Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de estudo da Universidade de British Columbia (a BV) e doações de Fibrose Cística Canadá e Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (DPS) para. Agradecemos Jacqueline Chung para a preparação inicial dos protocolos.

1. Crescimento Cultura (dias 1 +2) <ol><li> Crescer uma cultura de partida: 3 ml de Luria Bertani (LB) caldo numa ml tubo de pressão top 15, a 37 ° C durante a noite rotador. Dilui-se o crescimento durante a noite a uma DO600 de 0,6. Adicionar 1 ml desta diluição para 100 ml de caldo LB num balão Erlenmeyer de 250 mL. Incubar a 37 ° C com agitação a 250 rpm durante 16 horas em fase estacionária (SP), a melhor aproximada, em cultura descontínua, condições de infecção e para assegurar que os factores de virulência bacteriana sob o controlo de factores de sinal de fase estacionária, tais como centros de investigação e de quorum detecção, são expressos. Alternativamente, as bactérias cresceram em SP cedo ou fase semi-logarítmica tardia ou pode ser usada para obter informação sobre a fase de adaptação bacteriana. </li><li> Depois de 16 horas a medir DO600 e assegurar a cultura atingiu SP por comparação com uma curva de crescimento previamente construído sob condições idênticas. </li></ol> 2. Extração de proteínas (dia 3) <ol><li&gt; Relaxe todos os meios de comunicação e soluções de antemão, a geladeira durante a noite. Todos os passos devem ser realizados com os tubos em um balde de gelo. Prechill uma microcentrífuga e uma centrifugadora Beckman Coulter Alto Desempenho (ou equivalente) a 4 ° C e o rotor interno (rotor JA-20 =, centrífuga = J2-HS). </li><li> Preparar a solução (PMSF, 174,19 g / mol) em acetona pela dissolução de 0,0174 g de PMSF (PMSF &#39;CUIDADO&#39; é tóxico e corrosivo, o uso de rosto escudos e luvas) em 1 ml de acetona (acetona &#39;CUIDADO&#39; é fresco 0,1 M de fluoreto fenilmetanossulfonilo tóxico e inflamável, usar escudos face e luvas). </li><li> Adicione-se uma solução de PBS / EDTA / PMSF: 0,1 ml de 0,1 M de PMSF, 0,1 ml de 0,5 M de EDTA, e 9,8 ml de PBS. Verifique o OD da cultura hr 16 é de aproximadamente onde deve estar em SP. </li><li> Tomar 35 ml da cultura bacteriana e transferência para um tubo de centrífuga de Oakridge e centrifugar a cultura a 4.500 x g durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante para um recipiente de resíduos eadição de 35 ml de PBS arrefecido e ressuspender o pellet. Centrifugar novamente a 4500 × g durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de PBS frio. Transferir para estéril 2 ml de Eppendorf e centrifuga-se 1 min a alta na microcentrífuga a 14000 × g a 4 ° C. Retire e elimine o sobrenadante. </li><li> Adicione 1 ml de solução de PBS / EDTA / PMSF, ressuspender o sedimento e transferir para um tubo de 2 ml parafuso da tampa (com o-ring) contendo 0,5 ml ~ contas de vidro (esterilizado). Adicionar o pelete re-suspenso para o tubo contendo as esferas de vidro e talão bater-lhes a 4 ° C durante 1 min na sala fria. Faça isso 3x, colocando a amostra em gelo após cada bash. </li><li> Centrifugar a 14000 xg durante 1 min na microcentrífuga. Remover o sobrenadante e colocá-lo em um tubo de poliestireno 5 ml estéril. </li><li> Para aumentar o rendimento adicionar 1 ml de PBS / EDTA / PMSF ao mesmo tubo contêm grânulos de vidro novo. Grânulo bater o tubo a 4 ° C durante 1 min. Faça isso 2x colocando a amostra em gelo affesta de ter. Centrifugar a 14.000 x g durante um minuto sobre a centrífuga e remover o sobrenadante e adicionar ao sobrenadante a partir do passo 2.8. Usando uma seringa de 1 ml e um filtro de 0,20 mM do sobrenadante a partir do tubo de poliestireno estéril, para um novo tubo de Eppendorf de 2 ml. </li><li> Neste ponto, as amostras devem ser ensaiadas para a quantidade de proteína, utilizando o kit de extracção de proteínas Pierce MicroBCA e aliquotas de 200 mg devem ser congeladas a -80 ° C até ser necessário. </li></ol> 3. Preparação de Amostras (dia 4) <ol><li> Prepare 25 ml de solução stock de reidratação (8 M uréia, 2% CHAPS, 2% IPG Buffer, 0,002% de azul de bromofenol) e armazenar em 2,5 mL alíquotas a -20 ° C. Adicionar 7 mg de ditiotreitol (DTT, 154,2 g / mol), imediatamente antes da utilização a uma alíquota de 2,5 ml da solução de re-hidratação. </li><li> Processo descongelado amostras do passo 2.10 usando um 2-D Clean up kit com ressuspensão final em 450 ml de solução estoque de reidratação