この作品は、（BV）はブリティッシュコロンビア大学からの学生の身分および嚢胞性線維症カナダ、（DPS）は健康の研究のカナダの協会からの補助金によって支えられている。私たちは、プロトコルの初期準備のためにジャクリーンチョンに感謝します。

1。培養増殖（日1 2） <ol><li>一晩37℃の回転装置で、スナップトップ15ミリリットルチューブにルリア·ベルターニ（LB）ブロス3ミリリットル：スターターカルチャーを育てる。 OD 0.6の600に一晩成長を希釈します。 250mlのエルレンマイヤーフラスコ中のLBブロス100mlにこの希釈液1mlを加える。バッチ培養においては、より良好な近似のために、固定相（SP）内に16時間、250rpmで振盪しながら37℃でインキュベートし、感染条件等のrpoS、クォーラムのような固定相信号因子の制御下で、その細菌の病原性因子を確実にするために検出、発現される。あるいは、初期のSPまたは中期又は後期対数期で増殖させた細菌は、細菌の適応期についての情報を得るために使用することができる。 </li><li> 16時間後、OD 600を測定し、文化が同一条件下で以前に構築成長曲線と比較することによって、SPに達していることを確認してください。 </li></ol> 2。タンパク質抽出（3日目） <ol><li&gt;一晩冷蔵庫にあらかじめすべてのメディアとソリューションを冷やす。すべての手順は、アイスバケット内チューブを用いて実施されるべきである。 Prechill微量とベックマン·コールター高性能遠心分離機（または同等品）を4℃にし、内側の回転子（ローター= JA-20、遠心分離機= J2-HS）。 </li><li>新鮮な0.1Mのフッ化フェニルPMSF（ &#39;注意&#39;のPMSFは、ユースフェイスシールドと手袋、有毒で腐食性のある）である（ &#39;注意&#39;アセトンアセトン1ml中の0.0174グラムを溶解することにより、アセトン（PMSF、174.19グラム/モル）の溶液を調製毒性や可燃性）フェイスシールドと手袋を使用しています。 </li><li> 0.1ミリリットルの0.1MのPMSF、0.5M EDTAを0.1ミリリットル、およびPBSを9.8ミリリットル：PBS / EDTA / PMSFソリューションを構成する。 16時間の文化のODをチェックし、それが、SPであるべき場所程度である。 </li><li>細菌培養の35ミリリットルを取り、4℃で20分間4500×gでオークリッジ遠心管と遠心分離機に文化を転送</li><li>廃棄物容器に上清を除去し、冷却されたPBSを35ミリリットルを加え、ペレットを再懸濁。 4℃で20分間4500×gで再び遠心分離</li><li>冷PBS 1mlに再懸濁上清を取り除きます。 4℃で14,000×gで微量で高い上2ミリリットルエッペンドルフ遠心1分を無菌への転送削除し、上清を捨てる。 </li><li> PBS / EDTA / PMSF溶液1 mLを加え2 mlのペレットを、転送が約0.5 mlのガラスビーズ（滅菌済み）を含む（Oリング付き）スクリューキャップ付試験管に懸濁する。冷室で1分間、4℃でガラスビーズとビーズのbashこれらを含むチューブに再懸濁ペレットを追加します。各BASH後に氷上でサンプルを入れて、この3回行います。 </li><li>微量での1分間の14,000×gで遠心分離する。上清を除去し、滅菌5ミリリットルのポリスチレンチューブに入れて。 </li><li>収率は同じチューブにPBS / EDTA / PMSF溶液1mlを加え高めるために再びガラスビーズを含んでいる。 1分間4℃でビーズBASHチューブ。この2Xは氷のAFにサンプルを入れてくださいTERの強打。遠心分離器に1分間14,000×gで遠心分離し、上清を除去し、ステップ2.8から上清に追加。ポリスチレンチューブから新しい滅菌2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに上清を1ミリリットルの注射器および0.20μmのフィルターを使用してください。 </li><li>この時点でサンプルが必要になるまでは200μgのピアースマイクロBCAタンパク質抽出キット、アリコートが-80℃で凍結する必要があります使用して、タンパク質の量についてアッセイされるべきである。 </li></ol> 3。サンプル調製（4日目） <ol><li> 25ミリリットル補水のストック溶液を調製（8 M尿素、2％CHAPS、2％IPGバッファー、ブルー0.002％ブロモフェノール）-20℃および2.5ミリリットル分量を保存する7mgのジチオスレイトール（DTT、154.2グラム/モル）を再水和のストック溶液2.5mlアリコートに使用直前に追加します。 </li><li>プロセスは、ステップ3.1で作成補水原液を450μLの最後の再懸濁したキットを2次元クリーンアップ使用してステップ2.10からサンプルを解凍した。 </li></ol> 4。最初のフォーカシング次元等電点電気泳動（IEF）（4日目） このセクションのすべての手順がたEttan IGPhor IEFシステムを使用している。 <ol><li>ストリップ洗浄液できれいなストリップ保有した後、ミリQ水で洗浄し、乾燥させるために上下逆さまのまま：IPG最初の次元のストリップを設定します。ゲルストリップホルダー番号に各サンプルを割り当てます。 </li><li> （ - ）から2番目のより広い領域での再水和ステップからサンプルをロードします。パッケージの外にゲルストリップを引っ張ってきれいな鉗子を使用してください。ゲルストリップから保護層を取り出します。 （+）端から端 - （）の行は、からの道に沿って湿ったストリップを得るために、ゆっくりとスライド運動でダウン粗い面を取り除きます。 </li><li>バーンアウトを防ぐために、電極の上に、ゲルストリップの下に滅菌水で湿らせた吸い取り紙を置きます。精製水とエタノールとのラウンドの間に、ピンセットを洗浄します。すべての気泡を除去するドライアウトを防止するためにミネラルオイルを薄く重ねる。マシン上のゲルストリップホルダーを並べる。 </li><li> rehyd 20℃で12時間を実行配給、8000 Vで4000 Vで200 Vで1時間、500 Vで1時間、千Vで1時間、0.5時間、12時間は、24時間は300 Vで保持し、この時点で取り出すことができる。 </li><li> IEFが終了した後IPGストリップは、将来の分析のためにミネラルオイルで被覆されたサランラップで-80℃で凍結されていない限り、それは、二次元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことが推奨される。代替的に、DTTによるアクセスポイントへのストリーキングを回避するために、それはIPGはヨードアセトアミドを含有する緩衝液で前に第二次元にストリップの第二の平衡工程を含むことが可能である。 </li></ol> 5。二次元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（5日目） このセクションのすべての手順がたEttan DALTsix電気泳動装置を使用しています。 <ol><li>ゲルキャスター装置を組み立てるために、徹底的にすべてのコンポーネントをきれいにしていることを確認したゲルキャスターレベルであり、結合灰色のゴムはシリコンゲルで潤滑されている。黒の摩擦を入れる底部の三角形のストッパーBER。その後、交互に正面を向いてガラスの短い板をセパレータとガラス板を配置します。セパレータは表裏にあることを確認してください。フィラー（約5枚）で、残りのスペースを埋めるため、トップが平坦である。外側に赤いチップを用いてフロントパネルを置く。各側面を締めと下のネジを締めクランプを使用してください。 </li><li>ゲルの準備：含む真空先端をフラスコに、（ &#39;注意&#39; Duracryl有毒用フェイスシールドと手袋である）、トリス緩衝液、1.5MのpHは8.8、およびミリQ水143.3ミリリットルの147ミリリットルをDuracrylの297.3ミリリットルを追加します。攪拌棒。上部のふたを入れて、20分間の真空で、中程度の速度で溶液を混合する。真空は、溶液を脱ガスするために使用される。ミリQ水2mlに、APSの0.2グラム：過硫酸アンモニウム溶液（APS、218.8グラム/モル）の新鮮な10％​​にする。 </li><li>ゲルキャスターにゲル混合物を添加する：真空が完了したら、10％ドデシル硫酸ナトリウムを6ml（SDS、228.38グラム/モル）を添加フラスコの側に溶液中でより多くの気泡を入れないようにします。 、APSを追加炒め、0.25ミリリットル、N、N、Nを追加 &#39;、N&#39;-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED、116.20グラム/モル）（&#39;注意 &#39;TEMEDが可燃用フェイスシールドと手袋です）と攪拌する。 </li><li>装置の背面に挿入された漏斗を通してゲルキャスターにゲル混合物を注ぐ。ショートプレートの下インチまで注ぐ。ゲルの上に水飽和ブタノール1.5ミリリットルを加え、脱水症状を避けるために、サランラップでトップを包む。フル重合を確実にするために1時間を待ちます。 </li><li>ゲルが終了したら（フラスコを確認してください）​​、シンクによってゲルキャスターを分解：ゲルのチェック。温水でガラス板を洗浄しながら、ゲルの整合性をチェックし、水がプレートを入力することができません。ブタノールを注ぐ、ブタノールを取り除くために水で2回ゲルの上部をすすぐ。再び水でトップを満たし、ゲルはすぐに使用されていない場合は放置します。 </li><li>ストリップを製造する：から平衡化緩衝液を調製する冷凍庫（6 M尿素、75mMのトリス-HCl、8.8、29.9％SDS、0.002％ブロモフェノールブルー）。これは-20℃で予め調製し、10ミリリットルずつに保存することができ平衡化緩衝液10mlに0.1gのDTTを溶解する。一本のチューブは、2つのIPGストリップを使用することができる。