Este protocolo ha sido desarrollado en colaboración con los miembros anteriores del McGinnis Lab, Kim A. Maza y José C. Pearson. Damos las gracias a los constantes esfuerzos realizados por el Bloomington Drosophila Stock Center por su trabajo de organizar y distribuir las reservas de valor. Este trabajo fue apoyado por la financiación de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM077197 y K12 GM68524) y la familia de Herbert Stern. MTJ es compatible actualmente con número de concesión 5G12RR003060-26 del Centro Nacional de Recursos para investigación y número de subvención 8G12MD7603-27 del Instituto Nacional de Salud para Minorías y Disparidades de Salud. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Salud para Minorías y Disparidades en Salud o de los Institutos Nacionales de Salud.

El protocolo de la herida embrionario de Drosophila se puede resumir en cinco pasos: (1) Colección de Embriones, (2) Preparación de Embriones (3) Embryo hiriente, (4) La microinyección de embriones, y (5) Fijación de Embriones. 1. Embrión Collection <ol><li> Recoger las moscas adultas, 2-3 días después de eclosing, añadir 50 hembras y 25 machos de una jaula de recogida de embriones. </li><li> Coloque un agar jugo de manzana fresca, más la placa de levadura cada mañana durante 3 días. Notas: Para la recolección óptima de embriones, ciclo de las moscas en un horario diurno de 12 horas en una incubadora a 25 ° C (05:00 luminosos &quot;en&quot; y 17:00 las luces &quot;OFF&quot;); moscas hembras responden a los cambios en el ciclo de luz y depositará una mayor cantidad de huevos durante un interruptor de las luces de &quot;ON&quot; a las luces &quot;OFF&quot; 10,11. </li><li> En la tarde del Día-3, coloque un jugo de manzana fresca, más placa de agar de levadura en la jaula y recoger los embriones durante 2 horas. Coloque una nueva placa de la levadura en la jaula y guardar el2 plato de la colecta hr. </li><li> Guarde la placa de recogida para una 14 horas adicionales a 25 ° C para envejecer los embriones. Notas: La curación de heridas se puede ensayar en cualquier momento durante el desarrollo de Drosophila, los reporteros de la transcripción inducida por la herida que se describen en este documento tienen una actividad óptima entre las etapas 12 15 al 16. A finales de la etapa 17, el embrión es demasiado viejo para perforar fácilmente la cutícula maduración y activar de manera eficiente a los reporteros de la herida o detectar la transcripción inducida por lesión. Para permitir que el tiempo de recogida y el tiempo de las heridas que se produzcan durante las horas pico de laboratorio, seguimos un horario de recogida de embriones durante 2 horas (16:00-18:00), el intercambio de la placa de colección con una nueva placa a las 18:00, la edad la placa de recogida a 25 ° C durante 14 horas (durante la noche), y terminó los embriones a las 08:00 (día siguiente). </li></ol> 2. Preparación de embriones Notas: Este protocolo incluye el uso de muchas herramientas y objetos que son agudas o hechos de gmuchacha. Maneje todos los objetos punzantes y objetos de vidrio con cuidado para evitar lesiones personales. <ol><li> Retire con cuidado los embriones a partir de placas de recolección con un pincel añadiendo 2.3 ml de agua a la placa y el remolino. Transferencia de agua y embriones de la placa de malla de nylon y tubo de recogida. </li><li> Añadir 4-5 ml de lejía a la tapa de una placa de placa de Petri de plástico y empapar el extremo de malla de cubierta del tubo de recogida que contiene los embriones en lejía durante 2 min; que elimina la cáscara de huevo exterior del embrión. Gire manualmente el tubo de extracción de un par de veces para evitar que los embriones se agrupen en el blanqueo. Enjuague los embriones con 10x de agua y seque el tubo de recogida de cubiertas de malla que contiene los embriones dechorionated sobre una toalla de papel. </li><li> Utilice una aguja de disección para transferir ~ 50 embriones a partir de malla de nylon a una placa de agar. Añadimos colorante verde a la placa de agar para añadir contraste y la ayuda en la alineación del embrión. Bajo un microscopio de disección, hacer dos filas paralelas de ~ 25 