El financiamiento para el desarrollo de la pipeta de extracción fue proporcionada en parte por una investigación interna y la subvención para el desarrollo concedida a DRP.

1. Muestra Lisis <ol><li> Las muestras deben ser en forma líquida. Si la muestra es sólida, por ejemplo alimentos o en las heces, la muestra debe ser suspendido en un medio líquido como el agua o solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Mezclar 500 l de la muestra con 500 l de tiocianato de guanidina 6M (pH 6,5) en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Presionar la bombilla de una pipeta de extracción, expulsando el aire ambiente. </li><li> Saque toda la muestra de 1 ml en la pipeta de la extracción, el material absorbente, permitiendo que la bombilla se expanda lentamente. </li><li> Invertir la herramienta de extracción de tal manera que las perlas sorbentes y drenaje de la muestra en el bulbo. </li><li> Moler los granos absorbentes con la muestra en la lámpara con cuidado de no expulsar a la muestra fuera de la pipeta de la extracción. </li></ol> 2. Extracción de ácidos nucleicos (Figura 1, panel A) <ol><li> Invertir la pipeta extracción (abertura hacia abajo) y expulsar la muestra en el tubo original de 1,5 ml. </li> &lt;li&gt; Tire de la totalidad 1 ml de muestra en la pipeta de la extracción, pasando sobre el sorbente, a una velocidad moderada, teniendo cuidado de mantener el sorbente en el cuello de la pipeta de extracción. </li><li> Expulsar a toda la muestra en el tubo de 1,5 ml presionando la bombilla. </li><li> Repetir los pasos 2.2 y 2.3, hacer pasar la muestra a través de los sorbentes cuatro veces más para un total de 5 pasadas. </li><li> Después del quinto pase sobre el sorbente, expulsar a toda la muestra de 1 ml en 4 ml de tampón de extracción de proteínas (en un tubo cónico de 15 ml), cerrar el tubo, y dejar de lado para su uso posterior. </li><li> Lavar los ácidos nucleicos aislados pasando 1 ml de etanol al 95% durante los sorbentes tres veces, volviendo el etanol para su tubo original al pasaje final. </li><li> Repita el paso 2.6 con un segundo de 1 ml, 95% de etanol de lavado. </li><li> Presione y suelte el bulbo durante 5 minutos, pasando el aire ambiente a lo largo de la pipeta de extracción para secar los ácidos nucleicos o lecho sorbente. Limpiar etanol residual de la punta de la pipeta u extraccióncantar una Kimwipe. </li><li> Recuperar los ácidos nucleicos haciendo pasar 250 l de 10 mM Tris (pH 6,8) durante los sorbentes cinco veces. El tampón Tris puede ser reemplazado por cualquier otra solución acuosa adecuada tal como PBS. La solución resultante contiene los ácidos nucleicos extraídos. </li></ol> 3. La extracción de proteínas (Figura 1, panel B) <ol><li> Mezclar la muestra y el tubo de extracción de proteínas de la etapa tampón 2,5 por inversión y pasar aproximadamente dos a tres mililitros de esta muestra de 5 ml más de la sorbente de una pipeta de extracción nuevo. </li><li> Expulsar toda la muestra en el mismo tubo de 15 ml cónico teniendo cuidado de mantener el sorbente en el cuello de la pipeta de extracción. </li><li> Repetir los pasos 3.1 y 3.2, hacer pasar la muestra a través de los sorbentes 15 veces. </li><li> Lavar el sorbente y la proteína unida al pasar a 1 ml de etanol al 95% sobre el lecho sorbente tres veces, expulsando el etanol en su tubo original. </li><li> Repita el paso 3.4 con un segundo de 1 ml, 95% de etanol de lavado. </li><html><li> Presione y suelte el bulbo durante 5 minutos, pasando el aire ambiente a lo largo de la pipeta para secar la extracción de proteína / cama sorbente. Limpiar etanol residual de la punta de la pipeta extracción utilizando un Kimwipe. </li><li> Recuperar la proteína haciendo pasar 250 l de PBS sobre el sorbente cinco veces. El tampón PBS se puede sustituir por cualquier otra solución acuosa adecuada tal como Tris 10 mM (pH 6,8). La solución resultante contiene el contenido en proteínas de la muestra. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="Figura 1A" /> Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. contenido &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5.