バッファにダウンストリップ面のゲルを置き、30分間放置します。これはどちらの端を覚えておいてください。 </li><li>電気泳動ユニット（2-D分離装置）を調製する：1×泳動緩衝液（25mMトリス塩基[121.1グラム/モル]、192 mMのグリシン[288.38グラム/モル]、および0.1重量/容量％SDS [288.38 4.5 Lを追加走行タンクへg /モル]）。このバッファは、3回まで使用することができる。電気泳動装置の電源を入れます。水冷マシン内の水位を確認し、それが低ければ水でそれを埋める。 10℃であるべきである指定された温度をチェックするためにプレスモード、マシンの電源を入れ</li><li> 2Xランニングバッファー1リットルとバッファを実行しているの1X 1リットルを加えて、4℃で保管しagarosの重量0.25グラム：アガロースシーリングソリューションを作るEおよび1Xランニングバッファー50mlに溶解する。 15秒ごとのパルス。 </li><li>電気泳動装置の設定：各ストリップを取り出し、清潔な紙タオルで両側に余分なバッファを削除するためにピンセットを使用してください。ストリップに触れないでください。ゲルの上に水を捨て、1×ランニングバッファーでゲルトップを並べる。清潔なピンセットを使用し、ゲル側が手前に向けて、長いプレートの上部にストリップを配置。それを潤滑するストリップに1Xバッファーを追加します。さらに下にプラスチック製のストリップを使用して、ストリップをスライドさせます。ストリップとゲルの間にあるすべての気泡を除去。 </li><li>それを密封するためにストリップの上部にアガロースシーリングソリューションを追加します。ストリップの残りの部分についても同じ手順を繰り返します。ゲル槽にゲルクレードルと下にゲルを含有するガラス板を置きます。外室に1Xバッファレベルを確保するために、上部チャンバーに入れる前に指定された一番下の行にある。 </li><li>ガラス板の上に上部バッファーチャンバーフレームを置き、それがすべてのWAであることを確認一番下の押下により、Yダウン。漏斗を使用して、中央の行まで上室に2倍のランニングバッファーを追加します。漏斗を使用して、一番上の行に到達するまで、外室に1Xランニングバッファーを追加します。上部の蓋を置き、電気泳動装置とパワーパックをオンにします。 </li><li> 、52 Vで一晩96ミリアンペア、5 W.電流は上部近くの銀線上に気泡を探すことによって起こっているかどうかを確認して実行します。大手行が下から1cmになるまで、ゲルを実行します。 </li><li>タンパク質はまた、製造業者の説明書に従って、機器や他の企業、例えばBIORAD又はホーファーからの試薬を用いて分析することができる。 </li></ol> 6。ゲルの可視化のためのゲルの銀染色（日5-6） <ol><li> （プラスチック製バケツに800ミリリットルのエタノール、200ミリリットルの酢酸、およびヒュームフード内のミリQ水1000ml）定着液1を準備します。溶液を6ゲルに適しています。すべてのマシンの電源をオフにして、電気泳動装置およびPUの全体中央部分を取り出すシンクでそれを事前にチェック！また、流しに白いスタンドを置く。ランニングバッファー2Xを含むトップトレイを引き出します。 </li><li>装置を分解し、固定液1にガラス板からゲルを取り除く。ゲルは、それらがガラス板から除去されるときに角部を切断することによって同定することができる、角の数は、キャスター中のゲル順序に対応する切断。 </li><li>少なくとも1時間に4℃で一晩のためにロッカー上定着液やジェルの入った容器を置きます</li><li> 50％グルタルアルデヒド、600mlのエタノール、四チオン酸カリウム5gの（302.46グラム/モル）、酢酸ナトリウム（82.03グラム/モル）、およびミリQ水136 gの溶液2（20ミリリットルを固定するためにゲルを転写2000ミリリットル）、1時間ロッカー上に置きます。 </li><li>ゲルはミリQ水で15分間ずつ4倍洗う。 </li><li> 30分、または最大48時間、硝酸銀溶液（2000ミリリットルの硝酸銀（169.87グラム/モル）、ホルムアルデヒドを500μl、およびミリQ水の4グラム）でゲルを染色する。 </li><li> 1用の洗浄ジェル分Milli-Q水である。 </li><li> 5〜30分間（2,000 mlの炭酸ナトリウムを60g（105.99グラム/モル）、ホルムアルデヒド300μlを、チオ硫酸ナトリウム（158.11グラム/モル）の15 mgの、およびミリQ水）現像剤溶液に転送されるまでゲルを染色する。 </li><li> 10分間（2000ミリリットルにTris塩基（121.14グラム/モル）、酢酸40ミリリットルの100グラム、およびミリQ水）停止液にゲルを置く。 </li><li> （長期保存が所望される場合、グリセロールまたは400 mlの40ミリリットル、およびミリQ水1,600 ml）を記憶するために、グリセロール溶液にゲルを転写で10分間、次いでゲル乾燥機を使って乾燥させる。 </li><li>ゲルは、光トランスイルミ又はゲルイメージャーを用いて撮影されたスキャナ/濃度計などの撮像システムを用いて染色した後に可視化することができる。そのようなBIORADからPDQUEST 2-D解析などの画像解析ソフトウェアは、サンプル中のタンパク質の定量的および定性的情報を得るために使用することができる。 </li></ol> 7。質量分析のためのゲル銀染色</P&gt; <ol><li> 50％メタノール中でゲルを固定し、1時間5％酢酸。 </li><li>一晩に少なくとも10分間、50％メタノールで洗浄する。 </li><li> 10分間蒸留水3Xで洗う。 </li><li> 15分間、0.02％チオ硫酸ナトリウム（158.11グラム/モル）の2倍に増感する。 </li><li> 10分間冷蔵蒸留水の3倍で洗って3倍。 </li><li> 4℃で1時間、少なくとも20分間冷蔵1％硝酸銀溶液（169.87グラム/モル）でゲルを沈める</li><li>蒸留水で1分間洗浄2X。トレイ/バケットを変更します。 </li><li> 2％の炭酸ナトリウム、無水0.04％ホルムアルデヒド（105.99グラム/モル）で開発し、それは非常に迅速な黄色になる際に捨て、3つのバッチを持っており、5分毎に変更する準備ができて。 </li><li> 1％酢酸に保管し、次いで5％酢酸で洗浄する。 </li><li>使用前にUSPグレードのエタノールと空気乾燥で1.5ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブ（スポットカットアウトを取得し保持する）をすすぐ。 </li><li> 100％メタノールできれいに鉗子、かみそりの刃と表面。 </li><li>エタノールで手袋の表面をスプレー。 </li><li>流フードやきれいな空気領域内の物品のスポット。スポットはまた、自動スポットカッターを用いて切除することができる。 </li><li>氷上でエッペンドルフチュー​​ブや船に入れたり、冷蔵庫に保管してください。 </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+and+characterization+of+bacterial+factors+associated+with+Burkholderia+cenocepacia+survival+in+a+murine+host.">Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host.</a> Microbiology. 153, 206-214 (2007).</li><li>Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Public+health+assessment+of+potential+biological+terrorism+agents.">Public health assessment of potential biological terrorism agents.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).</li><li>Thon, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+protein+changes+during+platelet+storage+requires+complementary+proteomic+approaches.">Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches.</a> Transfusion. 48, 425-435 (2008).</li><li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+New+and+Emerging+Proteomic+Techniques.">In New and Emerging Proteomic Techniques.</a> Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).</li><li>Lopez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+silver+stain+and+SYPRO+Ruby+Protein+Gel+Stain+with+respect+to+protein+detection+in+two-dimensional+gels+and+identification+by+peptide+mass+profiling.">A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling.</a> Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

