Este trabajo fue apoyado por una beca de la Universidad de British Columbia (BV) y las subvenciones de la Fibrosis Quística Canadá y canadienses Institutos de Investigación en Salud (DPS). Damos las gracias a Jacqueline Chung para la preparación inicial de los protocolos.

1. Crecimiento Cultura (días 1 2) <ol><li> Haga crecer un cultivo iniciador: 3 ml de Luria Bertani (LB) caldo en un tubo a presión superior de 15 ml, a 37 ° C durante la noche de los rotadores. Diluir el crecimiento durante la noche a un OD 600 de 0,6. Añadir 1 ml de esta dilución a 100 ml de caldo LB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Incubar a 37 ° C con agitación a 250 rpm durante 16 h en fase estacionaria (SP), a una mejor aproximada, en un cultivo discontinuo, condiciones de infección y para asegurar que los factores de virulencia bacteriana bajo el control de factores de señal de fase estacionaria, tales como rpoS y quórum detección, se expresan. Alternativamente, las bacterias cultivadas en SP principios o mediados-o-logarítmica fase tardía se pueden utilizar para obtener información sobre la fase de adaptación bacteriana. </li><li> Después de 16 h medir la OD 600 y asegurar la cultura ha alcanzado SP por comparación con una curva de crecimiento previamente construido en condiciones idénticas. </li></ol> 2. Extracción de proteínas (Día 3) <ol><li&gt; Chill todos los medios de comunicación y soluciones de antemano en la nevera durante la noche. Todos los pasos deben realizarse con tubos en un cubo de hielo. Preenfriar una microcentrífuga y una centrífuga de alto rendimiento de Beckman Coulter (o equivalente) a 4 ° C y el rotor interior (rotor JA-20 =, = centrífuga J2-HS). </li><li> Prepare fresco 0,1 M fenilmetanosulfonilo fluoruro (PMSF, 174,19 g / mol) de solución en acetona disolviendo 0,0174 g de PMSF (PMSF &quot;PRECAUCIÓN&quot; es tóxico y corrosivo, use protectores para la cara y guantes) en 1 ml de acetona (acetona «caution» tóxico e inflamable, use protectores para la cara y guantes). </li><li> Hacer una solución de PBS / EDTA / PMSF: 0,1 ml de 0,1 M de PMSF, 0,1 ml de EDTA 0,5 M, y 9,8 ml de PBS. Compruebe el diámetro exterior de la cultura hr 16 es aproximadamente donde debería estar en SP. </li><li> Tomar 35 ml de la cultura y la transferencia de bacterias a un tubo de centrífuga Oakridge y centrifugar el cultivo a 4500 × g durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Extraer el sobrenadante a un contenedor de residuos yañadir 35 ml de PBS enfriado y resuspender el precipitado. Centrifugar de nuevo a 4500 × g durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de PBS frío. Traslado al estériles Eppendorf de 2 ml y centrifugar 1 min a lo alto de la microcentrífuga a 14000 × ga 4 ° C. Quitar y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de solución de PBS / EDTA / PMSF, resuspender el pellet y transferir a un tubo de 2 ml de tornillo tapa (con junta tórica) que contiene perlas ~ 0,5 ml de vidrio (preesterilizadas). Añadir el sedimento se volvió a suspender al tubo que contenía las perlas de vidrio y cordón de golpearlos a 4 ° C durante 1 min en frío-habitación. Haga esto 3 veces, poniendo la muestra en hielo después de cada golpe. </li><li> Se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min en la microcentrífuga. Eliminar el sobrenadante y lo puso en un tubo de poliestireno de 5 ml estéril. </li><li> Para aumentar el rendimiento de añadir 1 ml de solución de PBS / EDTA / PMSF al mismo tubo contiene perlas de vidrio de nuevo. Fiesta de bolas del tubo a 4 ° C durante 1 min. Haga esto 2x poner la muestra en hielo affiesta ter. Se centrifuga a 14.000 xg durante un minuto en la centrifugadora y eliminar el sobrenadante y añadir al sobrenadante del paso 2.8. Usar una jeringa de 1 ml y un filtro de 0,20 micras el sobrenadante del tubo de poliestireno a un nuevo tubo Eppendorf de 2 ml estéril. </li><li> En este punto, las muestras deben ensayarse para la cantidad de proteína, utilizando el kit de extracción de proteínas Pierce MicroBCA y partes alícuotas de 200 g deben congelarse a -80 ° C hasta que sea necesario. </li></ol> 3. Preparación de la muestra (Día 4) <ol><li> Preparar 25 ml solución de rehidratación (8 M urea, 2% CHAPS, 2% IPG Buffer, 0,002% de azul de bromofenol) y guárdela en 2,5 ml alícuotas a -20 ° C. Añadir 7 mg de ditiotreitol (DTT, 154,2 g / mol) justo antes del uso a una parte alícuota de la solución de rehidratación de stock 2,5 ml. </li><li> Proceso descongelado muestras del paso 2,10 utilizando un 2-D Limpiar kit con resuspensión final en 450 l de solución de rehidratación de stock preparadas en el