preparados no passo 3.1. </li></ol> 4. PrimeiroDimensão Isoelectric focagem (IEF) (Dia 4) Todas as etapas desta seção estão usando o IEF Sistema Ettan IGPhor. <ol><li> Configure as primeiras tiras IPG dimensão: os titulares de strip limpos com solução de limpeza tira e depois lave com água Milli-Q, deixar de cabeça para baixo para secar. Atribua a cada amostra para um número compartimento de gel. </li><li> Coloque a amostra a partir da etapa de reidratação na segunda área mais ampla do - end (). Use uma pinça limpa para puxar tiras de gel de embalagens. Retire camada protetora a partir de tiras de gel. Linha tiras lado áspero para baixo em um movimento lento, deslizando para conseguir as tiras molhadas ao longo do caminho de (-) ao final (+) final. </li><li> Coloque papel absorvente úmido com água esterilizada em cima do eletrodo e sob as tiras de gel para evitar o cansaço. Enxágüe pinças em-entre os rounds com água purificada e etanol. Remova todas as bolhas, sobrepor levemente com óleo mineral para evitar saídas secos. Alinhe os detentores tira de gel na máquina. </li><li> Executar 12 horas a 20 ° C durante rehydração, 1 hora a 200 V, 1 hora a 500 V, 1 hora a 1000 V, 0,5 horas a 4000 V, 12 horas a 8000 V, 24 hr espera a 300 V, e pode ser retirado no momento. </li><li> Após IEF é terminado, é recomendável realizar a electroforese de segunda dimensão em gel de SDS-poliacrilamida, a menos que a tira de IPG são congeladas a -80 ° C em Saran Wrap revestida com óleo mineral para análise futura. Alternativamente, a fim de evitar a formação de estrias ponto, devido ao acesso de DTT é possível incluir um segundo passo de equilibração do IPG tiras antes da segunda dimensão com um tampão que contém a iodoacetamida. </li></ol> 5. Segunda-dimensão SDS-poliacrilamida Eletroforese em Gel (dia 5) Todas as etapas desta seção estão utilizando o aparelho de eletroforese Ettan DALTsix. <ol><li> Para montar o aparelho de rodízio gel, limpar completamente todos os componentes e garantir que rodízio gel é o nível ea ligação de borracha cinza é lubrificado com gel de silicone. Coloque o busílis pretober rolha triangular na parte inferior. Em seguida, coloca alternadamente o separador e as placas de vidro com a placa de vidro mais curtos para a frente. Certifique-se que os separadores são na parte de trás e da frente. Preencha o espaço restante com as cargas (cerca de 5 folhas) de modo que o topo é plano. Coloque o painel frontal com a ponta vermelha do lado de fora. Use grampos para apertar cada lado e apertar os parafusos inferiores. </li><li> Preparar o gel: Adicionar 297,3 ml de Duracryl, (&#39;CUIDADO&#39; Duracryl é usar tóxico rosto escudos e luvas), 147 ml de tampão Tris 1,5 M pH 8,8, e 143,3 ml de água Milli-Q para um balão com ponta de vácuo contendo um barra de agitação. Coloque a tampa em cima e misturar a solução a uma velocidade moderada, com o vácuo por 20 minutos. O vácuo é utilizada para de-gás da solução. Fazer uma nova 10% de solução de persulfato de amónio (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g de APS a 2 ml de água Milli-Q. </li><li> Adicionando-se a mistura de gel para o rodízio de gel: Quando o vácuo é realizado adicionar 6 mL de 10% de dodecilsulfato de sódio (SDS, 228,38 g / mol)para a parede lateral do balão para evitar colocar mais bolhas na solução. Adicionar APS, mexa, adicione 0,25 mL de N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilenodiamina (TEMED, 116,20 g / mol) (&#39; CUIDADO &#39;Temed é usar inflamável rosto escudos e luvas) e agitar. </li><li> Despeje a mistura em gel de rodízio em gel através de um funil inserido na parte traseira do aparelho. Deitar-se a um centímetro abaixo da placa curta. Adicionar 1,5 mL de butanol saturado com água para a parte superior do gel e embrulhar topo com saran wrap para evitar a desidratação. Aguarde 1 hora para garantir a polimerização completa. </li><li> Verificando o gel: Quando o gel é feito (verifique o frasco), desmontar o rodízio gel por uma pia. Verifique se há integridade gel enquanto enxaguar as placas de vidro com água morna, não deixe a água entrar no prato. Despeje a butanol e lavar a parte superior do gel duas vezes com água para se livrar de butanol. Preencha o topo com água e deixe descansar novamente se os géis não são utilizados de imediato. </li><li> Preparação das tiras: Preparar a solução tampão de equilíbrio docongelador (6 M ureia, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% de