タンパク質の調製のための方法は、再現性よくバークホルデリアタンパク質の大部分を抽出することができることが記載されている。これは、 図1に示すように、LB又はYEMブロス中で増殖させた同一の細菌培養物を使用して、異なる日に実施された2つの独立した調製物から同一のタンパク質プロファイルを得ることによって実証される。しかし我々はプレート上で増殖させ...

バークホルデリア属以上 62種、ニッチの広い範囲から単離されたグラム陰性菌を含み、それは、2つの主要なクラスター1,2に分割される。最初のクラスタは、ヒト、動物およびphytotrophic生物を含み、ほとんどの研究は、それらの臨床的重要性は、この群の病原性種に焦点を当てている。最も病原性のメンバーはBである。疽菌とB （それぞれ類鼻疽及び鼻疽を引き起こす） 鼻疽菌 3,4および嚢胞性線維症（CF）および慢性肉芽腫症（CGD）の病気を引き起こす日和見病原体5（バークホルデリア·セパシア複合体、BCCの17定義された種）、1。 30以上の非病原性の種と第二のクラスタは、植物が、環境に関連する細菌が含まれており、ホスト2に対して潜在的に有益であると考えている。 数多くの合併症はFRをemergeこのような理由例6-9のほとんどで根絶するのは難しいことの抗生物質に固有または獲得抵抗性の患者、病気の蔓延や治療の失敗の間に病原体の伝達などのバークホルデリア属の病原性メンバーとOM細菌感染。そのため、細菌感染の確立のための基礎をより明確に理解を得ることは、これらの生物によって引き起こされる疾患の治療に不可欠である。感染の確立への洞察を得るために、病因に関連する細菌成分について鋭意検討が必要とされている。プロテオミクスアプローチを用いてバークホルデリア生物のプロテオーム解析に焦点を当てた研究は、細菌病因に関与ならびにそれらのプロテオームの変化は10-16プロファイルされているタンパク質を記載している。 高濃を含む溶解緩衝液中で超音波処理および凍結融解サイクルを用いてタンパク質抽出法尿素のentration、洗剤および両性電解質と組み合わせた尿素は、 バークホルデリアプロテオミクス研究10-13に適用されている。尿素は、タンパク質変性のための非常に効率的であるが、それによって（カルバミル化反応）アーティファクト17を形成し、アミノ酸基と反応することができるイソシアン酸アンモニウムを用いて水溶液中で平衡を確立することができる。したがって、シアン酸捕捉剤として機能するキャリア両性電解質を含み、かつ37℃で17以上の温度を避けることをお勧めします。さらに、タンパク質の定量化と溶解緩衝液の任意の化学的干渉を防止するために、同一の溶解緩衝液は、試料および標準は、同じ背景10を有するように、標準曲線を作成するために使用することができる。他の方法は、熱の潜伏期間17,18とアルカリ性の緩衝液や洗剤の使用を含む、しかし、これらの条件は、プロテオームの変化を誘発する可能性があり、いくつかの界面活性剤は、PRと互換性がありませんoteomicsアプリケーションは、その後の界面活性剤除去工程は、17,18が含まれている場合を除きます。 適切な抽出および定量化の後、各々のタンパク質の全体的なタンパク質発現は、二次元（2-D）ゲル電気泳動のようなプロテオミクスアプローチを用いて研究することができる。この技術は、第一、第二次元におけるアクリルアミドゲル電気泳動によってそれらの分子量に応じてその後O&#39;Farell 19で説明した第一の次元で等電点電気泳動による等電点に係るタンパク質の分離にある、とした。 、その分解能と感度に、この技術は、複雑な生物学的供給源19,20からのタンパク質の分析と検出するための強力なツールです。この分離技術は、転写後の修正またはタンパク質分解処理によって引き起こされるタンパク質のアイソフォームを解決する大きな利点をもつタンパク質中心のアプローチでは、現在提供されています。量的変化ゲル20の染色後、対応するスポットの強度を比較することによって検出することができる。しかし、この技術は、非常に大きいタンパク質、膜タンパク質、極端に塩基性および酸性または疎水性タンパク質の同定に適していない、やや面倒で時間のかかる技法20である。より堅牢かつ客観利用可能になると、このようなタグ付け同位体コード親和性（ICAT）21によるシステイン標識、及びアミノ基のような差動安定同位体標識法によって定量的比較のために使用することが可能である新規ペプチド中心のアプローチ（非ゲルベース）相対と絶対定量（のiTRAQ）22用のタグ付け同位体で標識する。シングルプロテオミクス技術の使用は、十分な情報を与えるかもしれない、したがって二つの相補的なプロテオミクスアプローチの使用は、プロテオームの中で最も完全な評価の変更が必要である。それにもかかわらず、2-Dゲル電気泳動は、広く使用され、日常的に定量するために適用することができる異なる生物においていくつかのタンパク質の発現をtitative。 ここでは、全細胞タンパク質の抽出およびGEヘルスケア2次元電気泳動原則と方法ハンドブック80から6429-60AC 2004から適応し、最適化したバークホルデリア属のための2次元ゲル電気泳動の手順を説明します（ <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a> ）。タンパク質抽出を、5mMのEDTA（エチレンジアミン四酢酸）及び1mMのPMSF（フッ化フェニルメチル）を含有するPBSの存在下でガラスビーズをビーズビーターを用いて行った。この手順では、最小限の劣化によるタンパク質の定量化を可能にし、これまでに報告15,23,24などのプロテオミクスアプローチの修正可能です。 2-Dゲル電気泳動を24 cmの長さに固定化pHを4-7勾配およびタンパク質を用いて行ったが、その等電点に従って分離した。その後、タンパク質は、それらのmolecに従って分離されたSDS-ポリアクリルアミドゲルによってウラル重さ。さらに、我々は、タンパク質スポットを視覚化するための銀染色法、および質量分析のために互換性のある銀染色法を記載した。一緒に、これらの手順は、病因に関与し得るバークホルデリア種からの重要なタンパク質の同定を可能にすることができる。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7626</td>
 <td>Toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A18-1</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS Buffer</td>
 <td>Bioscience</td>
 <td>R028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP118-500 </td>