embriones, alineando la embryOS en la diapositiva para que puedan estar en ángulo recto con respecto a la aguja de punción en el aparato de microinyección. Deja un poco de espacio (aproximadamente 1 longitud del embrión) entre los embriones con fines de intercambio de gases. Las dos filas paralelas deberían ser de aproximadamente 5 mm. </li><li> Coloque una diapositiva con cinta adhesiva doble en la parte superior de los embriones alineados y presione con cuidado el portaobjetos para transferir los embriones de la placa de color verde a la diapositiva. Luego de aire secar los embriones ~ 25 min para reducir la presión interna en el embrión y evitar una explosión cuando la herida. </li><li> Ponga 2-3 gotas de aceite de mezcla de halocarbonos en los embriones para evitar una mayor deshidratación. </li></ol> 3. Embrión Herir <ol><li> Colocar el portaobjetos del embrión en la platina del microscopio de la inyección. Encuentra los embriones en el campo de visión y la práctica de mover la platina del microscopio invertido. Notas: Antes de trabajar con la aguja, se centran en el plano medio de embrión a lo largo del eje dorsoventral. Para permitir la herida eficiente de laembriones alineados, comienzan hiriendo a la fila más cercana al aparato de aguja. Mover la etapa de llevar la parte superior de la fila de embriones alineados en el campo de visión. </li><li> Coloque con cuidado y asegurarse una aguja tirado en el soporte de la aguja. Utilice el micromanipulador para mover la aguja hacia abajo, hacia la diapositiva. Alinear la aguja con el embrión, en mismo plano focal. Una vez que la aguja está en el enfoque con el embrión, no mueva la aguja con el micromanipulador. </li><li> Mueva la platina para perforar el embrión hasta la médula, a continuación, pasar a la siguiente embrión en la fila. Cuando termine hiriendo a la primera fila, utilice el micromanipulador para mover la aguja completamente hacia arriba y fuera de los escenarios antes de mover la diapositiva; girar manualmente la corredera 180 ° y terminó la segunda fila. </li><li> Guarde los embriones menores de aceite de halocarbono a temperatura ambiente y proceder a la fijación de embriones si haciendo hibridación in situ o tinción de anticuerpos (véase el paso Procedimiento 5). Alternativamente, almacenar los embriones de 4-6 horasbajo aceite de halocarbonos y proceder con visualización fluorescente reportero transcripcional de la herida (resultados representativos). Notas: Para la visualización de la reportero fluorescente, que anestesian los embriones utilizando 50% de 1-fenoxi-2-propanol 13. Los embriones se retiran de la aceite de halocarbono y se colocan en una nueva diapositiva. Ponemos cuentas de vidrio alrededor de los embriones, añadimos unas gotas de anestésico, y colocamos un cubreobjetos sobre los embriones. </li></ol> 4. Microinyección de embriones Notas: El aparato de microinyección que usamos en el protocolo no está automatizado para entregar volumen específico durante el ensayo. Añadimos un colorante a la solución para visualizar la microinyección y tratar de normalizar el volumen entregado. Si se inyecta demasiada solución en el embrión, la membrana vitelina estallará. <ol><li> Aguja de carga de la parte trasera con 1 l de solución química más tinte (por ejemplo, 0,6 MH 2 O 2). Permitir capilaracción para dibujar la solución química a la punta de la aguja. </li><li> Para romper una aguja, coloque una hoja de la cubierta a un ángulo en un portaobjetos y cubrir el borde con la mezcla de aceite de hidrocarburo halogenado. Llevar la aguja montada en el foco con el borde de la hoja de la cubierta inclinada y suavemente mover borde hoja de la cubierta a través de la punta de la aguja hasta que se rompa. Aplique presión sobre el aparato de microinyección y comprobar que la solución química más medio de contraste fluye a la aguja. </li><li> Coloque la diapositiva que contiene los embriones alineados en la platina del microscopio. Proceder para enfocar el embrión y la aguja en el mismo plano. Simultáneamente perforar y solución química microinyectar además de teñir en cada embrión. Notas: agujas obstruidos producen con frecuencia; romper una aguja nueva para evitar la