Este trabajo fue apoyado por el Hospital General de Massachusetts Departamento de Medicina de Fondos Internos (JMT, MKM, MLC, JMV), Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería conceder T32EB006348 (CEC), Centro de Hospital General de Massachusetts para el fondo de la biología del desarrollo de la Computación e Integrativa y AI062773 ( RJH), las subvenciones AI062773, DK83756, y DK 043 351 (RJX), NSF 0643745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), y el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) AI057999 (JMV ). Damos las gracias a Nicholas C. Yoder útil para los debates, y Fieltros Charles (RPI, Inc.) para la asistencia técnica.

1. Condiciones de cultivo de agentes patógenos para la captura óptica <ol><li> Crecer A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) en un medio de agar semi-sólido que contiene SBD (Sabouraud dextrosa) a 30 ° C durante 3 días. </li><li> Crecer C. albicans (SC5314) en YPD (levadura peptona dextrosa) de cultivo líquido que contiene 100 mg / ml ampicilina durante la noche en una incubadora de agitación a 30 ° C. </li></ol> 2. Preparación de los agentes patógenos para el etiquetado fluorescente <ol><li> Cosecha de la cantidad deseada de los patógenos y la transferencia a un tubo de 1,5 ml de reacción. </li><li> Añadir 300 l de tampón fosfato salino (PBS) para tubo de reacción. </li><li> Sonicar mezcla durante 30 segundos. </li><li> Centrifugar a 4000 rpm durante 1 minuto. </li><li> Aspirar el sobrenadante, dejando de pellets sin ser molestados. </li><li> Repita (2,4) y (2,5) dos veces más. </li><li> Resuspender en 500μL de PBS. </li></ol> 3. Etiquetado de los agentes patógenos con tinte fluorescente <ol><li> Disolver 1 mg de colorante de interés (por ejemplo, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) en 100 l dimetilformamida (DMF) (concentración de 10 mg / ml). </li><li> Añadir 3 l de mezcla de colorantes a los tubos de reacción que contiene patógenos lavado. </li><li> Girar o agitar la muestra a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Lavar la muestra con PBS 3 veces por centrifugación a 4000 rpm durante 1 minuto. </li><li> Resuspender en 300 l de PBS. </li></ol> 4. La recolección de células T de la sangre entera <ol><li> Obtener sangre entera (fresca). </li><li> La sangre caliente, PBS + 2% de suero fetal bovino (SFB), y HISTOPAQUE a temperatura ambiente. </li><li> Añadir CD4 + RosetteSep Humanos de células T Cóctel de enriquecimiento a 50 l / ml de sangre total. </li><li> Rotar la muestra y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Diluir la muestra con un volumen igual de PBS + 2% de SFB y mezclar suavemente. </li><li> Capa diluida de la muestra en la parte superior de HISTOPAQUE, minimizando la mezcla </li><li> Centrifugar durante 20 minutos a 1200 xg a temperatura ambiente con el freno de apagado. </li><li> Eliminar las células enriquecido. </li><li> Lavar las células 2 veces con PBS enriquecido + 2% de solución de SFB. </li><li> Lisis de las células rojas de la sangre durante 2 minutos con tampón de lisis de glóbulos rojos </li><li> Agregar 10 ml de PBS + 2% de SFB y centrifugar lisadas las células rojas de la sangre a 1500 rpm durante 5 minutos </li><li> Aspirar el sobrenadante, cuidando de no alterar el pellet </li><li> Resuspender en los medios de comunicación IMDM con 10% de suero fetal bovino </li></ol> 5. Preparación de los macrófagos RAW 264.7 en la cámara de diapositivas <ol><li> Prepare DMEM (Dulbecco modificado de Eagle) que contenga un 10% de SFB, 1% penicilina / estreptomicina, y el 1% de L-glutamina. </li><li> Los medios de comunicación cálida, la tripsina, y PBS en baño de agua tibia a 37 ° C. </li><li> Lavar 2 veces la placa con PBS </li><li> Aspirar PBS entre cada lavado. </li><li> Añadir 5 ml de tripsina a la placa para cubrir la superficie (para una placa de cultivo de 10 cm de tejido). </li><li> Incubar durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Suavemente golpee lado de la placa para separar las células de la superficie de la placa. Tenga cuidado de no salpicar fuera de la tripsina de la placa. </li><li> Añadir 5 ml o cantidad equivalente de los medios de comunicación a la tripsina. </li><li> Aspirar la mezcla en un tubo de reacción. </li><li> Centrifugar a 1000 xg durante 3 minutos. </li><li> Aspirar los medios de comunicación, cuidado de no perturbar el sedimento. </li><li> Resuspender en 10 ml de los medios de comunicación. </li><li> Añadir 400 l de los medios de comunicación a cada cámara de la diapositiva de la cámara. </li><li> Añadir 5 l de la suspensión celular a cada cámara. </li><li> Crecen durante la noche en la incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. </li></ol> 6. Además de los agentes patógenos de la muestra <ol><li> Pipeta de 5.10 L de patógenos etiquetado de interés (de los pasos 1-3) en la cámara. </li><li> Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y abajo, con cuidado de no tocar la parte inferior de la cámara de molestar a los macrófagos adheridos. </li></ol> 7. Carga de la muestra a girar microscopio confocal de disco (en el video, escanear a través de los componentes) <ol><li> Encienda todos los componentes de spinning microscopio confocal de disco. </li><li> Alinear microscopio en busca de imágenes DIC. </li><li> Retire la cámara de diapositivas de la incubadora. </li><li> Insertar una diapositiva de cámara en la etapa especializados. </li><li> Quite la parte superior de la cámara de diapositivas (necesaria para la formación de imágenes DIC). </li></ol> 8. Preparación para la captura óptica (en el video, escanear a través de los componentes y la forma en que está integrado en microscopio) <ol><li> Encienda el obturador de trampa óptica. </li><li> Encienda el láser IR. </li><li> Obturador abierto (el láser) a trampa óptica. </li><li> Confirmar disparo delante de láser IR se cierra mediante la comprobación con la tarjeta de IR. </li></ol> 9. Selección y manipulación de agentes patógenos con trampa óptica <ol><li> Centrarse en los macrófagos en la diapositiva adherido. </li><li> Buscar patógenos fluctuando libremente en la solución