paso 3.1. </li></ol> 4. PrimeroDimensión Isoeléctrico (IEF) (Día 4) Todos los pasos de esta sección están utilizando el Sistema IEF Ettan IGPhor. <ol><li> Configure las primeras tiras de IPG dimensión: soportes de tira limpia con la solución de limpieza tira y luego lavar con agua Milli-Q, dejar boca abajo para secar. Asignar a cada muestra un número de soporte de tiras de gel. </li><li> Cargue la muestra a partir del paso de rehidratación en la segunda zona más amplia de la - end (). Utilice pinzas limpias para sacar tiras de gel de embalaje. Saque la capa protectora de las tiras de gel. Línea tiras cara rugosa hacia abajo en un movimiento lento deslizamiento para obtener las tiras mojadas en el camino a partir de (-) de extremo a extremo (+). </li><li> Coloque papel secante humedecido con agua esterilizada en la parte superior del electrodo y en las tiras de gel para prevenir el agotamiento. Enjuague pinzas en-entre las rondas con agua purificada y etanol. Quite todas las burbujas, superponer finas con aceite mineral para evitar outs secos. Alinee los soportes de tiras de gel en la máquina. </li><li> Ejecutar 12 horas a 20 ° C durante rehydración, 1 hora a 200 V, 1 h a 500 V, 1 h a 1000 V, 0,5 horas a 4000 V, 12 h a 8000 V, 24 h a asimiento 300 V y se puede sacar en este momento. </li><li> Después de IEF se terminó, se recomienda llevar a cabo la segunda dimensión electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, a menos que la tira IPG se están congeló a -80 ° C en Saran Wrap recubierto con aceite mineral para el análisis futuro. Alternativamente, con el fin de evitar el punto de rayas debido al acceso TDT es posible incluir un segundo paso de equilibrado de la tiras IPG antes de la segunda dimensión con un tampón que contiene yodoacetamida. </li></ol> 5. Segunda dimensión SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (Día 5) Todos los pasos de esta sección están utilizando el aparato de electroforesis Ettan DALTsix. <ol><li> Para montar el aparato de colada de gel, limpiar a fondo todos los componentes y asegúrese de que las ruedas de gel esté nivelado y la unión de goma gris se lubrica con gel de silicona. Ponga el problema negrober tapón triangular en la parte inferior. Luego, colocar alternativamente el separador y las placas de vidrio con la placa más corta de cristal hacia delante. Asegúrese de que los separadores son en la espalda y la parte delantera. Llenar el espacio restante con las cargas (unos 5 hojas) por lo que la parte superior es plana. Coloque el panel delantero con la punta roja en el exterior. Utilice abrazaderas para apretar cada lado y apretar los tornillos inferiores. </li><li> Preparación del gel: Añadir 297,3 ml de Duracryl, (&quot;PRECAUCIÓN&quot; Duracryl es el uso de tóxicos caretas y guantes), 147 ml de tampón Tris 1,5 M pH 8,8 y 143,3 ml de agua Milli-Q en un matraz con la punta de vacío que contiene un barra de agitación. Ponga la tapa en la parte superior y se mezcla la solución a una velocidad moderada con el vacío durante 20 min. El vacío se utiliza para desgasificar la solución. Hacer un fresco 10% de solución de persulfato de amonio (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g de APS a 2 ml de agua Milli-Q. </li><li> Adición de la mezcla de gel a la máquina de colada de gel: Cuando se hace el vacío añadir 6 ml de 10% de dodecil sulfato de sodio (SDS, 228,38 g / mol)para el lado del matraz para evitar poner más burbujas en la solución. Añadir APS, revolver, añadir 0,25 ml de N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilendiamina (TEMED, 116,20 g / mol) (&quot;PRECAUCIÓN&quot; TEMED es inflamable uso caretas y guantes) y revuelva. </li><li> Verter la mezcla de gel en gel de máquina de colada a través de un embudo insertado en la parte posterior del aparato. Vierta hasta una pulgada por debajo de la placa corta. Añadir 1,5 ml de butanol saturado de agua a la parte superior del gel y envolver la parte superior con una envoltura Saran para evitar la deshidratación. Espere 1 hora para asegurar la polimerización completa. </li><li> Comprobación del gel: Cuando el gel se hace (marque el frasco), desmontar la máquina de colada de gel por un sumidero. Compruebe la integridad del gel mientras se lava las placas de vidrio con agua tibia; no permita que entre agua en el plato. Vierta el butanol y enjuague la parte superior de gel dos veces con agua para deshacerse de butanol. Llene la parte superior con agua de nuevo y dejar reposar si los geles no se usan de forma inmediata. </li><li> Preparación de las tiras de: Preparar la solución tampón de equilibrado de lacongelador (6 M