microinyección incompleta. Una punta de la aguja roma no hiere tan limpiamente como una punta de la aguja en ángulo. Ajuste del cubreobjetos a un no-ángulo de 90 ° durante la rotura es óptimo para producir una punta de la aguja en ángulo. </li></ol> 5. Fi Formaldehídojación Notas: Los productos químicos utilizados en esta fijación Drosophila son perjudiciales. Use el equipo de protección personal (por ejemplo, guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad) al manipular los productos químicos. Siga las pautas institucionales individuales para la eliminación de productos químicos regulados. <ol><li> Después de herir, esperar 15, 30, 60, o más minutos para la activación transcripcional de los genes inducidos por la herida que se produzca. Para eliminar los embriones a partir de diapositivas de inyección, escurrir con cuidado la mezcla de aceite de halocarbonos de las diapositivas, la diapositiva apoyarse contra un estante y borra el extremo con un Kimwipe. </li><li> Utilice una pipeta de vidrio para enjuagar heptano sobre el portaobjetos y lávelo el líquido de enjuague en una placa de Petri de vidrio. Heptano se disolverá la cinta y liberar los embriones. Continuar enjuagando hasta que todos los embriones se retiran de la diapositiva. Pase a la siguiente diapositiva, hasta que todos los embriones se extraen a partir de diapositivas. </li><li> Transferir el heptano plus solución embrión desde el plato de cristal en una ciencia 20 mlvial ntillation. Agitar el vial durante 2-3 minutos, retire el heptano y añadir 5 ml de heptano fresco. </li><li> Añadir 5 ml de solución fresca, fijación (véase la lista de reactivos para la receta). Se tapa el vial y se unen a un agitador de plataforma orbital. Agitar el vial que contiene los embriones durante 25 minutos a 220-230 rpm. </li><li> Después de agitar, dejar que las burbujas en el pop interfaz. Retire completamente la fase inferior, acuosa con una pipeta, evitando tirar los embriones. La capa inferior consiste en la solución de fijación y que deberá eliminarse adecuadamente. </li><li> Añadir 5 ml de metanol, tapar el frasco y agitar con fuerza a mano durante 20-30 segundos, remolino y colocarlo en su lugar. Heridos embriones permanecerán en la interfase y no hundirse hasta el fondo. Notas: Después de la fijación de la membrana vitelina de un embrión no herida normalmente ráfaga durante la etapa de deshidratación con metanol. Sin embargo, la membrana vitelina en un embrión de herida ya está rota y la etapa de deshidratación no se eliminará el memb vitelinarane. Se requiere mano-devitellinzation para completar el protocolo de fijación. </li><li> Retire con cuidado y la capa de heptano superior a continuación, añadir 5 ml de metanol fresco. Agitar el vial y los embriones deben hundirse. </li><li> Retire la solución de metanol más embrión con una pipeta de transferencia de vidrio y recoger en un tubo de recogida de malla de nylon en un plato de cristal. </li><li> Retire el metanol y enjuague los embriones con solución PBS 1x. </li><li> La transferencia de los embriones de la malla de nylon a una placa de jugo de manzana. Extender los embriones a cabo a lo largo de la superficie de la placa. </li><li> La transferencia de los embriones a un portaobjetos de vidrio cinta adhesiva doble. Cubra los embriones con 1x PBS. Notas: Los embriones tienden a agruparse debido a la membrana vitelina. El uso de un lugar de jugo de manzana permite la separación rápida de los embriones amontonados. Los embriones deben ser retirados de la placa y se transfieren a un portaobjetos de vidrio cinta adhesiva doble porque los embriones se hunden en la placa de agar cuando se aplica fuerza para quitar el embrión a partir de lamembrana vitelina. </li><li> Empuje con cuidado los embriones con una aguja de disección para &quot;pop&quot; de la membrana vitelina. El embrión debe hundirse en el PBS. </li><li> Usar una pipeta de vidrio para transferir el PBS 1x además de los embriones a un tubo de 1,5 ml. Enjuague los embriones con 1x PBS y se almacena a 4 ° C. Proceder a deshidratar los embriones utilizando un etanol: la serie de PBS y continuar con la hibridación in situ o protocolo immunolocalization 14. </li></ol>

