LPE es un escocés Clinical Fellow Senior y agradece el apoyo de la Oficina de Jefe Científico (SCD/03). Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust del Proyecto Grant LPE (089.930). NARG fue financiado por el Wellcome Trust un programa de subvención (080.088) y una Beca de equipos (075.470) (para DeltaVision), y por una subvención del 7 º PM-2007-2013 (SALUD-F2-2010 a 260,338-ALLFUN). Nos gustaría dar las gracias a la Universidad de Aberdeen instalación de imágenes, en particular, Kevin MacKenzie, de apoyo y útiles consejos.

1. C. albicans Crecimiento y Condiciones <ol><li> Preparar SC-ura placas de agar mediante la adición de 6,9 g de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 1 ml de NaOH 1 M, 10 ml 1% (w / v) de sal hemisulfato de adenina y 20 g de agar técnica (descrito anteriormente en detalle en 11). Constituyen el volumen a 900 ml con agua destilada H 2 O. Autoclave, agar permitir que se enfríe, pero no lo suficiente para solidificarse y, a continuación añadir 50 ml estéril 40% de D-glucosa y 50 ml estéril 4% de deserción SC-Ura en condiciones asépticas. Mezclar, verter en placas de Petri y dejar las placas de agar se enfríe y solidifique. Placas Tienda de agar a 5 ° C hasta su uso. </li><li> Streak C. albicans serotipo A, cepa CAI4 + CIp10 de stocks de glicerol almacenada a -80 º C en placa de agar SC-ura. </li><li> Incubar la placa a 30 ° C hasta que se forman colonias y se almacena a 5 ° C. </li><li> Cultura una sola C. albicans colonia en 5 ml SC-Ura medio (receta como en 1.1, pero sin agar técnico) e incubar durante la noche a 30° C, 200 rpm para generar la fase estacionaria C. albicans. </li></ol> 2. C. albicans tinción utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC) <ol><li> Añadir 10 l C. cultura albicans durante la noche a 990 l de PBS (pH 7,4) y realizar un recuento de células usando un hemocitómetro. </li><li> Para ayudar a la visualización de C. albicans durante ensayos de fagocitosis, mancha 1 × 10 8 C. albicans utilizando 1 mg / ml de FITC en 0,05 M tampón carbonato-bicarbonato (pH 9,6) durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Para quitar FITC unida, lavar C. albicans en 1 ml de PBS 1 X, se centrifuga a 3.000 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de PBS 1 x. Repita 3 veces. </li><li> Resuspender el sedimento en el 1 × 10 6 células / l en 1 x PBS. </li></ol> 3. Preparación de la línea celular de macrófago de ratón J774.1 <ol><li> Mantener J774.1 macrófagos en 75 cm 2 de tejidomatraces de cultivo en medio DMEM suplementado con 10% (v / v) de suero fetal de ternera (FCS), 200 U / ml de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina, a 37 ° C con 5% de CO 2. La preparación de los macrófagos primarios se describe en detalle en otra 12, 13. </li><li> Raspar J774.1 células del matraz de cultivo de tejidos y transferir a un tubo Falcon de 50 ml. Centrifugar a 600 xg durante 5 minutos para obtener un sedimento celular. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml pre-calentado medio suplementado DMEM. Contar las células usando un hemocitómetro y la placa de 1 × 10 6 J774.1 macrófagos en 2 ml de medio suplementado con DMEM en una placa de formación de imágenes 35 mm a base de vidrio. Incubar toda la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Antes de la formación de imágenes, sustituir el medio complementado con 2 ml de DMEM precalentado suplementado CO 2-independiente de medio (con 10% (v / v) de suero de ternera fetal (FCS), 200 U / ml de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina) que contiene 1 mM LysoTracker Red NOM-99.</li></ol> 4. Live Video Microscopía fagocitosis celular Ensayo <ol><li> La elección de microscopio dependerá de lo que está disponible localmente, pero la configuración microscopio tendrá que incluir una fase invertida, una cámara ambiental calentada a 37 ° C y de excitación / emisión filtros para las manchas elegidos (FITC y TRITC). </li><li> Encender el calentador de microscopio antes del experimento y tiempo suficiente para que la cámara de control ambiental calentar a 37 ° C. El tiempo necesario para estabilizar la temperatura de la cámara variará para diferentes configuraciones de microscopio. </li><li> Encienda el microscopio y la computadora, y cargar el software de imágenes. Monte el plato de imagen en la platina del microscopio y ajustar el enfoque para encontrar las J774.1 macrófagos. Optimizar la apariencia de las imágenes TRITC y DIC ajustando el porcentaje de luz transmitida y los tiempos de exposición. </li><li> Quitar el plato de imagen y añadir 3 × 10 6 FITC-manchado C. albicans frente a la tque repartir. Registre el tiempo que C. albicans se añade al plato. Vuelva a colocar el plato al escenario y optimizar la apariencia de las imágenes FITC si es necesario. Establecer una lista de puntos si es necesario. </li><li> Comenzar imágenes cuando todos los puntos están en el enfoque y los canales están optimizados. Capturar imágenes FITC, TRITC y DIC cada minuto durante 6 horas. </li></ol>