SDS, 0,002% de azul de bromofenol). Isto pode ser previamente preparada e armazenada em alíquotas de 10 ml a -20 ° C. Dissolve-se 0,1 g de DTT a 10 ml de uma solução tampão de equilíbrio. Um tubo pode ser utilizado para duas tiras de IPG. Colocar os géis de face para baixo sobre a tira de tampão e deixar repousar durante 30 minutos. Lembre-se que final é qual. </li><li> Preparação da unidade de electroforese (aparelho de separação de 2-D): Adicionar 4,5 L de 1x tampão de electroforese (25 mM Tris Base de Dados [121,1 g / mol], de glicina 192 mM de [288,38 g / mol], e 0,1% w / v de SDS [288,38 g / mol]) para o tanque de funcionamento. Este tampão pode ser utilizada para um máximo de 3x. Vire a unidade de eletroforese em. Verifique o nível de água na máquina de refrigeração de água e encha-o com água, se ele é baixo. Ligue a máquina, o modo de imprensa para verificar a temperatura designado, que deve ser de 10 ° C. </li><li> Adicione 1 L de tampão de corrida e 2x 1 L de 1x de tampão de corrida e armazená-los, a 4 ° C. Certifique-selagem agarose solução: peso de 0,25 g de agarose dissolve-se em 50 ml de tampão 1x execução. Pulso por 15 segundos cada. </li><li> Configurando a unidade de Eletroforese: Use uma pinça para tirar cada faixa e remover o excesso de tampão em ambos os lados com papel toalha limpa. NÃO toque nas tiras. Deitar fora a água no topo do gel e alinhar o início de gel com tampão 1x execução. Use uma pinça limpa e coloque as tiras em cima da placa longa, com o lado do gel de frente para você. Adicionar tampão 1x às tiras para lubrificar. Tiras de slides ainda mais para baixo, usando tiras de plástico. Remova todas as bolhas entre a tira eo gel. </li><li> Adicionar solução de selagem de agarose para o topo da tira para selar. Repetir para o resto das tiras. Colocar as placas de vidro e contendo os géis em gel de berço inferior e no tanque de gel. Verifique se o nível de 1x tampão na câmara exterior é na linha de fundo designado antes de colocar a câmara superior diante. </li><li> Coloque a moldura para câmara de amortecimento superior em cima das placas de vidro e garantir que ele é tudo o way para baixo, pressionando a parte inferior para baixo. Utilizando um funil e adicionar o tampão de corrida 2x dentro da câmara superior para a linha do meio. Utilizando um funil e adicionar tampão de corrida 1x a câmara exterior, até atingir a linha de cima. Coloque a tampa em cima e ligar a unidade Eletroforese eo bloco de poder. </li><li> Correr durante a noite em 52 V, 96 mA, 5 W. Verifique se a corrente está indo, procurando por bolhas no fio de prata perto do topo. Executar o gel até o fio condutor é de 1 cm a partir do fundo. </li><li> As proteínas também podem ser analisados ​​utilizando-se os equipamentos e reagentes de outras empresas tais BioRad ou Hoefer, de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 6. Prata coloração dos géis para Gel Visualization (dia 5-6) <ol><li> Prepara-se uma solução da solução de 1 (800 ml de etanol, 200 ml de ácido acético, e 1000 ml de água Milli-Q da coifa em um balde de plástico). Solução é boa para 6 géis. Ligue todas as máquinas off e tirar toda a parte do meio da unidade de Eletroforese e puvai la em pia. Também colocou o carrinho branco na pia. Retire a bandeja superior contendo o tampão 2x execução. </li><li> Desmontar o aparelho e remover os geles a partir de placas de vidro em solução da solução 1. Os géis podem ser identificados por cortar cantos quando são removidas das placas de vidro, o número de cantos cortados correspondente à ordem de gel no rodízio. </li><li> Colocar o recipiente com a solução da solução e os géis em um balancim para, pelo menos, 1 hora a durante a noite a 4 ° C. </li><li> Transferir o gel para corrigir a solução 2 (20 ml de 50% de glutaraldeído, 600 ml de etanol, 5 g de tetrationato de potássio (302,46 g / mol), 136 g de acetato de sódio (82,03 g / mol), e água Milli-Q para 2.000 ml) e coloque em uma cadeira de balanço para 1 hora. </li><li> Lave os géis 4x durante 15 min cada em água Milli-Q. </li><li> Manchar os géis em solução de nitrato de prata (4 g de nitrato de prata (169,87 g / mol), 500 mL de formaldeído e água Milli-Q para 2000 ml) durante 30 minutos ou até de 48 h. </li><li> Lavar o gel para umamin em água Milli-Q. </li><li> Transferir a solução de revelador (60 g de carbonato de sódio (105,99 g / mol), 300 ml de formaldeído, 15 mg de tiossulfato