<ol>
	<li>Germeraad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+in+Drosophila+by+microinjection+of+DNA.">Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA.</a> Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).</li><li>Payre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+epidermis+differentiation+in+Drosophila.">Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).</li><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li><li>Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epidermal+barrier+wound+repair+pathway+in+Drosophila+is+mediated+by+grainy+head.">An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head.</a> Science. 308 (5720), 381-385 (2005).</li><li>Ting, S. B., Caddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+Drosophila+grainy+head+is+essential+for+epidermal+integrity+in+mice.">A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice.</a> Science. 308 (5720), 411-413 (2005).</li><li>Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, &. #. 2. 1. 6. ;., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+transcription+factor+codes+activate+epidermal+wound-response+genes+in+Drosophila.">Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).</li><li>Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+in+Drosophila+melanogaster+uncovers+a+novel+set+of+genes+required+for+embryonic+epithelial+repair.">Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair.</a> Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).</li><li>Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+UAS-RNAi+screen+in+Drosophila+larvae+identifies+wound+closure+genes+regulating+distinct+cellular+processes.">A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes.</a> Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).</li><li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duox,+Flotillin-2,+and+Src42A+are+required+to+activate+or+delimit+the+spread+of+the+transcriptional+response+to+epidermal+wounds+in+Drosophila.">Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila.</a> PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).</li><li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+light+condition+modification+on+the+circadian+rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+Drosophila+melanogaster.">Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).</li><li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+photoperiod+ld+12:12+of+Drosophila+melanogaster.">Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster.</a> Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).</li><li>Pierre, S. E., Thurmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyBase+101+-+the+basics+of+navigating+FlyBase.">FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase.</a> Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).</li><li>Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Phenoxy-2-propanol+is+a+useful+anaesthetic+for+gastropods+used+in+neurophysiology.">1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology.</a> J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846 (2004).</li><li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Drosophila+transgenic+reporters:+insulated+P-element+vectors+expressing+fast-maturing+RFP.">New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP.</a> BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Casso, D., Ram&#237;rez-Weber, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster.">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).</li><li>Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+proteolytic+pathway+activation+reveals+an+expanded+ensemble+of+wound+response+genes+in+Drosophila.">Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila.</a> PloS one. 8 (4), e61773 (2013).</li><li>Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+melanogaster+embryonic+hemocyte+migrations.">Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations.</a> J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).</li><li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response.">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).</li><li>Repiso, A., Berganti&#241;os, C., Corominas, M., Serras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+repair+and+regeneration+in+Drosophila+imaginal+discs.">Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs.</a> Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).</li><li>Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+transdetermination+in+Drosophila+imaginal+discs.">Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs.</a> Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Una respuesta reguladora de la transcripción inmediata a las señales externas permite a las células para coordinar una respuesta localizada a estímulos extracelulares, que puede incluir el estrés, daños, o infección. El control inadecuado de una respuesta localizada puede tener efectos dañinos en las células vecinas, así como una pérdida de recursos para reparar la lesión. El embrión de Drosophila es un excelente sistema para realizar experimentos básicos de cicatrización de heridas en una de mantener, fácil organismo modelo barato y. El potencial para la colaboración entre la investigación en otros organismos modelo y Drosophila ofrece una oportunidad única para explorar las muchas cuestiones biológicas. Una técnica adicional de los reporteros de la herida es la combinación genética de mutantes antecedentes, proporcionar un método eficiente para probar la contribución de nuevos genes a la activación de la vía de respuesta epidérmica de la herida. Tenemos transcripcionales epidérmicas herida inducida available tanto en la 2 ª y 3 ª cromosomas 5. En este estudio utilizamos UAS GAL4 y sistemas de sobreexpresión 16. En los estudios con alelos mutantes letales determinamos los antecedentes genéticos usando un cromosoma equilibrador fluorescente, por ejemplo Kruppel-GFP 17. Hemos analizado la localización reportera herida en varias bases genéticas (Tabla 1). Una posible modificación de la técnica es combinar la microinyección y heridas. La microinyección se puede utilizar para introducir una solución química en el embrión. Varios compuestos químicos se han probado y se encontró que regular la actividad de los reporteros de la herida epidérmica 9. Este método de la herida y la microinyección simultánea puede ser útil para aumentar el número de células en el embrión de Drosophila que responde una señal de la herida y se puede utilizar directamente para controlar los cambios de expresión génica después de la herida 18. Una aplicación en el futuro de la técnica de microinyección será probar nuevos productos químicos para la regulación de la respuesta epidérmica de la herida. Drosophila como sistema modelo para estudios genéticos ofrece una amplia gama de protocolos sencillos para abordar eficazmente las cuestiones complejas. Los recientes informes sobre la viabilidad de las técnicas de Drosophila destaca el uso de la migración hemocyte 19 y la infección avispa parásita 20 como medio para ampliar aún más el impacto de la comunidad de investigación de Drosophila. Además de los estudios de la reparación de heridas, Drosophila proporciona un modelo clásico para la regeneración con el sistema de disco imaginal 21,22. Los avances en los estudios combinados de regeneración del disco imaginal y heridas de punción / microinyección ofrece un excelente sistema para descubrir los componentes bien conservados de la reparación de tejidos.