<ol>
	<li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages.">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li><li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin.">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li><li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan.">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li><li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans.">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li><li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation.">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li><li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling.">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li><li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants.">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen,+Campylobacter+jejuni.">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , (2012).</li><li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation.">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans.">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li><li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages.">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li><li>Erwig, L. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+(ERM)+proteins.">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar. NG es un beneficiario de las subvenciones sin restricciones para la investigación básica por Gilead Sciences. LE trabaja como consultor de GSK en el desarrollo de fármacos temprano.

Aquí, el método para el uso de microscopía de vídeo en vivo de células para estudiar la fagocitosis de macrófagos se describe. Microscopía de vídeo ofrece múltiples capas adicionales de información para el análisis. Una ventaja básica es que los datos de absorción se puede generar (de un solo experimento) para cualquier punto de tiempo durante todo el período de observación de 6 horas. Más importante aún, el método descrito permite el análisis diferencial de las etapas individuales de la fagocitosis. Hemos, por ejemplo, se muestra que los cambios en la absorción global de C. glicosilación albicans y mutantes morfogénesis por las líneas celulares de macrófagos y macrófagos primarios puede ser una consecuencia de los cambios en la migración de macrófagos hacia las células diana o la tasa de inmersión vez que el contacto célula-célula se establece 7. Hay una serie de trampas para evitar la hora de realizar estos experimentos. En primer lugar, es muy importante para garantizar la estabilidad de las condiciones ambientales durante todo el procedimiento experimentalDuré. Esto se consigue mejor en una cámara ambiental que se ajusta a las condiciones experimentales durante varias horas antes de comenzar el experimento. La calidad de vídeo es altamente dependiente de módulos sofisticadas que utilizan láseres infrarrojos para mantener automáticamente la muestra z-posición independientemente de los cambios mecánicos o térmicos, eliminando así la necesidad de correcciones de enfoque manual. Dada la amplia naturaleza de los experimentos, es importante limitar la exposición de luz láser y efectos asociados fotoblanqueo y fotoconversión, que puede ser minimizado mediante el empleo de marcadores altamente fluorescentes, que facilitan bajos tiempos de exposición. El protocolo de tinción FITC se describe aquí es rápido y confiable. Como FITC es un muy brillantes y estables veces mancha, exposición bajos son necesarios y esto la hace ideal para largos FITC time-lapse películas. Sin embargo, nosotros usamos una variedad de manchas de destino diferentes, incluyendo Calcofluor White y colorantes PKH así como organismos marcados. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La mayor parte de nuestro trabajo publicado se lleva a cabo utilizando un microscopio de campo amplio, pero la exposición puede reducirse aún más mediante el uso de un microscopio confocal de disco giratorio y en nuestras manos es esencial para la microscopía de time-lapse video 3D. Durante este estudio, las imágenes se capturaron a intervalos de 1 min más de un ensayo de fagocitosis 6 hr. El intervalo entre las imágenes se puede ajustar dependiendo del proceso bajo investigación. Por ejemplo, el intervalo se puede disminuir la hora de investigar los procesos rápidos, como el tráfico vesicular. El intervalo de tiempo mínimo estará limitada por las especificaciones de microscopio y una cámara. Hay algunas consideraciones a tener en cuenta a la hora de ajustar tiempos. En primer lugar, la disminución del intervalo entre las instantáneas significa menos puntos se pueden obtener imágenes y el tamaño del archivo será aumentado considerablemente. Por el contrario, aumentando el intervalo de imagen demasiado hará perder la continuidad de la película. Este enfoque se puede aplicaren principio, para estudiar otros patógenos y la absorción de morir las células huésped. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que la médula ósea de los macrófagos derivados de sialoadhesina deficientes en ratones muestran una unión reducida en gran medida y la fagocitosis de sialilada Campylobacter jejuni 8. Sin embargo, el tamaño solicitado es un determinante importante para la viabilidad, como el análisis de imagen se vuelve cada vez más difícil con una reducción en el tamaño de las células diana. Un sofisticado software de análisis de imagen es esencial para el rápido análisis de microscopía de vídeo, y esto debe ir acompañado de un apoyo adecuado bioinformática para facilitar la generación de algoritmos para estudiar la migración de las células individuales y poblaciones enteras de células 7. Vivo de células microscopía de vídeo en combinación con un sofisticado software de análisis de imágenes para el análisis minuto a minuto de la migración y las interacciones individuales C.albicans-macrófagos, ofrece una visión única de la complejidad de la C. albicans fagocitosis por macrophages. Existe un enorme potencial para expandir estos métodos para estudiar otros patógenos y los fagocitos (células dendríticas, neutrófilos) y el desarrollo de la microscopía de vídeo 3D con imagen interacciones célula-célula con mayor detalle o en más superficies fisiológicos tales como capas de células epiteliales y endoteliales. Esta técnica forma parte de la nueva generación de herramientas en el estudio de las interacciones huésped-patógeno y ayudará a generar información detallada espacial y temporal en una amplia gama de procesos dinámicos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Levadura nitrógeno base sin aminoácidos </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> Sal hemisulfato de adenina </td><td> Sigma </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> Agar técnico (n º 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-Ura deserción </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> De carbonato de sodio </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> De bicarbonato de sodio </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Life Technologies </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> LysoTracker Red NOM-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 mm de vidrio platos </td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis

Aclaramiento fagocítica de los hongos patógenos y microorganismos en general, se puede considerar que consisten en cuatro etapas distintas: (i) la migración de los fagocitos al sitio donde se encuentran los patógenos; (ii) el reconocimiento de patógenos asociados a patrones moleculares (PAMP) a través del patrón receptores de reconocimiento (PRRS), (iii) entrampamiento de microorganismos unidos a la membrana de la célula fagocítica, y (iv) la transformación de las células sumido en fagosomas maduración y la digestión de la partícula ingerida. Los estudios que evalúan la fagocitosis en su totalidad son informativos 1, 2, 3, 4, 5, pero están limitados en que normalmente no romper el proceso en la migración, la inmersión y la maduración del fagosoma, que puede ser afectado diferencialmente. Además, tales estudios valorar la aceptación como un acontecimiento único, en lugar de como un proceso dinámico continuo. Recientemente hemos desarrollado avanzados células vivas tecnologías de imagen, y éstos se han combinado con el análisis genético funcional de amboscélulas patógenas y de acogida para crear una plataforma interdisciplinaria para el análisis de la función celular inmune innata y la patogénesis fúngica. Estos estudios han revelado aspectos novedosos de la fagocitosis de que sólo podían ser observados mediante el análisis sistemático temporal de las interacciones moleculares y celulares entre los fagocitos humanos y hongos patógenos y microorganismos infecciosos más general. Por ejemplo, hemos comenzado a definir lo siguiente: (a) los componentes de la superficie celular para cada etapa del proceso de reconocimiento, la inmersión y la muerte de las células fúngicas 1, 6, 7, 8, (b) la forma geometría de la superficie influye en la eficiencia de la absorción de macrófagos y la muerte de células de levadura y de hifas 7, y (c) cómo inmersión conduce a la alteración del ciclo celular y el comportamiento de los macrófagos 9, 10. En contraste con las instantáneas individuales tiempo del punto, en vivo de células microscopía de vídeo permite una gran variedad de células huéspedes y patógenos a ser estudiado como cosecuencias continua que durante períodos de tiempo prolongados, proporcionando información espacial y temporal en una amplia gama de procesos dinámicos, como la migración celular, la replicación y el tráfico vesicular. A continuación se describe en detalle cómo preparar huésped y las células fúngicas, y llevar a cabo los experimentos de microscopía de vídeo. Estos métodos pueden proporcionar a un usuario-guía para futuros estudios con otros fagocitos y microorganismos.