de sódio (158,11 g / mol), e água Milli-Q para 2000 ml) durante 5-30 min, até o gel é corado. </li><li> Colocar o gel em solução de paragem (100 g de Tris-Base (121,14 g / mol), 40 ml de ácido acético, e água Milli-Q para 2000 ml) durante 10 min. </li><li> Para o armazenamento, a transferência dos géis para solução de glicerol (40 ml de glicerol ou de 400 ml, se o armazenamento a longo termo é desejável, e 1600 ml de água Milli-Q), durante 10 min e em seguida secá-los utilizando um secador de gel. </li><li> Gel pode ser visualizada após coloração usando sistemas de imagem, como um scanner / densitômetro, fotografada usando transiluminador de luz ou Gel imager. O software de análise de imagem, tal como PDQuest análise 2-D da BIORAD pode então ser utilizada para obter informação quantitativa e qualitativa de proteínas numa amostra. </li></ol> 7. Gel Prata Coloração para Análise Espectrometria de Massa </p&gt; <ol><li> Fixar os geles em metanol a 50%, e 5% de ácido acético durante 1 hora. </li><li> Lavar com metanol a 50% durante pelo menos 10 minutos a durante a noite. </li><li> Lavar 3x em água destilada durante 10 min. </li><li> Sensibilizar com tiossulfato de sódio a 0,02% (158,11 g / mol) 2x durante 15 min. </li><li> Lavar 3x em REFRIGERADA 3x água destilada durante 10 min. </li><li> Submerge gel em REFRIGERADA solução de nitrato de prata a 1% (169,87 g / mol), durante pelo menos 20 minutos a 1 hora a 4 ° C </li><li> Lavar 2x durante 1 min, com água destilada. Mude tabuleiro / balde. </li><li> Desenvolver em 0,04% de formaldeído em 2% de carbonato de sódio anidro (105.99 g / mol) e descartar quando fica amarelo muito rápido, tem três lotes e estar pronto para mudar a cada 5 min. </li><li> Lavar com ácido acético a 5%, em seguida, armazenar em ácido acético a 1%. </li><li> Enxágüe 1,5 ml tubos Eppendorf (para segurar obter ponto cut-outs) com USP etanol grau e secar ao ar antes de usar. </li><li> Fórceps limpos, lâminas de barbear e superfícies com 100% de metanol. </li><li> Spray de luvas e superfícies com etanol. </li><li> Pontos especiais de consumo em uma capela de fluxo ou área de ar limpo. As manchas podem também ser excisada utilizando um cortador de ponto automatizado. </li><li> Coloque-as em tubos e navio Eppendorf no gelo ou manter em frigorífico. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li><li>Velapati&#241;o, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+proteins+from+Burkholderia+pseudomallei+isolated+during+primary+and+relapsing+melioidosis.">Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis.</a> Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).</li><li>Chung, J. W., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+and+characterization+of+bacterial+factors+associated+with+Burkholderia+cenocepacia+survival+in+a+murine+host.">Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host.</a> Microbiology. 153, 206-214 (2007).</li><li>Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Public+health+assessment+of+potential+biological+terrorism+agents.">Public health assessment of potential biological terrorism agents.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).</li><li>Thon, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+protein+changes+during+platelet+storage+requires+complementary+proteomic+approaches.">Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches.</a> Transfusion. 48, 425-435 (2008).</li><li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+New+and+Emerging+Proteomic+Techniques.">In New and Emerging Proteomic Techniques.</a> Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).</li><li>Lopez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+silver+stain+and+SYPRO+Ruby+Protein+Gel+Stain+with+respect+to+protein+detection+in+two-dimensional+gels+and+identification+by+peptide+mass+profiling.">A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling.</a> Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Um método para a preparação de proteínas tem sido descrito que pode extrair a maioria das proteínas de Burkholderia com boa reprodutibilidade. Isto é demonstrado pela obtenção do mesmo perfil de proteína a partir de duas preparações independentes realizadas em dias diferentes, utilizando a mesma cultura bacteriana cresceu em LB ou caldo YEM como mostrado na Figura 1. Extração foi eficiente para as bactérias cultivadas em meio líquido, no entanto, não testei este método para as ...