urea, 75 mM de Tris-HCl pH 8,8, 29,9% de SDS, 0,002% de azul de bromofenol). Esto puede ser preprepared y almacenado en 10 ml de alícuotas a -20 ° C. Disolver 0,1 g de DTT a una 10 ml de solución de tampón de equilibrio. Un tubo puede ser utilizado para dos tiras IPG. Coloca los geles de la cara de la tira hacia abajo en el buffer y deje reposar durante 30 min. Recuerde qué extremo es cuál. </li><li> Preparación de la unidad de electroforesis (aparato de separación 2-D): Añadir 4,5 l de 1x tampón de electroforesis (25 mM de Tris base [121.1 g / mol], 192 mM de glicina [288,38 g / mol], y 0,1% w / v de SDS [288,38 g / mol]) al tanque de funcionamiento. Este tampón se puede utilizar durante un máximo de 3 veces. Gire la unidad de electroforesis en. Revise el nivel de agua en la máquina de refrigeración por agua y llenarlo con agua si es baja. Encender la máquina, pulse mode para comprobar la temperatura designada, la cual debe ser de 10 ° C. </li><li> Hacer 1 L de tampón 2x ​​correr y 1 l de 1x de tampón de ejecución y almacenar a 4 ° C. Haga solución de agarosa de sellado: peso 0,25 g de agarosE y disolver en 50 ml de tampón 1x corriendo. Pulsos durante 15 segundos cada uno. </li><li> Configuración de la unidad de electroforesis: Use pinzas para sacar cada tira y eliminar el exceso de tampón en ambos lados con una toalla de papel limpia. NO toque las tiras. Vierta el agua en la parte superior del gel y la línea de la parte superior del gel con tampón 1x corriente. Utilice pinzas limpias y colocar las tiras en la parte superior de la placa de largo, con la cara de gel hacia usted. Añadir tampón 1x a las tiras para lubricarlo. Tiras de diapositivas más adelante mediante el uso de tiras de plástico. Quite todas las burbujas en medio de la avenida principal y el gel. </li><li> Añadir solución de agarosa-sellado a la parte superior de la tira para sellarlo. Repita este procedimiento para el resto de las tiras. Coloque las placas de vidrio que contienen los geles a base de gel y la menor en el depósito de gel. Asegúrese de que el nivel de tampón 1x en la cámara exterior está en la línea de fondo designado antes de poner la cámara superior en. </li><li> Coloque el marco para la cámara de amortiguación superior en la parte superior de las placas de vidrio y asegúrese de que es toda la way abajo presionando la parte inferior hacia abajo. Utilice un embudo y añadir el tampón de desarrollo 2x en la cámara superior hasta la línea media. Utilice un embudo y añadir tampón de ejecución 1x a la cámara exterior hasta que alcanza la línea superior. Coloque la tapa en la parte superior y encienda la unidad de electroforesis y la fuente de alimentación. </li><li> Ejecutar toda la noche a 52 V, 96 mA, 5 W. Compruebe si la corriente va buscando las burbujas en el alambre de plata en la parte superior. Ejecute el gel hasta que la línea principal es de 1 cm de la parte inferior. </li><li> Las proteínas también se pueden analizar utilizando equipos y reactivos de otras compañías tales BIORAD o Hoefer, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 6. Tinción con plata de los geles para la visualización del gel (día 5-6) <ol><li> Prepare una solución de arreglo 1 (800 ml de etanol, 200 ml de ácido acético, y 1000 ml de agua Milli-Q en la campana de humos en un cubo de plástico). La solución es buena para 6 geles. Gire todas las máquinas y se lleve a cabo toda la parte central de la unidad de electroforesis y pull en el fregadero. También poner el soporte blanco en el fregadero. Tire de la bandeja superior contiene el tampón 2x ​​ejecución. </li><li> Desmontar el aparato y retirar los geles de las placas de vidrio en solución de arreglo 1. Los geles pueden ser identificados por cortar esquinas cuando se retiran de las placas de vidrio, el número de esquinas de corte correspondiente a la orden de gel en la máquina de colada. </li><li> Coloque el recipiente con la solución de arreglo y los geles en un agitador durante al menos 1 hora de la noche a 4 ° C. </li><li> La transferencia de los geles para fijar la solución de 2 (20 ml de 50% glutaraldehído, 600 ml de etanol, 5 g de tetrationato de potasio (302,46 g / mol), 136 g de acetato de sodio (82,03 g / mol), y agua Milli-Q para 2000 ml) y colocan en un agitador durante 1 hora. </li><li> Lavar los geles 4x durante 15 minutos cada una en agua Milli-Q. </li><li> Tinción de los geles en solución nitrato de plata (4 g de nitrato de plata (169,87 g / mol), 500 l de formaldehído, y agua Milli-Q para 2000 ml) durante 30 min o hasta 48 horas. </li><li> Lave gel durante 1min en agua Milli-Q. </li><li> Transferencia a solución de