junto a los macrófagos. </li><li> Mueva la etapa de tal manera que el patógeno se encuentra en las inmediaciones de la trampa. </li><li> Abrir obturador y participar en la trampa. </li><li> Mover la muestra para que los macrófagos en contacto con la trampa estacionariaped patógeno. </li><li> La imagen con el hilado microscopio confocal de disco, ya sea en la DIC, fluorescencia, o combinación de ambos. Por lo general, la captura se realiza en la DIC, y en tiempo real de imágenes se hace con fluorescencia. </li></ol> 10. Los resultados representativos: Ejercer un pleno control espacial y temporal de los agentes patógenos y los granos en un estudio in vivo e in vitro en el medio ambiente, hemos diseñado un aparato de captura de costumbre-construido integrada en un microscopio confocal de disco giratorio (esquema que se muestra en la Fig. 1.). Con toda su fuerza, el láser proporciona 350 mW de potencia y después del acoplamiento a la luz con los componentes ópticos diferentes en el aparato de la trampa óptica, ~ 80 mW de potencia en el objetivo TIRF, medido con un medidor de potencia, fue utilizada para formar la trampa en la cámara. Con el fin de colocar un objeto en la cámara en relación con el objeto atrapado, la etapa fue movida mientras se mantiene el objeto atrapado estacionario con el láser de captura. El escenario se trasladó a lenta velocidad suficiente, de modo que la fuerza de arrastre sobre la partícula atrapada no superó la fuerza máxima de captura. Poblaciones separadas de C. albicans (típico tamaño - ~ 5 micras) se marcaron con cada uno de los tres colores (AF488, AF568, AF647 y, lo que corresponde a verde, azul y rojo en la figura, respectivamente) para ilustrar imágenes con múltiples canales de fluorescencia al mismo tiempo que ópticamente atrapando a los patógenos. Una sola C. albicans fue atrapado y trasladado en un cuadrado a través de un conjunto de otras levaduras, como indican las flechas grises, lo que demuestra la capacidad de capturar y manipular la ubicación específica de un patógeno único elegido por el operador, incluso en un ambiente lleno de gente (Fig. 2A) . Para ilustrar aún más la flexibilidad de este sistema para atrapar a las morfologías diferentes formas exhibidas por los organismos patógenos, las pinzas ópticas también fue capaz de mantener y situar un C. albicans de partículas con un pseudohifas. El C. albicans etiquetados con AF647 (rojo) se trasladó a lo largo de una trayectoria como se indica por la flecha blanca y colocado junto a las células GFP-LC3-RAW fluorescentes (Fig. 2B). La porción de levadura de la C. albicans fue atrapado en la zaga a lo largo de pseudohifas. También coloca Aspergillus fumigatus al lado de una célula de ratón macrófagos RAW con el fin de analizar el marco de tiempo absoluto de la fagocitosis con esta línea celular en particular y de los patógenos (Fig. 3). Una vez que el patógeno entra en contacto con la célula, la trampa está apagado, y el tiempo de imágenes a intervalos se emplea para observar los acontecimientos celulares posteriores (Fig. 3B). La trampa óptica también se utilizó para la captura primaria de células T aisladas de la sangre y dirigido junto a bolas recubiertas con anticuerpo anti-CD3 para que la célula T para formar una sinapsis inmunológica con el talón (Fig. 4), muestran los adicionales versatilidad para atrapar y manipular directamente las células inmunes. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Información general y esquemática de la trampa óptica combinada y la configuración de disco giratorio confocal microscopio. Instrumento de diseño que muestra el haz de captura (púrpura), camino de iluminación de campo claro de imagen (color naranja), haz de excitación de fluorescencia (rojo), emisión de fluorescencia (verde), dispositivo de carga acoplada (CCD), electrones multiplicando dispositivo de carga acoplada (EM- CCD), espejos dicroicos (D1 y D2), espejos (M1 y M2), y lentes (L1, L2, L3, L4). Todos los demás componentes del sistema de trampa-microscopio confocal están etiquetados en la figura. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) las imágenes de fluorescencia de atrapado y manipulado C. albicans. Una atrapada fluorescente marcada con (Alexa Fluor 488 (AF488), azul) del organismo en un campo de otra fluorescente marcada con C albicans (AF568, AF647 y verde, rojo). El escenario se mueve alrededor de la partícula atrapada, azul CA según lo indicado por las flechas de color gris. (B) Atrapado pseudo-hifas forma de C. albicans al lado de GFP-LC3 células RAW. Formulario marcados con fluorescencia psuedohyphal de CA (rojo, AF647) ópticamente atrapados y se trasladó junto a GFP-LC3 expresado macrófagos RAW. El organismo CA se mueve a lo largo de la trayectoria indicada por la flecha blanca. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Trampeo y la posición de A. fumigatus al lado de una célula fagocítica RAW. (A) campo claro las imágenes de un A. atrapados fumigatus, según lo indicado por la flecha blanca, se trasladó y se coloca en el camino indicado por la flecha roja. El patógeno es atrapado ligeramente fuera de foco debido a la trampa de empujar el organismo ligeramente por encima del plano focal. A. fumigatus se mueve hasta que se coloca junto a la celda deseada RAW. (B) contra la gripeorescence imagen de la fagocitosis de A. fumigatus por células RAW. Después de que el patógeno se encuentra atrapada junto a una celda de RAW, el proceso de fagocitosis se activa. A los 30 s, la membrana de las células RAW comienza a cambiar y la forma de una taza alrededor de la partícula. A los 60 s, la taza está completamente formado. De 90 a 150 s, el A. fumigatus está envuelto, y de 180 s, la partícula es internalizado por completo <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Captura de primaria de las células T para formar sinapsis con anti-CD3 bolas recubiertas. DIC imágenes de una primaria de células T movido por la trampa óptica a una posición al lado de una bola recubierta con anticuerpo anti-CD3. La célula se forma una sinapsis inmunológica, que no pueden ser fácilmente discernible en las imágenes.