La manipulación de embriones de Drosophila utilizando una técnica de microinyección es un ensayo bien establecido-1. La importancia del método reportero respuesta epidérmica herida es combinar el protocolo para la punción / microinyección con reporteros fluorescentes y visualizar una respuesta in vivo a la lesión epidérmica en embriones de Drosophila. El objetivo de este método es permitir un conjunto más amplio de los científicos a utilizar Drosophila como herramienta para investigar los procesos que regulan la respuesta transcripcional a la lesión de punción epidérmica. La epidermis de una sola capa en Drosophila proporciona un sistema sencillo para estudiar la respuesta epidérmica de la herida después de haberse pinchado 2. El embrión de Drosophila es un sistema de modelo sólido para diseccionar genéticamente las etapas de la reparación de heridas, incluyendo la respuesta de la herida, la inflamación, y la reepitelización 3. Esto es en parte debido a que muchos o la mayoría cigóticos mutantes sobreviven hasta el final de embryogeneses y desarrollar barreras epidérmicas, incluso cuando los patrones de desarrollo va profundamente mal. Caracterización anterior de un factor de transcripción de cabeza Granulado bien conservada (GRH), identificaron que los genes Grh objetivo Dopa descarboxilasa (DDC) y la tirosina hidroxilasa (PLE) son transcripcionalmente activados alrededor de los sitios de lesión 4. Drosophila como organismo modelo para la respuesta de la herida proporciona una línea complementaria de la investigación para avanzar en los estudios de cicatrización de las heridas de mamíferos 5. Estudios posteriores han identificado genes adicionales herida inducida Drosophila y desarrolló una &quot;caja de herramientas&quot; de muchos periodistas de la herida fluorescentes para monitorizar la respuesta in vivo herida epidérmica a limpiar hiriendo a 6. Informes recientes sobre la regulación de la cicatrización de heridas Drosophila se han centrado en el fenotipo de cierre de la herida, lo que permite el descubrimiento de muchas vías que regulan la migración celular 7,8. Con el análisis de lalos reporteros de la herida fluorescentes, nuestros estudios han identificado un nuevo conjunto de genes necesarios para la expresión localizada de la epidermis genes inducible por lesión 9. Uno de los méritos del método reportera herida respuesta es que los resultados proporcionan una visión más clara en un mecanismo de cómo las señales son transducidas desde el lugar de la lesión a las células vecinas. Sin embargo, una de las desventajas del método reportera herida respuesta es que los resultados no se vinculan directamente a fenotipos en la curación o la reparación de heridas. Utilización más amplia del protocolo punción herida limpia en pantallas genéticas y químicas permitirá nuevos reguladores de la respuesta transcripcional a epidérmica hiriendo a identificarse y además la traducción de cicatrización de heridas descubrimientos en modelos de mamíferos de los tratamientos de lesiones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">yeast</td>
			<td style="width:124px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">51475</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">apple juice</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-824-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenoxy-2-propanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">toluidine blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, 16%</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18814-20</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H360-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-899-90013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:121px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila incubator</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fly cage</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">embryo collection tube</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>46-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">double-stick tape</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissection needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-965A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass cover slip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4445</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">capillary needle</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microinjection needle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MINJ4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Primo-Vert</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-063-172</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">transfer bulb</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scintillation vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-259-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser scanning confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fixation solution</td>
			<td>(5 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% formaldehyde</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td></td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Halocarbon oil mix</td>
			<td>(10 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in drosophila embryos.