revelado (60 g de carbonato de sodio (105,99 g / mol), 300 l de formaldehído, 15 mg de tiosulfato de sodio (158,11 g / mol), y agua Milli-Q para 2000 ml) durante 5-30 min hasta que el gel se tiñe. </li><li> Ponga los geles en solución de parada (100 g de Tris-base (121,14 g / mol), 40 ml de ácido acético y agua Milli-Q a 2.000 ml) durante 10 min. </li><li> Para el almacenamiento, la transferencia de los geles de glicerol de la solución (40 ml de glicerina o de 400 ml, si se desea un almacenamiento a largo plazo, y 1.600 ml de agua Milli-Q) durante 10 minutos y luego secarlas con un secador de gel. </li><li> Los geles se pueden visualizar después de la tinción utilizando sistemas de imagen, como un escáner / densitómetro, fotografiada con transiluminador de luz o de imágenes Gel. El software de análisis de imagen tales como PDQuest análisis 2-D de BioRad a continuación, se puede utilizar para obtener información cuantitativa y cualitativa de las proteínas en una muestra. </li></ol> 7. Gel de plata de tinción para el análisis de espectrometría de masas </p&gt; <ol><li> Fijar los geles en 50% de metanol, y ácido acético al 5% durante 1 hora. </li><li> Lavar con metanol al 50% durante al menos 10 minutos a toda la noche. </li><li> Lavar con agua destilada 3 veces durante 10 min. </li><li> Sensibilizar con tiosulfato de sodio 0,02% (158,11 g / mol) 2x durante 15 min. </li><li> Lave 3 veces en CHILLED 3x agua destilada durante 10 min. </li><li> Sumergir en gel de solución de nitrato de plata ENFRIADA 1% (169,87 g / mol) durante al menos 20 min a 1 hora a 4 ° C </li><li> Lavar 2x durante 1 min con agua destilada. Cambie la bandeja / cubo. </li><li> Desarrollar en el 0,04% de formaldehído en el 2% de carbonato de sodio anhidro (105,99 g / mol) y desechar cuando se vuelve amarillo bastante rápido; tienen tres lotes y estar dispuestos a cambiar cada 5 min. </li><li> Lavar en ácido acético al 5% y luego almacenar en ácido acético al 1%. </li><li> Enjuague 1,5 ml tubos Eppendorf (para sostener llegar mancha recortes) con etanol de grado USP y de aire seco antes de su uso. </li><li> Pinzas limpias, hojas de afeitar y superficies con metanol al 100%. </li><li> Rocíe guantes y superficies con etanol. </li><li> Manchas de Impuestos Especiales en una campana de flujo o un área de aire limpio. Spots pueden ser también extirpados usando un cortador de punto automático. </li><li> Póngalos en tubos Eppendorf y barco en el hielo o mantenerse en la nevera. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li><li>Velapati&#241;o, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+proteins+from+Burkholderia+pseudomallei+isolated+during+primary+and+relapsing+melioidosis.">Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis.</a> Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).</li><li>Chung, J. W., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+and+characterization+of+bacterial+factors+associated+with+Burkholderia+cenocepacia+survival+in+a+murine+host.">Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host.</a> Microbiology. 153, 206-214 (2007).</li><li>Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Public+health+assessment+of+potential+biological+terrorism+agents.">Public health assessment of potential biological terrorism agents.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).</li><li>Thon, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+protein+changes+during+platelet+storage+requires+complementary+proteomic+approaches.">Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches.</a> Transfusion. 48, 425-435 (2008).</li><li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+New+and+Emerging+Proteomic+Techniques.">In New and Emerging Proteomic Techniques.</a> Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).</li><li>Lopez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+silver+stain+and+SYPRO+Ruby+Protein+Gel+Stain+with+respect+to+protein+detection+in+two-dimensional+gels+and+identification+by+peptide+mass+profiling.">A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling.</a> Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Un método para la preparación de proteínas se ha descrito que puede extraer la mayoría de las proteínas Burkholderia con buena reproducibilidad. Esto se demuestra mediante la obtención de la misma perfil de proteínas a partir de dos preparaciones independientes realizados en diferentes días utilizando el mismo cultivo bacteriano crecido en LB o caldo YEM como se muestra en la Figura 1. La extracción fue eficiente para las bacterias cultivadas en medio líquido, sin embargo no hemos pro...