A Burkholderia gênero compreende mais de 62 espécies, Gram-negativos isolados de uma ampla variedade de nichos, e é dividido em dois blocos principais 1,2. O primeiro grupo inclui humana, animal e organismos phytotrophic, ea maioria dos estudos têm-se centrado nas espécies patogênicas deste grupo devido à sua importância clínica. Os membros mais patogênicas são B. pseudomallei e B. mallei (que causa melioidosis e mormo respectivamente) 3,4 e patógenos oportunistas (17 espécies definidas do complexo Burkholderia cepacia, BCC) 5, que causam doença na fibrose cística (FC) e doença granulomatosa crônica (CGD) 1. O segundo grupo, com mais de 30 espécies não patogênicas, incluindo bactérias associadas a plantas ou com o meio ambiente, e são consideradas como potencialmente benéfica para o host 2. Numerosos complicações surgem frinfecção bacteriana om com os membros patogénicos do género Burkholderia, tais como a transmissão do agente patogénico entre pacientes, a propagação da doença e tratamento de falha, devido à resistência intrínseca ou adquirida aos antibióticos tornando difícil de eliminar, na maioria dos casos 6-9. Por conseguinte, obter uma compreensão mais clara da base para o estabelecimento de infecção bacteriana é vital para o tratamento de doenças causadas por estes organismos. A fim de obter informações sobre o estabelecimento da infecção, são necessárias amplas investigações sobre os componentes bacterianos associados à patogênese. Os estudos sobre a análise proteômica de organismos Burkholderia usando abordagens proteômicas descrito proteínas que têm sido implicados na patogênese bacteriana, bem como mudanças em seu proteoma perfis 10-16. Métodos de extração de proteínas utilizando sonicação e ciclos de congelamento e descongelamento em tampão de lise contendo alta concentration de ureia, tio-ureia em combinação com um detergente e anfólitos foi aplicado em Burkholderia estudos proteomic 10-13. Embora a ureia é bastante eficaz para a desnaturação da proteína, que pode estabelecer um equilíbrio em solução aquosa, com isocianato de amónio, que podem reagir com os grupos de aminoácidos, formando assim artefactos (reacção de carbamilação) 17. Portanto, recomenda-se a incluir anfólitos transportadores, que actuam como agentes de limpeza de cianato e evitar temperaturas superiores a 37 ° C 17. Além disso, para evitar qualquer interferência química de tampão de lise com a quantificação de proteínas, o mesmo tampão de lise pode ser usado para gerar a curva padrão, de modo que as amostras e os padrões têm a mesma base 10. Outras metodologias envolvem o uso de buffers alcalinas e detergentes com períodos de incubação de calor 17,18, no entanto estas condições podem induzir alterações no proteoma e alguns detergentes não são compatíveis com o proteomics aplicação a menos que medidas de remoção de detergente subsequentes são incluídos 17,18. Após extracção e quantificação adequada, a expressão da proteína global de cada proteína individual pode ser estudada usando abordagens tais como a proteómica bidimensional (2-D) de electroforese em gel. Esta técnica foi descrita pela primeira vez por O&#39;Farell 19 e consiste na separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico, por focagem isoeléctrica na primeira dimensão, e em seguida, de acordo com o seu peso molecular por electroforese em gel de acrilamida na segunda dimensão. Devido à sua resolução e sensibilidade, esta técnica é uma ferramenta poderosa para a análise e detecção de proteínas de fontes biológicas complexas 19,20. Esta técnica de separação está atualmente disponível em abordagens de proteína-centric com a grande vantagem de resolver isoformas da proteína causadas por modificações pós-transcricional ou processamento proteolítico. Alterações quantitativaspode ser detectada através da comparação da intensidade da mancha correspondente após a coloração do gel 20. No entanto, esta técnica não é adequada para a identificação de proteínas muito grandes, as proteínas de membrana, proteínas extremamente ácidas ou básicas e hidrofóbicos, e é uma técnica um tanto laboriosa e demorada 20. Novas abordagens peptídicos centrada (com base em gel não) que são mais robustas e objectivo tornar-se disponíveis e podem ser utilizados para a comparação quantitativa por diferenciais métodos de marcação de isótopos estáveis, tais como etiquetagem de cisteína por afinidade codificados por isótopos de marcação (ICAT) 21, e um grupo amino rotulagem por isótopo marcação de quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) 22. A utilização de uma única técnica proteômica pode dar informações insuficientes, portanto é necessário o uso de duas abordagens proteômicas complementares para a maioria das alterações que avaliam totalmente em proteoma. Contudo, a