El embrión de Drosophila se desarrolla una capa epidérmica robusta que sirve tanto para proteger las células internas de un entorno externo duro, así como para mantener la homeostasis celular. Lesión de la punción con agujas de vidrio proporciona un método directo para desencadenar una respuesta rápida de la herida epidérmica que activa reporteros transcripcionales de la herida, que puede ser visualizado por una señal del informador localizada en embriones o larvas vivas. Punción o láser lesión también proporciona señales que promueven la contratación de hemocitos a la zona de la herida. Sorprendentemente, severa (a través de y a través de) la lesión de punción en embriones de etapa tardía sólo rara vez se interrumpe el desarrollo embrionario normal, como mayor que 90% de tales embriones heridos sobreviven a la edad adulta cuando los embriones se inyectan en un medio de aceite que minimiza la fuga inmediata de hemolinfa a partir de los sitios de punción . El procedimiento de la herida requiere la micromanipulación de embriones de Drosophila, incluyendo la alineación manual de los embriones en agplacas ar y la transferencia de los embriones alineados con microscopio. El ensayo de respuesta epidérmica herida de Drosophila proporciona un sistema rápido para poner a prueba los requisitos genéticos de una variedad de funciones biológicas que promueven la curación de heridas, así como una manera de detectar compuestos químicos potenciales que promueven la cicatrización de heridas. El corto ciclo de vida y la rutina de cultivo fácil hacer Drosophila un organismo modelo de gran alcance. Drosophila cicatrización de la herida limpia aparece para coordinar la respuesta regenerativa de la epidermis, con la respuesta inmune innata, en formas que todavía están bajo investigación, lo que proporciona un excelente sistema para encontrar conservada reglamentario mecanismos comunes para Drosophila y las heridas de la epidermis de los mamíferos.