El género Burkholderia comprende más de 62 especies, organismos Gram negativas aisladas a partir de una amplia gama de nichos, y se divide en dos grupos principales 1,2. El primer grupo incluye a los organismos phytotrophic humana, animal y, y la mayoría de los estudios se han centrado en las especies patógenas de este grupo debido a su importancia clínica. Los miembros más patógenas son B. y B. pseudomallei mallei (que causa melioidosis y el muermo, respectivamente) y 3,4 patógenos oportunistas (las 17 especies definidas del complejo Burkholderia cepacia, BCC) 5, que causan la enfermedad de la fibrosis quística (FQ) y enfermedad granulomatosa crónica (CGD) 1. El segundo grupo, con más de 30 especies no patógenas, incluye bacterias asociadas a las plantas o al medio ambiente, y se consideran potencialmente beneficioso para el host 2. Numerosas complicaciones surgen frinfección bacteriana OM con los miembros patógenas del género Burkholderia, como la transmisión del patógeno entre los pacientes, propagación de la enfermedad y el fracaso del tratamiento debido a la resistencia intrínseca o adquirida a los antibióticos que hacen difícil de erradicar en la mayoría de los casos 6-9. Por lo tanto, obtener una comprensión más clara de la base para el establecimiento de la infección bacteriana es vital para el tratamiento de enfermedades causadas por estos organismos. Con el fin de profundizar en el establecimiento de la infección, se requieren extensas investigaciones sobre los componentes bacterianos asociados con la patogénesis. Los estudios centrados en el análisis proteómico de organismos Burkholderia utilizando enfoques proteómicos describen proteínas que han sido implicados en la patogénesis bacteriana, así como cambios en su proteoma perfiles 10-16. Métodos de extracción de proteínas utilizando ultrasonidos y los ciclos de descongelado por congelación en tampón de lisis que contiene alta concentration de urea, tiourea en combinación con detergente y anfolitos se ha aplicado en Burkholderia estudios proteómicos 10-13. Aunque la urea es bastante eficiente para la desnaturalización de la proteína, se puede establecer un equilibrio en solución acuosa con isocianato de amonio, que puede reaccionar con los grupos de aminoácidos, formando de este modo artefactos (reacción de carbamilación) 17. Por lo tanto, se recomienda incluir anfolitos portadores, que actúan como eliminadores de cianato y evitar temperaturas por encima de 37 ° C 17. Además, para evitar cualquier interferencia química de tampón de lisis con la cuantificación de proteínas, el mismo tampón de lisis se puede utilizar para generar la curva estándar de modo que las muestras y los estándares tienen el mismo fondo 10. Otras metodologías implican el uso de tampones alcalinos y detergentes con períodos de incubación de calor 17,18; sin embargo estas condiciones podría inducir cambios en el proteoma y algunos detergentes no son compatibles con PRoteomics solicitud a menos que se incluyen los pasos subsiguientes de eliminación de detergente 17,18. Después de la extracción y cuantificación adecuada, expresión global de proteína de cada proteína individual se puede estudiar usando enfoques proteómicos tales como bidimensional (2-D) electroforesis en gel. Esta técnica fue descrita por primera vez por O&#39;Farell 19 y consiste en la separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico en la primera dimensión, y a continuación, en función de su peso molecular por electroforesis en gel de acrilamida en la segunda dimensión. Debido a su resolución y sensibilidad, esta técnica es una herramienta poderosa para el análisis y la detección de proteínas a partir de fuentes biológicas complejas 19,20. Esta técnica de separación está actualmente disponible en los enfoques centrados en la proteína con la gran ventaja de la solución de isoformas de proteínas causadas por modificaciones post-transcripcionales o procesamiento proteolítico. Los cambios cuantitativospuede ser detectado mediante la comparación de la intensidad de la mancha correspondiente después de la tinción del gel 20. Sin embargo, esta técnica no es adecuada para la identificación de proteínas muy grandes, proteínas de membrana, proteínas muy básicas y ácidas o hidrófobos, y es una técnica algo laborioso y requiere mucho tiempo 20. Nuevos enfoques-péptido centrado (basadas en gel de no) que son más robustos y objetivo estén disponibles y se pueden utilizar para la comparación cuantitativa por métodos diferenciales de etiquetado de isótopos estables tales como el etiquetado de cisteína por afinidad isótopo codificados etiquetado (ICAT) 21, y grupo amino etiquetado por el etiquetado de isótopos para la cuantificación absoluta y relativa (iTRAQ) 22. El uso de una única técnica de proteómica podría dar información insuficiente, por lo que es necesario el uso de dos enfoques proteómicos complementarias para la mayoría de los cambios totalmente en la evaluación de proteoma. Sin embargo, la electroforesis en gel 2-D es ampliamente utilizado y se puede aplicar de forma rutinaria para Quancuantitativos de expresión de varias proteínas en diferentes organismos. Aquí se describe una extracción de proteínas de células enteras y procedimientos de electroforesis en gel 2-D para las especies de Burkholderia que fueron adaptados y optimizados de la GE Healthcare 2-D electroforesis Principios y métodos Manual 80-6429-60AC 2004 ( <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a> ). La extracción de proteínas se llevó a cabo usando un batidor de bolas con perlas de vidrio en presencia de PBS que contenía EDTA 5 mM (ácido etilendiaminotetraacético) y 1 mM de PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo). Este procedimiento permite la cuantificación de proteínas con la mínima degradación y es modificable para las aproximaciones proteómicas como se informó anteriormente 15,23,24. Electroforesis en gel 2-D se llevó a cabo utilizando 24 cm de largo inmovilizadas de pH 4-7 gradiente y las proteínas se separaron de acuerdo con su punto isoeléctrico. Luego se separaron las proteínas en función de su molecpeso cular por gel de SDS-poliacrilamida. Además, describimos un método de tinción de plata para la visualización de proteínas in situ, y un método de tinción de plata que es compatible para el análisis de espectrometría de masas. En conjunto, estos procedimientos pueden permitir la identificación de proteínas importantes de especies de Burkholderia que podrían estar involucrados en la patogénesis.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7626</td>
 <td>Toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A18-1</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS Buffer</td>
 <td>Bioscience</td>
 <td>R028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP118-500 </td>
 <td>toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass beads (0.1 mm)</td>
 <td>BioSpec Products</td>
 <td>11079101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21009-342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroBCA protein extraction kit</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>23235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-681-375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-D Clean-Up kit</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6484-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15505-050</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>17-1314-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>856126</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>176002-46</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Duracryl</td>
 <td>Proteomic Solutions</td>
 <td>80-0148</td>
 <td>Very toxic, carcinogen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP179-100</td>
 <td>Flammable, toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15524-010</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td>Acute toxicity, flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15510-027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>HC1100-1GL</td>
 <td>Flammable, toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A491-212</td>
 <td>Flammable, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutaraldehyde</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>G151-1</td>
 <td>Very toxic, corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium tetrathionate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2926</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium acetate</td>
 <td>EM Science</td>
 <td>7510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver nitrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>209139</td>
 <td>Corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>252549</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium thiosulfate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S7026</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>EMD</td>
 <td>9230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>808831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>800688</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A412-4</td>
 <td>Flammable, toxic, health hazard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium carbonate anhydrous</td>
 <td>EMD</td>
 <td>SX0400-3</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral oil</td>
 <td>ACROS</td>
 <td>415080010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JA-20 ultracentrifuge rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>334831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini Beadbeater</td>
 <td>Biospec Products</td>
 <td>3110BX</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6505-03</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6485-27</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