 <td>toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass beads (0.1 mm)</td>
 <td>BioSpec Products</td>
 <td>11079101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21009-342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroBCA protein extraction kit</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>23235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-681-375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-D Clean-Up kit</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6484-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15505-050</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>17-1314-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>856126</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>176002-46</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Duracryl</td>
 <td>Proteomic Solutions</td>
 <td>80-0148</td>
 <td>Very toxic, carcinogen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP179-100</td>
 <td>Flammable, toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15524-010</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td>Acute toxicity, flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15510-027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>HC1100-1GL</td>
 <td>Flammable, toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A491-212</td>
 <td>Flammable, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutaraldehyde</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>G151-1</td>
 <td>Very toxic, corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium tetrathionate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2926</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium acetate</td>
 <td>EM Science</td>
 <td>7510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver nitrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>209139</td>
 <td>Corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>252549</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium thiosulfate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S7026</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>EMD</td>
 <td>9230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>808831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>800688</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A412-4</td>
 <td>Flammable, toxic, health hazard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium carbonate anhydrous</td>
 <td>EMD</td>
 <td>SX0400-3</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral oil</td>
 <td>ACROS</td>
 <td>415080010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JA-20 ultracentrifuge rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>334831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini Beadbeater</td>
 <td>Biospec Products</td>
 <td>3110BX</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6505-03</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6485-27</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