Para obtener los resultados mostrados en este método, el marco de lectura abierto de la proteína fluorescente verde (GFP) se fusiona a un / secuencia potenciadora herida inducida por el promotor de dopa descarboxilasa (DDC) y DsRed se fusiona a una secuencia de promotor de la herida de la tirosina hidroxilasa ( plo) 4,6. En un embrión de Drosophila en vivo, la maduración de la proteína fluorescente reportero herida es óptima 4-6 horas después de la herida, lo que permite tiempo para la acumulación de proteína suficiente para visualizar, así como el tiempo para la proteína fluorescente para oxidar al estado fluorescente 15. Para observar la localización reportero, un microscopio de fluorescencia compuesto es suficiente. Para observar un mayor aumento de la localización reportero, un microscopio confocal es óptima para generar una proyección máxima de múltiples secciones ópticas (Figura 1). Confocal de imágenes in vivo de embriones de Drosophila se complica por el RAondulaciones pid del embrión. . Una vista completa del embrión se puede obtener con 20X objetivo y una vista de primer plano de emplazamiento de la herida se puede obtener con objetivo 40X. Una vista superior de la epidermis reportera herida de localización se pueden obtener imágenes con 10 secciones ópticas 1μm sucesivas. Una vista lateral de la epidermis reportera herida de localización se pueden obtener imágenes con 40 sucesivas 1 micras secciones ópticas. El uso de métodos de cruzamiento genético estándar, es posible combinar los reporteros de la herida con mutaciones genéticas. Un ejemplo se presenta en este documento es Flotillin-2 (Flo-2), ya que los mutantes de ganancia de función (sobreexpresión generada con expresión ubicua en todas las células) la pérdida de función (alelo nulo generada con la inserción del elemento P) y de FLO-2 demuestran el producto del gen Flo-2 es necesaria y suficiente para inhibir la localización de la DDC-GFP de heridas reporteros 9 (Figuras 2A y 2B). Uso de la millascroinjection protocolo, es posible probar si la introducción de soluciones químicas superactivates o inhibe la localización de los reporteros de la herida. Embriones Químicamente heridos-resultaron heridos y se inyecta con una proporción de 1:4 de toluidina al 1% de colorante azul y compuestos solubilizados simultáneamente. Azul de toluidina colorante permitido para la confirmación visual de compuestos solubilizados que se inyecta en la cavidad del cuerpo. Control de embriones fueron heridos con una aguja rota que contiene una relación 1:4 de toluidina al 1% de colorante azul y soluto sin química. Dos ejemplos presentados en este documento son el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) y metil-β-ciclodextrina (MβCD), debido a que ambas soluciones químicas son suficientes para activar globalmente la localización de la DDC-GFP herida reporteros 9 (Figuras 2C y 2D) . El peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) se diluyó en H 2 O y 0,6 M. metil-β-ciclodextrina (MβCD) se solubilizó en 1 mM de NaOH a 3 mM. Utilizando el protocolo de fijación embrión, es posible detectar la activación de la transcripción de genes de respuesta de la herida en un dominio localizado, que rodea a un sitio de la herida. Un ejemplo que se presenta en este trabajo es la hibridación in situ de sondas de ARN para detectar Ddc y transcripciones ples 4,6,9 (Figuras 3A y 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. DDC-GFP y ple-DsRed hieren reportero localización. Campo claro y las imágenes fluorescentes en los embriones de tipo salvaje heridos. (A) con mejor vista del DDC-GFP reportero de heridas. (B) con mejor vista de ple-DsRed hieren reportero. Todas las imágenes se recogieron en un microscopio confocal Leica SP2, con 20X objetivo. Las flechas marcan el sitio de la herida. Las líneas discontinuas en el panel de datoss marcan los contornos de los embriones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. La localización de la reportera Ddc-GFP heridas en mutantes antecedentes genéticos y químicos microinyectado embriones. Claro y imágenes fluorescentes de heridos Flotillin-2 (Flo-2), los embriones mutantes. (A) Pérdida de la función de Flo-2 {} KG00210 mutantes, expansión de la actividad de reportero a través de todas las células epidérmicas. (B) Ganancia de la función de Flo-2 (armadillo-GAL4, UAS-Flo2) mutantes, la inhibición de la actividad del indicador a lo largo de todas las células de la epidermis. (C) El peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) microinyección solución, la expansión de reporter actividad a lo largo de todas las células epidérmicas. (D) metil-β-ciclodextrina (MβCD) microinyección solución, la expansión de la actividad del indicador a lo largo de todas las células epidérmicas. Todas las imágenes se recogieron en un microscopio confocal Leica SP2, con 20X objetivo. Las flechas marcan el sitio de la herida. Las líneas discontinuas en los paneles de datos marcan los contornos de los embriones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. Detección de la respuesta de la herida transcripciones de ARN de genes. Imágenes fluorescentes de hibridación in situ y la detección de ARN en embriones de tipo salvaje heridos. DDC (A) y plo (B) las transcripciones de ARN se acumulan alrededor del sitio de la herida. Todas las imágenes fueron colecciónted en un microscopio confocal Leica SP2, con objetivo de 20X. Las flechas marcan el sitio de la herida. Las líneas discontinuas en los paneles de datos marcan los contornos de los embriones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Tabla 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tabla 1. Resumen de los reporteros de respuesta epidérmica herida. Inserciones de los cuatro periodistas de respuesta de la herida (DDC, ple, msn, KKV) están disponibles en la segunda y tercera cromosomas. Todos los periodistas de respuesta herida activar el gen fluorescente (GFP o DsRed) en un número limitado de células epidérmicas que rodean el lugar de la lesión de punción en la de tipo salvaje de fondo (por ejemplo, el fenotipo &quot;local&quot;). Ddc y msn herida reporteros de respuesta requieren Grh para la activación de la FLUORESCENgen ce después de la lesión de punción (por ejemplo, &quot;ninguno&quot; fenotipo). Todos los periodistas de heridas requieren Flo-2 para la localización del gen de fluorescencia después de la lesión de punción (por ejemplo, el fenotipo &quot;global&quot;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos. at JoVE.com

