra, abra las imágenes en un programa de procesamiento de imágenes adecuado como Imagen J y seleccione Editar e Invertir en los menús desplegables adecuados para invertir las manchas negras en el fondo blanco de la imagen en puntos blancos sobre un fondo negro. A continuación, utilice la herramienta Oval para rodear un par de puntos blancos en la mancha de puntos y seleccione Analizar y medir para abrir automáticamente una nueva ventana que muestre los valores del área seleccionada.
A continuación, coloque el punto de la flecha del ratón en el centro del óvalo y arrastre el área circular alrededor del siguiente área de puntos hasta que se hayan medido todos los puntos de interés. En este experimento representativo, los efectos de la resistencia a los inhibidores de la tirosina quinasa en las vías de transducción de señal se analizaron en un control en tres líneas celulares resistentes a inhibidores de la tirosina quinasa. Se eligieron seis proteínas fosfo con actividad diferencial y se determinó la intensidad relativa para varias proteínas candidatas en cada línea celular.
Como lo demuestra el mapa de calor, podría generarse una lectura semicuantitativa sobre los cambios en la fosforilación proteica de proteínas de transducción de señales importantes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar con células sanas y que dividen activamente, ya que los factores estresantes pueden inducir cambios en la actividad de la vía de transducción de la señal. Siguiendo este procedimiento, otros métodos como la PCR digital y el inmunoblotting se pueden utilizar para responder a preguntas adicionales tales como cambios en la fosforilación conducen a la activación de factores de transcripción?
Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores de la biología del cáncer exploren los cambios fundamentales en la modificación post-traduccional de proteínas que conducen a la llegada de la medicina personalizada para pacientes con cáncer. No olvide que trabajar con líneas celulares de cáncer es extremadamente peligroso, así que asegúrese de usar técnicas asépticas, precaución al desechar objetos punzantes y usar una bata de laboratorio en todo momento.