<ol>
	<li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries,+1984-2005.">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li><li>Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+Pipette.">Extraction Pipette.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample.">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli.">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li><li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea.">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li><li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain.">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li><li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages.">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes.">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las herramientas, químicas y protocolo descrito en este informe representan el primer ejemplo conocido de un electricidad libre, sistema de extracción de múltiples macromolécula que se pueden utilizar en sobre el terreno, los puntos de atención aplicaciones. Ambos tipos macromolécula puede aplicarse a un número de dispositivos de diagnóstico o aguas abajo analítica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos aislados son de calidad de PCR (Figura 2 y 3) mientras que el componente de proteína de la muestra es inmunorreactiva (Figura 4). La utilización de este sistema de extracción en áreas limitadas austeros o de recursos de todo el mundo podría reducir drásticamente la carga de enfermedad en las poblaciones que viven allí. Este sistema de extracción también podría ayudar en los programas de vigilancia de enfermedades en todo el mundo, proporcionando un método eficaz robusta pero rápido y económico para el procesamiento de muestras en lugares austeros o remoto. Un aspecto importante del método de extracción descrito anteriormente es quepuede ser modificado por el usuario. Por ejemplo, en casos donde el tamaño de la muestra es mayor o menor que los primeros 500 μLs (paso 1,2), el usuario puede ajustar el volumen de los reactivos en consecuencia. Esto es, la relación volumétrica de los reactivos al tamaño de la muestra debe permanecer constante mientras que los volúmenes absolutos pueden ser alterados. Además, los ajustes en el número de pasajes durante el sorbente se puede también hacer a discreción del usuario. Por ejemplo, si un volumen de muestra más grande se utiliza, hacer pasar la muestra a través de los tiempos sorbentes más que figuran (pasos 2.4 y 3.3) aumentará la probabilidad de que el tipo de macromolécula (ácido nucleico o proteína) poner en contacto el sorbente. El aumento de los pasajes debe incrementar la eficiencia de la captura hasta la saturación se alcanza absorbente. Hemos encontrado que la herramienta de extracción y químicas asociadas tienen algunas limitaciones, la más importante de las cuales es que la química de extracción de proteínas es ineficaz para la recuperación de altamente glicosiladaproteínas. En el caso de que la corriente abajo de diagnóstico se dirige a una proteína glicosilada, este sistema puede no ser ideal para su identificación. Además, los límites superior e inferior de la eficiencia de extracción, ya sea para los ácidos nucleicos o las proteínas están aún por determinar, y la optimización está en marcha para maximizar la eficiencia de recuperación. Un mayor desarrollo de la herramienta va a superar estas lagunas en los conocimientos actuales.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tiocianato de guanidina </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> etanol </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 109827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> Una-4503 </td></tr></tbody></table>

electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation

Patógenos tradicionales y emergentes, tales como Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC), Yersinia pestis, o enfermedades basadas en priones son de gran preocupación para los gobiernos, las industrias y los profesionales médicos en el mundo. Por ejemplo, EHECs, junto con Shigella, son responsables de la muerte de aproximadamente 325.000 niños cada año y son especialmente prevalentes en el mundo en desarrollo, donde el laboratorio basado en la identificación, común en los Estados Unidos, no está disponible 1. El desarrollo y la distribución de bajo costo, basados ​​en el terreno, los puntos de atención de herramientas para ayudar en la rápida identificación y / o el diagnóstico de patógenos o marcadores de enfermedad podría alterar dramáticamente la progresión de la enfermedad y el pronóstico del paciente. Hemos desarrollado una herramienta para aislar ácidos nucleicos y proteínas de una muestra por extracción en fase sólida (SPE) sin electricidad o equipos relacionados con el laboratorio 2. Las macromoléculas aisladas pueden ser utilizados para diagnósticoSIS ya sea en un laboratorio hacia adelante o utilizando sobre el terreno en el punto de atención plataformas. Es importante destacar que este método ofrece para la comparación directa de ácido nucleico y los datos de proteínas de una muestra de las Naciones Unidas-split, que ofrece una confianza a través de la corroboración de análisis genómico y proteómico. Nuestra herramienta aislamiento utiliza el estándar de la industria en fase sólida para el aislamiento de ácidos nucleicos, la tecnología de pluma, que aísla los ácidos nucleicos a partir de una solución de sal caotrópica, usualmente isotiocianato de guanidina, a través de la unión a base de sílice partículas o los filtros 3. Patentada CUBRC de la química en fase sólida de extracción se utiliza para purificar proteínas a partir de soluciones salinas caotrópicos, en este caso, a partir de los residuos o flujo pasante tras el aislamiento de ácidos nucleicos 4. Por embalaje bien caracterizado química en una pequeña plataforma, barato y sencillo, se han generado un sistema portátil de ácido nucleico y la extracción de proteína que puede realizarse bajo una variety de condiciones. Los ácidos nucleicos aislados son estables y pueden ser transportados a una posición donde la potencia se encuentra disponible para la amplificación por PCR, mientras que el contenido de proteína inmediatamente pueden ser analizados por mano u otros ensayos inmunológicos basados. La rápida identificación de marcadores de la enfermedad en el campo podría alterar significativamente los resultados del paciente, dirigiendo el curso de tratamiento adecuado en una etapa temprana de la progresión de la enfermedad. La herramienta y el método descrito son adecuadas para su uso con prácticamente cualquier agente infeccioso y ofrecen al usuario la redundancia de los análisis de tipo multi-macromolécula al mismo tiempo reducir su carga logística.