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	<li>Grakoui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+A+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity:+Learning+on+the+fly.">Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+neutral+particles+using+lasers.">Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+and+trapping+of+particles+by+radiation+pressure.">Acceleration and trapping of particles by radiation pressure.</a> Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).</li><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+viruses+and+bacteria+Science.">Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science.</a> Nature. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+M13+bacteriophage+tethering+and+stretching.">Single M13 bacteriophage tethering and stretching.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin's+cover-neck+bundle+folds+forward+to+generate+force.">Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force.</a> Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+tether+formation+from+outer+hair+cells+with+optical+tweezers.">Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers.</a> Biophys J. , 1386-1395 (2002).</li><li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;&#946;+T+cell+receptor+is+an+anisotropic+mechanosensor.">The &#945;&#946; T cell receptor is an anisotropic mechanosensor.</a> J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).</li><li>Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+interaction+of+RBC+with+optical+tweezers.">Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers.</a> Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).</li><li>Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+manipulation+of+pathogens+with+an+optical+trap+for+live+cell+imaging+of+intercellular+interactions.">Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions.</a> PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).</li><li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+case-fatality+rate:+Systematic+review+of+the+literature.">Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature.</a> Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).</li><li>Wey, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hospital-acquired+candidemia+-+the+attributable+mortality+and+excess+length+of+stay.">Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay.</a> Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).</li></ol>