total protein extraction and 2-d gel electrophoresis methods for burkholderia species

La investigación de los niveles de proteína intracelular de especies bacterianas es de importancia para la comprensión de los mecanismos patogénicos de las enfermedades causadas por estos organismos. Aquí se describe un procedimiento para la extracción de proteína a partir de especies de Burkholderia basado en la lisis mecánica usando perlas de vidrio en presencia de ácido tetraacético etilendiamina y fluoruro de fenilmetilsulfonilo en tampón fosfato salino. Este método se puede utilizar para diferentes especies de Burkholderia, para diferentes condiciones de crecimiento, y es probable adecuado para el uso en los estudios proteómicos de otras bacterias. Tras la extracción de proteínas, una de dos dimensiones (2-D) electroforesis en gel de la técnica proteómica se describe para estudiar los cambios globales en los proteomas de estos organismos. Este método consiste en la separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico en la primera dimensión, seguida de separación sobre la base de peso molecularpor electroforesis en gel de acrilamida en la segunda dimensión. La visualización de proteínas separadas se lleva a cabo mediante tinción con plata.

Análisis comparativo de los perfiles de proteínas extraídas de un mismo cultivo bacteriano en dos ocasiones diferentes mostraron patrones similares de bandas indicando extracciones de proteínas con éxito. Proteínas de peso molecular extraídos oscilaron desde 10 hasta 150 kDa. La Figura 1 muestra representativa de Coomassie de gel de tinción de azul de las extracciones de proteínas de células enteras de multivorans Burkholderia (un miembro de la BCC) aislados clínicos cultivadas en LB...