electroforese em gel 2-D é amplamente utilizado e pode ser aplicado como rotina quantitativo expressão de várias proteínas em organismos diferentes. Aqui nós descrevemos um extração de proteínas de células inteiras e 2-D procedimentos de eletroforese em gel de espécies de Burkholderia que foram adaptados e aperfeiçoados a partir das GE Healthcare 2-D Eletroforese princípios e métodos Handbook 80-6429-60AC 2004 ( <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a> ). A extracção da proteína foi realizada utilizando um batedor de talão com contas de vidro na presença de PBS contendo EDTA 5 mM (ácido etilenodiaminotetracético) e 1 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo). Este procedimento permite a quantificação de proteínas com degradação mínima e pode ser alterada por abordagens proteômicas como relatado anteriormente 15,23,24. Electroforese em gel de 2-D foi realizada utilizando 24 centímetros de comprimento imobilizadas pH 4-7 gradiente e as proteínas foram separadas de acordo com o seu ponto isoeléctrico. Em seguida, as proteínas foram separadas segundo a sua Molecular peso por gel de SDS-poliacrilamida. Além disso, foi descrito um método de coloração com prata para visualização de proteínas no local, e um método de coloração de prata, que é compatível com a análise de espectrometria de massa. Juntos, estes procedimentos podem permitir a identificação de proteínas importantes de espécies de Burkholderia que poderiam estar envolvidos na patogénese.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7626</td>
 <td>Toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A18-1</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS Buffer</td>
 <td>Bioscience</td>
 <td>R028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP118-500 </td>
 <td>toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass beads (0.1 mm)</td>
 <td>BioSpec Products</td>
 <td>11079101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21009-342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroBCA protein extraction kit</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>23235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-681-375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-D Clean-Up kit</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6484-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15505-050</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>17-1314-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>856126</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>176002-46</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Duracryl</td>
 <td>Proteomic Solutions</td>
 <td>80-0148</td>
 <td>Very toxic, carcinogen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP179-100</td>
 <td>Flammable, toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15524-010</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td>Acute toxicity, flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15510-027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>HC1100-1GL</td>
 <td>Flammable, toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A491-212</td>
 <td>Flammable, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutaraldehyde</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>G151-1</td>
 <td>Very toxic, corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium tetrathionate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2926</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium acetate</td>
 <td>EM Science</td>
 <td>7510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver nitrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>209139</td>
 <td>Corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>252549</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium thiosulfate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S7026</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>EMD</td>
 <td>9230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>808831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>800688</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A412-4</td>
 <td>Flammable, toxic, health hazard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium carbonate anhydrous</td>
 <td>EMD</td>
 <td>SX0400-3</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral oil</td>
 <td>ACROS</td>
 <td>415080010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JA-20 ultracentrifuge rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>334831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini Beadbeater</td>
 <td>Biospec Products</td>
 <td>3110BX</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6505-03</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6485-27</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