En este trabajo se utiliza una trampa óptica para capturar los agentes patógenos, con dimensiones de 3 m - 5 micras. A pesar de los patógenos de interés para nuestro laboratorio suelen tener estas dimensiones, el sistema de pinzas ópticas se describe aquí es flexible para atrapar a una amplia gama de tamaños. De hecho trampas ópticas han sido utilizados para capturar las partículas que van desde los átomos individuales a las células de aproximadamente 10 micras de diámetro. Además, este sistema de captura ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> A. fumigatus </td><td></td><td></td><td> Cepa albina, B-5233/RGD12-8, regalo de KJ Kwon-Chung, NIH </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50-B mutante, regalo de Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 cepa, regalo de Gerald Fink, del Instituto Whitehead </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> dimetilformamida </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> Sangre fresca </td><td></td><td></td><td> Regalo de RJW Heath, MGH, el HMS </td></tr><tr><td> Microscopio invertido Nikon </td><td> Nikon </td><td></td><td> Modelo Ti-E </td></tr><tr><td> Láser de captura, ChromaLase </td><td> Azul Sky Research </td><td> CLAS-106-STF02-02 </td><td></td></tr><tr><td> Láser de excitación de fluorescencia </td><td> Coherente </td><td></td><td> Innova modelo 70C </td></tr><tr><td> Ayudas para diseño de componentes de captura </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224, MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> Ópticos mesa de aire </td><td> Técnica Manufacturing Corporation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Obturador electrónico con pedal de control </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> Adquiridos de los Asociados Vicente, Rochester, NY </td></tr><tr><td> De fibra óptica monomodo </td><td> Oz Óptica </td><td> PMJ-3S3S-1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra posicionador </td><td> Thorlabs </td><td> PAF-X-5-C </td><td></td></tr><tr><td> Fibra colimador </td><td> Oz Óptica </td><td> HPUCO-23-1064-P-25AC </td><td></td></tr><tr><td> Lentes para telescopio </td><td> Thorlabs </td><td> AC254-150-B </td><td> Distancia focal de 150 mm </td></tr><tr><td> Etapas de la traducción (x, y, z) </td><td> Newport </td><td> M-461-XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR espejo dicroico </td><td> Chroma </td><td> ET750-sp-2p8 </td><td></td></tr><tr><td> Lente objetivo (100X) </td><td> Nikon </td><td></td><td> NA = 1,49, inmersión en aceite, el objetivo TIRF </td></tr><tr><td> Cabeza confocal </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-XI </td><td></td></tr><tr><td> Polarizador </td><td> Nikon </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> Wollaston prisma </td><td> Nikon </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM-CCD de la cámara </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td></td></tr><tr><td> Cámara CCD (ORCA ER) </td><td> Hamamatsu </td><td> C4742-80-12AG </td><td></td></tr><tr><td> Rueda de filtros </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> Rueda de filtros </td><td> Sutter </td><td> LB10-ENO </td><td></td></tr><tr><td> Cámaras cubreobjetos </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111-51D </td><td> Recubiertas con anticuerpos anti-CD3 </td></tr><tr><td> Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10313 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino (Hyclone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