Aislamiento de ácidos nucleicos: los ácidos nucleicos son aislados PCR amplificable y libre de contaminación de proteínas. Ejemplo 1: Los ácidos nucleicos recuperados son adecuados para uso en aplicaciones basadas en la PCR. Por ejemplo, la Figura 2 muestra la amplificación de genes de la toxina shiga asociados con enterohemorrágica E. coli O157: H7 EDL-933 (ATCC # 35150) a partir de un procedimiento de extracción de ácido nucleico / proteína con la pipeta de extracción. Los genes de la toxina shiga stx 1 y stx 2 se encuentran en templado lambda bacteriófago como bacteriófago defectuoso y en ésta y otras enterohemorrágica E. cepas de E. bajo el control del promotor P R 5 6 7 8. La activación de la respuesta SOS en E. E. conduce a profago inducción y / o producción de toxinas 9. Hemos utilizado una versión modificada del ensayo de PCR multiplexada por Feng et al. 11 para identificar el stx 1 y genes stx 2, tanto en la cultura y muestras adicionadas de aguas residuales. Los carriles A y B en la Figura 2 se muestran los resultados de una amplificación por PCR de una muestra de cultivo sin procesar (carril A) y una muestra de cultivo procesado (carril B). Estos resultados son prácticamente idénticos significado que no hay pérdida de fidelidad en los ácidos nucleicos transformados o aisladas. A continuación amplificada de aguas residuales crudas de pinchos (calle D) o ácidos nucleicos aislados de las aguas residuales de pinchos (calles E y F). Estos datos indican que los ácidos nucleicos aislados como resultado una mayor amplificación frente a los ácidos nucleicos no aisladas a partir de muestras de aguas residuales con púas. Por consiguiente, concluimos que, o bien inhibidores de la PCR se encuentran naturalmente en las aguas residuales fueron eliminados en forma aislada o que los ácidos nucleicos se concentraron en el aislamiento. Una combinación de estas dos hipótesis es también posible. Espectroscopia ultravioleta se utilizó junto a mostrar que los ácidos nucleicos aislados eran relativamente libre of proteína contaminante. Figura 3 muestra los espectros UV de dos E. coli O157: H7 extracciones de ácidos nucleicos, el aislamiento denominados A y B de aislamiento, en comparación con el espectro normalizado del cultivo bacteriano, etiquetado de pre-aislamiento. Los espectros UV de los ácidos nucleicos aislados se asemeja a los espectros de puros ácidos nucleicos, que tiene una relación calculada de absorbancia entre 260 nm y 280 nm se aproximan 1,8 10. Estos datos muestran que hay muy poca proteína contaminante en la fracción de ácido nucleico recuperado utilizando la técnica descrita. Aislamiento de proteínas: proteína recuperada a partir del experimento de aislamiento de ácidos nucleicos / proteína es inmunorreactiva y electroforéticamente idéntica a la proteína pura. Ejemplo 2: La fracción de proteína aislada se aplicó a la E. RapidChek coli O157 tiras laterales de flujo de ensayo (SDIX, Inc.). Los controles muestran una identificación positiva en todas las muestras que albergan E. E.<html> O157, con o sin inducción STX (Figura 4, los carriles B y C, respectivamente). Los datos de la Figura 4 se muestran los resultados positivos de las muestras que albergan E. coli O157 que se procesaron para los ácidos nucleicos y proteínas a continuación, utilizando la pipeta de extracción. Estos datos muestran que la proteína aislada de cada muestra es inmunorreactiva desencadenando así una respuesta positiva. Amplificación por PCR (como se describe en el Ejemplo 1) se realizó en las muestras de proteína para demostrar que la fracción de proteína aislada carecía de contaminar los ácidos nucleicos. Los resultados de estos experimentos fueron negativos por electroforesis en gel. Por lo tanto, se concluye que el contenido en proteínas de la muestra se separó de la contaminación de los ácidos nucleicos. Estos resultados, tomada en conjunto con los descritos para la demostración paso de ácido nucleico de aislamiento que los ácidos nucleicos y proteínas están aisladas en etapas de fraccionamiento separadas. t &quot;&gt; Ejemplo 3:. La proteína aislada es adecuada para electroforesis 10 Figura 5 representa un teñido con Coomassie 8% en gel de acrilamida cargado con BSA (Figura 5, carriles A y C) y BSA aislado de isotiocianato de guanidina 6M utilizando la extracción pipeta y asociado protocolo. La movilidad electroforética de la proteína aislada es idéntica a la de las muestras de control. Por lo tanto la conclusión de que el proceso de extracción no altera la estructura covalente de la proteína aislada. <img alt="Figura 1a" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> Figura 1, Panel A: Representación de un típico procedimiento de extracción de ácidos nucleicos La muestra se mezcla con tiocianato de guanidina 6M en el tubo de muestra y se pasa sobre el sorbente cinco veces.. Después de que el último paso, la muestra se añadió al tampón de extracción de proteínas. Los ácidos nucleicos y la envolvente sorbentes se lavan dos veces con etanol. La muestra es entonces aire dried y se eluyó desde el sorbente. <img alt="Figura 1b" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> Figura 1, Panel B: Representación de un procedimiento de extracción de proteínas típica La muestra se mezcla con tampón proteína aislada de la etapa 1, la Figura 1, el panel A se pasa sobre el sorbente de una pipeta segunda extracción 15 veces.. El resto del procedimiento es idéntico al del protocolo de extracción de ácido nucleico. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> Figura 2:. Imagen negativa de un bromuro de etidio en gel de agarosa teñido Un multiplexado Shiga gen de la toxina 1 y 2 experimento de amplificación se realizó utilizando muestras de cultivo (carriles A y B) o muestras de aguas residuales crudas enriquecidas con E. coli O157: H7 (calles D, E y F). Las muestras se añadió directamente a un tubo de reacción de PCR (carriles A y D) o las muestras fueron procesadas utilizando el proces aislamientos y los ácidos nucleicos extraídos se añadieron al tubo de reacción de PCR (muestras B, E y F). El protocolo de PCR es una modificación del descrito por Feng et al 11. Nuestra modificación dirigida sólo a los amplificada por el stx 1 (banda inferior) y stx 2 (banda superior) pares de iniciadores, la deserción todas las parejas de cebadores otros. Carril C es la escalera 1Kb de BioRad. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> Figura 3: Resultados de la espectroscopia UV de E. coli O157: H7 ácidos nucleicos aislados utilizando la pipeta extracción informó Los ácidos nucleicos aislados están etiquetados aislamiento ayb aislamiento.. El espectro UV de la muestra se ensayó también antes de la extracción de ácidos nucleicos y la etiqueta es de pre-aislamiento. Los espectros se obtuvieron utilizando un espectrofotómetro Hitachi U3010 y el paquete de software asociado. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt; Figura 4:. Foto color de las tiras de prueba RapidChek El contenido de proteína de las muestras utilizadas en la Figura 2 se aisló utilizando la pipeta de extracción y se ensayaron para la inmuno-reactividad mediante el ensayo de flujo lateral. Los carriles de CA son los controles sin procesar, es decir, se añadió el cultivo de células de la tira de prueba sin ácido nucleico o la extracción de proteínas. Línea A es E. coli BL21 DE3 pLysS como un control negativo, carriles B y C muestran E. coli O157: H7 que no fue tratada (B), o tratados con mitomicina C durante 4 horas (C). Los carriles D a H muestran los resultados de la adición de la proteína extraída de las tiras de prueba de flujo lateral. Los carriles D y E se probaron utilizando extracto de proteína de E. coli BL21 DE3 pLysS ya sea sin (D) o con mitomicina C tratamiento (E) como controles negativos. Los carriles AFP presentan los resultados cuando se extrae la proteína de E. coli O157: H7 fue utilizado. La proteína se extrae de no tratada (F), o de 2 horas (G) o 4 horas (H) mitomicina C cultivos tratados.Los resultados positivos producen una línea doble de color rojo. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> Figura 5:. Fotografía de un teñido con Coomassie de SDS-PAGE de BSA se aisló de la solución con la pipeta extracción y protocolos descritos. Los carriles A y C son los carriles de control de 250 mg / ml y 500 mg / ml, respectivamente. Los carriles B y D representan BSA recuperado a partir de soluciones que contienen las mismas concentraciones que sus respectivos controles.

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Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Una herramienta y química se describen para aislar secuencialmente ácidos nucleicos seguido de proteínas a partir de una muestra sin la necesidad de electricidad. La herramienta consta de un sorbente a cabo dentro de una pipeta de transferencia, mientras que las químicas de aislamiento se basa en los principios de extracción en fase sólida. Las macromoléculas aisladas pueden ser analizados mediante ensayos de inmuno-basados ​​y basado en la PCR.

Electricidad-libre, el ácido nucleico secuencial y aislamiento de las proteínas

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K vistas.  CUBRC, Inc.. Una herramienta y química se describen para aislar secuencialmente ácidos nucleicos seguido de proteínas a partir de una muestra sin la necesidad de electricidad. La herramienta consta de un sorbente a cabo dentro de una pipeta de transferencia, mientras que las químicas de aislamiento se basa en los principios de extracción en fase sólida. Las macromoléculas aisladas pueden ser analizados mediante ensayos de inmuno-basados ​​y basado en la PCR.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteína Aislamiento del desarrollo embrionario del corazón del ratón Válvula Región

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Etiquetado específico de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas con metiltransferasas y el cofactor Análogos

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...