total protein extraction and 2-d gel electrophoresis methods for burkholderia species

細菌種の細胞内タンパク質レベルの調査は、これらの生物によって引き起こされる疾患の発症機序を理解するために重要である。ここでは、リン酸緩衝生理食塩水、エチレンジアミン四酢酸及びフェニルメチルスルホニルフルオリドの存在下でガラスビーズを用いた機械的溶解に基づいて、 バークホルデリア種からのタンパク質抽出のための手順を記述している。この方法は、異なる増殖条件のために、異なるバークホルデリア種のために使用することができ、それは、他の細菌のプロテオミクス研究に使用するのに適している可能性が高い。タンパク質抽出に続いて、二次元（2-D）ゲル電気泳動プロテオーム技術がこれらの生物のプロテオームのグローバル変化を研究するために記載されている。この方法では、分子量に基づいて分離を行い一次元で等電点電気泳動による等電点に応じてタンパク質の分離、で構成されています第二次元におけるアクリルアミドゲル電気泳動による。分離されたタンパク質の可視化は銀染色によって実施される。

2別の機会に同じ細菌培養から抽出したタンパク質プロファイルの比較解析が成功したタンパク質抽出を示す同様のパターンバンディングを示した。抽出された高分子量のタンパク質は、10〜150 kDaの範囲であった。 バークホルデリアmultivoransから全細胞タンパク質抽出の1に示す代表的なクマシーブルー染色ゲル（BCCの部材） 図1bまたは酵母/マンニトール（YEM?...

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Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

バークホルデリア属のメンバーは、臨床的に重要な病原体である。我々は、機械的破壊、およびその後のプロテオーム解析のための2-Dゲル電気泳動を用いて、全細菌タンパク質抽出するための方法を記載している。

全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための<em&gt;バークホルデリア</em&gt;種

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

total-protein-extraction-2-d-gel-electrophoresis-methods-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

28.9K ビュー.  University of British Columbia.  バークホルデリア属のメンバーは、臨床的に重要な病原体である。我々は、機械的破壊、およびその後のプロテオーム解析のための2-Dゲル電気泳動を用いて、全細菌タンパク質抽出するための方法を記載している。 

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A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

の識別のための1.5時間の手順腸球菌</em直接血液培養から>種

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

免疫・感染学

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

フィールドメソッド、バイオセーフティ、および交通の問題解決：FTAカードによる鳥インフルエンザのサーベイランス

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル<em&gt;ハマダラカ</em&gt;属。

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like receptor myeloid differentiation primary response gene 88 (TLR-MyD88) signaling pathway. IRF5 activation involves phosphorylation, dimerization, and subsequent translocation from the cytoplasm into the nucleus, which in turn induces the gene expression of various pro-inflammatory cytokines. A detection assay for IRF5 activation is essential to studying IRF5 functions and its relevant pathways. This article describes a robust assay to detect endogenous IRF5 activation in the CAL-1 human plasmacytoid dendritic cell (pDC) line. The protocol consists of a modified nondenaturing electrophoresis assay that can distinguish IRF5 in its monomer and dimer forms, thus providing an affordable and sensitive approach to analyze IRF5 activation.

A native Western blot method for analyzing endogenous interferon regulatory factor 5 dimerization in the CAL-1 plasmacytoid dendritic cell line is described. This protocol can be applied to other cell lines as well.

内因性IRF5ダイメネレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like ...