Imágenes dinámicas de células vivas permite la visualización directa de la interacción en tiempo real entre las células del sistema inmunológico 1, 2, sin embargo, la falta de control espacial y temporal entre los fagocitos y el microbio ha hecho observaciones se centró en las interacciones iniciales de la respuesta del huésped frente a patógenos difícil. Históricamente, los eventos intracelulares de contacto como la fagocitosis 3 han sido fotografiadas por la mezcla de dos tipos de células, y luego continua explorando el campo de visión para encontrar los contactos intercelulares casual en la fase adecuada de la interacción. La naturaleza estocástica de estos eventos hace que este proceso tedioso, y es difícil de observar los acontecimientos a principios o fugaces en contacto célula-célula por este enfoque. Este método requiere la búsqueda de pares de células que están en el punto de contacto, y observar hasta que consuman su contacto, o no. Para hacer frente a estas limitaciones, el uso captura óptica como un no-invasivo, método no destructivo, pero rápida y eficaz a la posición de las células en cultivo. Trampas ópticas, o las pinzas ópticas, son cada vez más utilizada en la investigación biológica para capturar y manipular físicamente las células y otras partículas de tamaño micrométrico en tres dimensiones 4. La presión de radiación fue observado por primera vez y se aplican a los sistemas de pinzas ópticas en 1970, 5, 6, y fue utilizado por primera vez al control de las muestras biológicas en 1987 7. Desde entonces, las pinzas ópticas han madurado hasta convertirse en una tecnología para explorar una variedad de fenómenos biológicos 8-13. Se describe un método de 14 que los avances en directo imágenes de células mediante la integración de una trampa óptica con el hilado de microscopía confocal de disco con control de temperatura y humedad para proporcionar un control exquisito espacial y temporal de los organismos patógenos en un entorno fisiológico para facilitar la interacción con las células huésped, según lo determine el operador. En vivo, los organismos patógenos, como Candida albicans y Aspergillus fumigatus, que puede causar potencialmente letal, infecciones invasivas en pacientes inmunocomprometidos, 15, 16 (por ejemplo, el SIDA, la quimioterapia y los pacientes de trasplante de órganos), quedaron atrapados ópticamente no destructiva utilizando intensidades de láser y se trasladó junto a macrófagos, que pueden fagocitar el patógeno. Alta resolución, transmite películas de luz y fluorescencia basada estableció la posibilidad de observar los primeros eventos de la fagocitosis de las células vivas. Para demostrar la amplia aplicabilidad en la inmunología, la primaria de células T también fueron atrapados y manipulados para formar sinapsis con anti-CD3 microesferas recubiertas en vivo, y el tiempo-lapse de imágenes de la formación de sinapsis se obtuvo también. Al proporcionar un método para ejercer un control preciso espacial de patógenos vivos con respecto a las células inmunes, las interacciones celulares pueden ser capturados por microscopía de fluorescencia con un mínimo de perturbación a las células y pueden producir una poderosa comprensión de las primeras respuestas de inmunidad innata y adaptativa.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Se describe un método para seleccionar de forma individual, manipular, y los agentes patógenos de imágenes en vivo con una trampa óptica acoplada a un microscopio de disco giratorio. La trampa óptica proporciona un control espacial y temporal de los organismos y los coloca junto a las células huésped. Microscopía de fluorescencia captura dinámica de interacciones intercelulares con perturbación mínima para las células.

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K vistas.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Se describe un método para seleccionar de forma individual, manipular, y los agentes patógenos de imágenes en vivo con una trampa óptica acoplada a un microscopio de disco giratorio. La trampa óptica proporciona un control espacial y temporal de los organismos y los coloca junto a las células huésped. Microscopía de fluorescencia captura dinámica de interacciones intercelulares con perturbación mínima para las células.

Video: Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

El uso de<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging techniques require propagation of light through glass, but on glass macrophage fusion is a rare event. This protocol presents the fabrication of several optical-quality glass surfaces where adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons transforms glass into a fusogenic surface. First, preparation of clean glass surfaces as starting material for surface modification is described. Second, a method is provided for the adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons to convert non-fusogenic glass into a fusogenic substrate. Third, this protocol describes fabrication of surface micropatterns that promote a high degree of spatiotemporal control over MGC formation. Finally, fabricating glass bottom dishes is described. Examples of use of this in vitro cell system as a model to study macrophage fusion and MGC formation are shown.

This protocol describes the fabrication of optical-quality glass surfaces adsorbed with compounds containing long-chain hydrocarbons that can be used to monitor macrophage fusion of living specimens and enables super-resolution microscopy of fixed specimens.

Fabricación de superficies de cristal de calidad óptica para estudiar la fusión de macrófagos

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infección De Larvas De Pez Cebra Con Esporas De Aspergillus Para El Análisis De Las Interacciones Huésped-Patógeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...