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Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Los miembros del género Burkholderia son patógenos de importancia clínica. Se describe un método para la extracción de proteína total bacteriana, usando disrupción mecánica, y electroforesis en gel 2-D para el análisis proteómico posterior.

Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para<em&gt; Burkholderia</em&gt; Especies

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

total-protein-extraction-2-d-gel-electrophoresis-methods-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

28.9K vistas.  University of British Columbia.  Los miembros del género Burkholderia son patógenos de importancia clínica. Se describe un método para la extracción de proteína total bacteriana, usando disrupción mecánica, y electroforesis en gel 2-D para el análisis proteómico posterior. 

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A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

Un procedimiento de 1,5 horas para la identificación de Enterococcus Especies directamente los cultivos de sangre

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Vigilancia de la Gripe Aviar, con tarjetas FTA: Métodos de Campo, la bioseguridad y los problemas de transporte resueltos

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocolo Chelex simple para la extracción de ADN a partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Dos Métodos de Formación heterocarión para descubrir los factores de restricción del VHC

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procedimientos para la Identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Métodos alternativos In Vitro para la determinación de la integridad estructural de la cápside Viral

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like receptor myeloid differentiation primary response gene 88 (TLR-MyD88) signaling pathway. IRF5 activation involves phosphorylation, dimerization, and subsequent translocation from the cytoplasm into the nucleus, which in turn induces the gene expression of various pro-inflammatory cytokines. A detection assay for IRF5 activation is essential to studying IRF5 functions and its relevant pathways. This article describes a robust assay to detect endogenous IRF5 activation in the CAL-1 human plasmacytoid dendritic cell (pDC) line. The protocol consists of a modified nondenaturing electrophoresis assay that can distinguish IRF5 in its monomer and dimer forms, thus providing an affordable and sensitive approach to analyze IRF5 activation.

A native Western blot method for analyzing endogenous interferon regulatory factor 5 dimerization in the CAL-1 plasmacytoid dendritic cell line is described. This protocol can be applied to other cell lines as well.

Native Polyacrylamidde Gel Electrophesis Análisis de la dimerización endógena IRF5

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like ...