total protein extraction and 2-d gel electrophoresis methods for burkholderia species

A investigação dos níveis de proteínas intracelulares de espécies de bactérias é de grande importância para a compreensão dos mecanismos patogênicos de doenças causadas por estes organismos. Aqui, descrevemos um processo para a extracção de proteínas a partir de espécies de Burkholderia baseado em lise mecânica com esferas de vidro na presença de ácido tetra-acético de etilenodiamina e de fluoreto de fenilmetilsulfonilo em tampão fosfato salino. Este método pode ser usado para diferentes espécies de Burkholderia, para diferentes condições de crescimento, e é provavelmente apropriada para a utilização em estudos de proteomas de outras bactérias. Após a extracção de proteínas, uma (2-D) técnica de eletroforese em gel de proteômica bidimensional é descrito para estudar mudanças globais nos proteomas desses organismos. Este método consiste na separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico, por focagem isoeléctrica na primeira dimensão, seguido de separação com base no peso molecularpor electroforese em gel de acrilamida na segunda dimensão. A visualização das proteínas separadas é realizada por coloração com prata.

Análise comparativa dos perfis de proteínas extraídas da mesma cultura bacteriana em duas ocasiões diferentes mostraram padrões semelhantes de bandas indicando extração de proteínas de sucesso. Proteínas de peso molecular extraídos variou 10-150 kDa. Figura 1 mostra representativa coloração com Coomassie azul do gel as extracções de proteínas de células inteiras a partir de multivorans Burkholderia (um membro da BCC) isolados clínicos crescidos em LB ou levedura / Manitol (YEM)...

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Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Membros do género Burkholderia são patógenos de importância clínica. Nós descrevemos um método para extração de proteínas bacterianas, usando ruptura mecânica, e eletroforese em gel 2-D para a análise proteômica subseqüente.

Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espécies

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

total-protein-extraction-2-d-gel-electrophoresis-methods-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

28.9K visualizações.  University of British Columbia.  Membros do género Burkholderia são patógenos de importância clínica. Nós descrevemos um método para extração de proteínas bacterianas, usando ruptura mecânica, e eletroforese em gel 2-D para a análise proteômica subseqüente. 

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A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

Um Procedimento de 1,5 horas para a Identificação de Enterococcus Espécies Diretamente de hemoculturas

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Imunologia e Infecção

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Vigilância da gripe aviária com FTA Cards: Métodos de campo, de Biossegurança, e questões de transporte Resolvido

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Dois métodos de formação de heterocários Descobrir Fatores de restrição HCV

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectam Galinhas

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Dissecando a proteínas multi sinalização complexos pela purificação da afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de

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