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

La epidermis de embriones de fase muy tardía embriones de Drosophila ofrece un sistema in vivo para el análisis de la respuesta herida de punción rápida y se pueden combinar con las manipulaciones genéticas o tratamientos químicos de microinyección para avanzar los estudios en la curación de heridas para la traducción en modelos de mamíferos.

Microinyección de Heridas Ensayo y<em&gt; In vivo</em&gt; Localización de la herida epidérmica Reporteros de respuesta en<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

12.3K vistas.  The City College of New York.  La epidermis de embriones de fase muy tardía embriones de Drosophila ofrece un sistema in vivo para el análisis de la respuesta herida de punción rápida y se pueden combinar con las manipulaciones genéticas o tratamientos químicos de microinyección para avanzar los estudios en la curación de heridas para la traducción en modelos de mamíferos. 

Video: Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Investigación

Bioingeniería

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Entrega y transfección de genes en células humanas de cáncer de páncreas con factor de crecimiento epidérmico receptor dirigidos a base de gelatina Nanovectors Ingeniería

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos de microfluidos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Y pez cebra

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

La cuantificación de la función diastólica por Global Análisis basado en Modelado cinemático de flujo transmitral mediante el formalismo de llenado diastólico parametrizada

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of cutaneous wound healing on the skin. Existing methods, however, still rely on visual inspections through various microscopic tools and devices that normally include high-cost, sophisticated systems and require well trained personnel for operation and data analysis. Here, we describe methods and protocols to fabricate a conformal, skin-like electronics system that enables conformal lamination to the skin surface near the wound tissues, which provides recording of high fidelity electrical signals such as skin temperature and thermal conductivity. The methods of device fabrication provide details of step-by-step preparation of the microelectronic system that is completely enclosed with elastomeric silicone materials to offer electrical isolation. The experimental study presents multifunctional, biocompatible, waterproof, reusable, and flexible/stretchable characteristics of the device for clinical applications. Protocols of clinical testing provide an overview and sequential process of cleaning, testing setup, system operation, and data acquisition with the skin-like electronics, gently mounted on hypersensitive, cutaneous wound and contralateral tissues on patients.

This article presents methods to fabricate and characterize a conformal, skin-like electronic system and protocols for the use in clinical applications, particularly on cutaneous wound management.

Fabricación y caracterización de un sistema electrónico conforme de la piel-como para la gestión cuantitativa, cutánea de la herida

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

El estudio de la estequiometría de factor de crecimiento epidérmico en células intactas utilizando microscopía correlativa

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Órgano Cultura Modelo Murino del disco intervertebral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rígida fijación de fijo y manchados, todo, escala milimétrica muestras para histología sin sección 3D de tomografía Micro computada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...