Aquí nos muestran resultados representativos de C. captación albicans por una línea celular de macrófagos murinos J774.1 durante un 6 hr vivo de células experimento microscopía de vídeo. Figura 1 es un representante vivo de células película microscopía de vídeo, que muestra la fagocitosis de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Vivo de células microscopía de vídeo permite la internalización de C. albicans para ser visualizado sin la necesidad de teñir Candida externa. Sin embargo, durante estos experimentos, C. albicans se tiñeron utilizando el colorante sensible al pH FITC (verde), que se inactivó durante la acidificación del fagosoma de macrófagos, y facilita la confirmación de que Candida ha sido interiorizado (Figura 1). Para visualizar la ayuda adicional de ingestión C. albicans, los macrófagos fueron teñidas utilizando el tinte fluorescente rojo LysoTracker rojo DND-99, que compartimientos manchas ácidas y sirve como un marcador no específico de la maduración del fagosoma.La Figura 2 es una imagen fija a partir de un experimento de vídeo en vivo de células microscopía e ilustra la variación en el número de C. albicans ingeridos por macrófagos individuales J774.1. En este experimento, 82% de los macrófagos J774.1 engullido al menos una C. albicans celular al final del ensayo de fagocitosis 6 hr. En la Figura 3, el número de internalizada C. células albicans por macrófago se informa. El número medio de C. albicans adoptadas hasta por macrófagos es 3,4, pero es interesante que los macrófagos pueden ingerir hasta 16 células fúngicas. Figura 4 es una secuencia de imágenes fijas de un representante en vivo de células experimento microscopía de vídeo que muestra un macrófago phagocytosing C. células albicans, crecimiento de hifas con la lisis de macrófagos y en última instancia los macrófagos. Figura 4 ilustra que la microscopía de vídeo permite el análisis de los eventos siguientes entrampamiento de las células diana, es decir los datos pueden ser generados para el killing de los macrófagos por C. albicans hifas en relación con el número y la morfogénesis de las células diana ingeridos, y cómo se relaciona con matanza macrófagos maduración del fagosoma que puede ser estudiado en tiempo real. Figura 1. Vivo de células película microscopía video que muestra la fagocitosis de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Los macrófagos son teñidos con el colorante fluorescente rojo LysoTracker rojo NOM-99 y C. albicans se tiñeron utilizando FITC (verde). Los macrófagos y C. albicans fueron co-cultivadas por un período de 6 horas a 37 ° C en CO 2-independiente completa medio. Las imágenes fueron capturadas a intervalos de 1 min durante 6 hr. Los macrófagos se puede ver el establecimiento de contacto célula-célula con C. albicans, que es seguido por la absorción de C. albicans en fagosomas de los macrófagos. Las flechas apuntan a C. albicans antes de la inmersión por J774.1 macrófagos. Este video también muestra que la fluorescencia FITC es QuEnched siguiente inmersión de C. albicans. Barra de escala, a 10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> Figura 2. Representante vivo de células microscopía de imagen fija de vídeo que muestra la variación en el número de C. albicans engullido por los macrófagos individuales. Los macrófagos (teñidas utilizando LysoTracker rojo DND-99) fueron co-cultivadas con FITC-manchado C. albicans (verde). Hay variación en el número de C. envuelto albicans (un número junto a una flecha indica el número de C. albicans envuelta), y en C. morfología albicans (levadura es decir versos hifa). Barra de escala, a 20 m. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> Figura 3. Gráfico que muestra el número de C. albicans ingerido por J774.1 de macrófagos murinos al final de 6 ensayos de fagocitosis hr. Los datos representan 2 experimentos independientes. Un total de 100 macrófagos fueron contados a partir de 3 campos de cada experimento, dando un total de 600 macrófagos individuales. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> Figura 4. Una serie de imágenes de un representante en vivo de células experimento microscopía de vídeo que muestra un macrófago (M) y C. albicans (C) antes de y durante el reconocimiento (A, B), y durante y después de la absorción (C, D). C. albicans hifas continúan creciendo dentro del macrófago (E, F), lo cual puede resultar en la lisis de los macrófagos (G). Otros macrófagos son reclutados en el sitio de ruptura y de intento de ingerir el liberado C. albicans (H). Los macrófagos son teñidos con el tinte rojo fluorescente LysoTracker rojo NOM-99 y C. albicans se tiñeron utilizando FITC (verde). Tenga en cuenta que la tinción FITC se inactivó después de C. albicans captación por los macrófagos J774.1 (C). Barra de escala, a 10 m.

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Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células de<em&gt; Candida albicans</em&gt; Fagocitosis por los macrófagos. Estos métodos permiten la etapa específica de análisis de la migración de macrófagos, el reconocimiento, la inmersión y la maduración del fagosoma y revelan nuevos aspectos de la fagocitosis.

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.8K vistas.  University of Aberdeen. Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células de Candida albicans Fagocitosis por los macrófagos. Estos métodos permiten la etapa específica de análisis de la migración de macrófagos, el reconocimiento, la inmersión y la maduración del fagosoma y revelan nuevos aspectos de la fagocitosis.

Video: Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

La visualización de las respuestas inducidas por toxinas bacterianas mediante microscopía de fluorescencia de células en vivo

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isotérmico de amplificación (LAMP) Ensayos Loop mediada para la detección específica de las especies de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectan pollos

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Transformación biolística de un fluorescente Tagged gen en el oportunista por hongos patógenos<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica