Name: methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans
Uploaded: 2014-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans at JoVE.com

Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

Los siguientes protocolos describen el procedimiento detallado para C. piel elegans hiriendo y para analizar las respuestas de la herida. 1. Aguja hiriente 3,4 <ol><li> Crecer gusanos unstarved saludables en placas con E. estándar NGM (medio de crecimiento de nematodos) bacterias coli OP50 como alimentos, mantenidos en una incubadora a 20 °. NOTA: Los métodos para placas de agar NGM y el cultivo de rutina de C. elegans se puede encontrar en www.wormbook.org 6. </li><li> Escoja 25 L4 etapa gusanos a un recién sembrado placa 1 día antes de herir y de la cultura a 20 ° CO / N. </li><li> Antes de herir, tire agujas de los capilares utilizando un extractor de aguja. Las agujas utilizadas en la herida son idénticos a los utilizados para la microinyección de C. elegans. </li><li> Asegúrese de que todos los gusanos están en etapa adulta joven. Colocar la placa de gusanos en hielo durante aproximadamente 30 min. El enfriamiento provoca que los animales sean lentos, facilitando heridas aguja. <br /&gt; NOTA: A 5 minutos de la salida de los hielos, los gusanos comenzarán a moverse con normalidad. Es posible, pero difícil de la herida gusanos en movimiento. Con la experiencia, 5 min es suficiente tiempo para heridas 25 gusanos. Inmovilizar con fármacos como el levamisol (como se usa en heridas láser, ver más abajo), aunque los animales tardan más en recuperarse. </li><li> Retire la placa de agar del hielo a un microscopio estereoscópico de disección. Usando una selección gusano, mover 25 gusanos en el centro de la placa de agar. </li><li> Coloque la aguja en una punta de pipeta 100 l para mantener más fácilmente la aguja. Perforar la parte anterior o posterior del cuerpo del gusano con la aguja, evitando la gónada. En general, tratar de la herida entre la faringe posterior y anterior de las gónadas, o entre la gónada posterior y el recto. Reutilice las agujas muchas veces, hasta que se rompen. NOTA: Asegúrese de que las heridas son breves, pinchazos suaves que perforan la cutícula y la piel, penetrando ~ 5-10 micras en el animal. La aguja debe entrar en el animal aproximadamente a un ángulo recto a la piel. Las heridas no deben causar daños evidentes a los órganos internos, o ruptura inmediata del cuerpo. Observar una pequeña cantidad de citoplasma que rezuma durante unos segundos después de la herida; Sin embargo, si el contenido celular de fugas a lo largo de un tiempo prolongado los animales no sobrevivirán. Para imágenes óptima, la herida del sincitio lateral epidérmico (hyp7) o la costura lateral. Nota: Este procedimiento incluye el uso de una aguja de cristal. </li><li> Permitir que los gusanos se recuperen a TA entonces la cultura a 20 ° C. Juzgar el éxito de la herida de la aguja por una serie de ensayos descritos a continuación. Más del 95% de los animales de tipo salvaje sobrevive 24 horas después de la aguja hiriendo en la etapa adulta joven. El efecto de herir en larvas o adultos mayores que aún no ha sido ampliamente analizado. </li></ol> 2. Láser Heridas 3 Utilice la irradiación láser de femtosegundo (800 nm) para realizar las heridas más preciso. <ol><li> Preparar p agaranuncios en un portaobjetos de vidrio derretido con agar al 2% 7. Asegúrese de que las almohadillas son similares a las pastillas de agar utilizados para imágenes en vivo de C. elegans. </li><li> Transfiera 10 gusanos adultos jóvenes en la almohadilla de agarosa con recogida gusano, y añadir una gota 2 l de 12 mM solución Levamisol. Cubra los animales y el líquido con una hoja de la cubierta. Espere 1-2 minutos para que los gusanos paralizan. </li><li> Colocar el portaobjetos en un microscopio confocal de disco giratorio. Mueva el escenario para encontrar los gusanos y se centran en la parte anterior o posterior sincicial epidermis laterales con un objetivo 100X (NA 1,4 a 1,46). </li><li> Ajustar la potencia del láser de femtosegundo a 140 mW (medido antes de que el objetivo). Utilizar el láser de femtosegundos a una velocidad de repetición de 80 MHz. NOTA: Dos pulsos de 200 ms cada uno (separados por 20 ms) son suficientes para herir en nuestras manos. </li><li> Centrarse en la superficie apical de la célula epidérmica y la herida de la epidermis. Observe interrupción local del citoplasma (burbujeo), o o blanqueo localesf cualquier marcador fluorescente usada. NOTA: Siga los procedimientos de seguridad láser apropiadas cuando se utiliza el láser de femtosegundo. Línea o un punto de exploraciones mediante rayos láser de femtosegundos, como los de dos microscopios de fotones deben proporcionar suficiente energía para herir láser. NOTA: Si bien no tenemos experiencia directa de la utilización de otros láseres, en principio herida debe ser posible el uso de láser UV convencionales (como se usa en C. elegans ablaciones celulares). Opcionalmente, utilice un FRAP (FRAP) Módulo de hilado confocal de disco para herir la epidermis (N. Pujol, comunicación personal). </li></ol> 3. Visualización de Respuestas epidérmico Ca 2+ a heridas <ol><li> Utilice transgénico C. elegans cepas que expresan Ca 2+ sensores (tales como los de la serie GCaMP) en la epidermis, bajo el control del promotor específico de epidérmica adulto col-19 (Figura 1A; transgenes se enumeran en <strong&gt; Tabla 1). Utilice un transgén que expresa una proteína fluorescente de color rojo tales como tdTomato como un control interno para el nivel de expresión de los transgenes. NOTA: Hemos utilizado tdTomato como control interno para la expresión transgénica como fluorescencia tdTomato epidérmica es relativamente estable y no interfiere con imágenes GCaMP. </li><li> Tanto la aguja y el láser hiriendo gatillo Ca 2+ elevación en la epidermis. Sin embargo, como la herida de la aguja no se puede realizar fácilmente en un disco giratorio confocal, heridas láser es preferible para el análisis cuantitativo de la Ca 2 + respuesta (Figura 1). </li><li> Adquirir imágenes de lapso de tiempo en el modo de adquisición multidimensional (tiempo de intervalo de 2 segundos con 114 ms exposición láser de excitación) utilizando un confocal hilado disco con objetivo de 100X (NA 1,4 a 1,46) y conjuntos de filtros adecuados (filtros GFP trabajarán para GCaMP3). NOTA: Adquirir imágenes de lapso de tiempo cada 30 segundos durante aproximadamente 2 horas para examinar el Ca 2+ respOnse a hiriendo a más de un curso de tiempo más largo. </li><li> El uso de software de análisis de imágenes medir la fluorescencia media GCaMP en diez regiones equivalentes de interés (ROI), cinco de los cuales se centran en el citoplasma de las células epidérmicas y cinco en el fondo. </li><li> Obtener la fluorescencia de línea de base (F 0) por un promedio de fluorescencia en 5 ROIs en la epidermis luego restando la media de 5 ROIs en el fondo antes de la lesión. Expresar el cambio en la fluorescencia Delta F como la relación de cambio con respecto a la línea de base [(F t -F 0) / F 0]. </li></ol> 4. Visualización de Dynamics F-actina después de la herida <ol><li> NOTA: En respuesta a heridas de la aguja, observar un anillo de actina en el sitio de la herida que se cierra poco a poco alrededor de la herida. Esta sección protocolo ensayos de cierre de la herida mediante la medición del diámetro del anillo de actina. </li><li> Generar gusanos transgénicos que expresan un marcador de F-actina como el dominio de unión a actina moesina Drosophila fusionado aGFP, expresa bajo el control de un promotor específico epidérmico tales como col-19 (Figura 2A) (transgén juIs352). NOTA: Hemos obtenido resultados similares utilizando otros marcadores vinculante de dominio como Lifeact o F-tractin (resultados no publicados) actina. </li><li> Realizar aguja hiriendo en P col-19- gusanos transgénicos-GFP moesina. Después de las heridas de aguja, observar un anillo de GFP-moesina alrededor del sitio de la herida por ~ 5 min. El anillo de actina se hace más pequeño en diámetro y, finalmente, se cierra 2-3 h después de heridas en animales de tipo salvaje (Figura 2a). </li><li> Preparar una almohadilla de agar 2% en un portaobjetos de vidrio y transferir 10 gusanos en la almohadilla en 2 l solución 12 mM Levamisol. Imagen de los anillos de GFP-Moesin 1 hora después de la herida mediante microscopía confocal convencional. NOTA: El uso de microscopía confocal para adquirir z-pilas (13 x 0,5 m) de los anillos de actina 1 hora después de la herida. </li><li> Mida el diámetro del anillo de actina después de la herida. Para cuantificar epidérmica GFP-moesina, primero hacer una proyección de máxima intensidad de la z-pila y luego dibujar 4 exploraciones de línea (a 45 ° entre sí) sobre el anillo de GFP-moesina. Diámetro del anillo se define como la distancia media de pico pico de las cuatro exploraciones de línea (Figura 2B). Para anillos que ya han cerrado, el diámetro se define como 0 m. NOTA: F-actina anillos se miden convenientemente 1 h después de herir, ya que es aproximadamente la mitad del proceso de cierre de la herida en el tipo silvestre. Anillos de F-actina se pueden medir también en varios puntos de tiempo para derivar un transcurso de tiempo de cierre de la herida. Tiempo películas de lapso de cierre de la herida pueden ser adquiridos usando gusanos levamisol inmovilizada y girando microscopía confocal de disco. </li></ol> 5. ensayo de inducción de péptidos antimicrobianos epidérmicas NOTA: Heridas también desencadena la respuesta inmune innata en la C. piel elegans. La transcripción de los genes que codifican péptidos antimicrobianos (AMP) es induced en la epidermis. La PNL-29 (proteína-neuropéptido similares) AMP está fuertemente inducida por hiriendo a 4. Para ensayar cómo la epidermis controla la expresión AMP después de la herida, utilizar reporteros transgénicos o PCR en tiempo real para detectar los niveles individuales de transcripción AMP. <ol><li> Reportero de ensayo transgénico para la respuesta inmune innata a hiriendo a 4. </li><li> Realizar la herida de la aguja (como en el protocolo 1) en los animales adultos que expresan el reportero transgénico frIs7, que contiene P PNL-29- GFP y col P-12 DsRed como un control interno. Observar los animales adultos no heridos rojos tan oscuro o naranja en un filtro de paso largo GFP. NOTA: Herir gusanos de tipo salvaje inducirán P PNL-29-GFP expresión, pero no afectarán P col-12 -dsRed, resultando en gusanos que aparecen de color naranja, amarillo o verde bajo GFP iluminación pase largo. Pérdida de la función de genes en la vía MAPK p38, tales como PMK-1 o NSY-1 bloqueará PNL-29-GFPinducción después de herir 4. GFP P PNL-29- se expresa en altos niveles en los estadios larvarios </li><li> Realizar ensayos de inducción de AMP en animales adultos jóvenes. Asegúrese de que los animales de control no heridos tienen bajos niveles de las buenas prácticas agrarias. NOTA: P PNL-29- expresión de GFP también es inducida por estrés osmótico 8, y puede ser sensible a otras tensiones ambientales. </li><li> 6 horas después de la herida, la puntuación de los números de gusanos que tienen P PNL-29-GFP inducción (Figura 3) 9 utilizando una fluorescencia de disección alcance con filtro de paso largo GFP. NOTA: En 1 hora después de la herida P PNL-29- GFP se induce visiblemente, alcanzando un pico de aproximadamente 6 horas después de la herida y luego permanecer elevada hasta después de la curación 24 hr. Cuantificar la expresión de un 4,9 de puntuación visual. Alternativamente, cuantificar los niveles de expresión utilizando una fluorescencia activada gusano clasificador 4. Para el clasificador de gusano, al menos 50 animales necesitan ser heridos. </li><li> Ensayo de PCR en tiempo real para quantitating niveles de transcripción de los genes AMP individuales. Niveles de transcripción de ensayo para varios genes: PNL-29, PNL-30, cnc-1, y cnc-5. </li><li> Realizar aguja hiriendo en de tipo salvaje o gusanos mutantes (véase el protocolo 1) </li><li> Recoge 50 gusanos heridos y 50 gusanos no heridos en los tiempos deseados (por ejemplo, 3, 6, 24 horas) después de la herida. </li><li> Extracto de ARN utilizando un kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Realizar la transcripción inversa para obtener cDNA total de 20 l usando un kit comercial de la transcriptasa inversa. </li><li> Para RT-PCR, utilice 0,2 l de cDNA (1/40) de cada muestra en combinación con un Supermix verde con fluoresceína y 0,2 mM cebadores. Para comparar la calidad del ARN, utilice ama-1 o snb-1 RT-PCR como referencia; comparar el nivel de expresión relativa AMP mediante la normalización de control interno (ama-1 o snb-1), o comparar veces de inducción después de la herida (AMP inducción en gusanos heridos / gusanos no heridos) por normaalizing al control interno. NOTA: cnc-1 y cnc-5 se caenacin familiares péptidos antimicrobianos cuya transcripción se activa por hiriendo a 10. Típicamente, la herida de la aguja induce la expresión (~ 500 veces para CNC-1) durante un transcurso de tiempo de 4 h 10. Los cebadores utilizados en los trabajos publicados se enumeran en la Tabla 2. </li></ol> 6. Ensayo de supervivencia después de la herida <ol><li> NOTA: Heridas activa al menos dos vías de señalización independientes de la epidermis: la herida dependen de la vía Ca 2+ reparación y la ruta de respuesta inmune innata. Se requieren ambas vías para la supervivencia lleno de heridas estéril. Para probar si un mutante o tratamiento RNAi afecta a la curación de heridas, la supervivencia a medir después de la curación de 24-48 hr. Opcionalmente, utilice ensayos de vida útil convencionales para determinar el efecto de herir en la longevidad 4,9. </li><li> Realizar aguja hiriendo al joven adulto (L4 + 24 hr) gusanos (50 gusanos, repita seveveces ral) siguiendo el protocolo 1 anterior. Mantener un número equivalente de gusanos ilesos como controles. </li><li> Compruebe la supervivencia cada 24 horas (de transferencia gusanos heridos a una nueva placa de agar cada 24 horas). Observe ~ 50% de supervivencia a las 24 horas después de la herida en los mutantes que son defectuosos en la reparación de heridas, como GTL-2 o tir-1, cuando se normalizaron a los animales de control no heridos. La muerte se define como la falta de respuesta locomotora a tocar por selección gusano. </li></ol>

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses.">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).</li><li>Xu, S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G&#945;q-Ca2++signaling+pathway+promotes+actin-mediated+epidermal+wound+closure+in+C.+elegans.">A G&#945;q-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans.</a> Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Chisholm, A. D., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+II:+differentiation+and+physiological+roles.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .</li><li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.+Methods+in+cell+biology.">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology.</a> 48, 225-250 .</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, (2008).</li><li>Tong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+Caenorhabditis+elegans+epidermal+damage+responses+by+death-associated+protein+kinase.">Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).</li><li>Zugasti, O., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+of+antimicrobial+peptide+expression+by+a+noncanonical+TGF-beta+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+epidermis.">Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis.</a> Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chip-based+C.+elegans+microinjection+system+for+investigating+cell-cell+communication+in+vivo.">Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo.</a> Biosensor., &amp; Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).</li><li>Jansson, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Conidia+of+Drechmeria+coniospora+to+Caenorhabditis+elegans+Wild+Type+and+Mutants.">Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants.</a> J Nematol. 26, 430-435 (1994).</li><li>Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bacterial+pathogen,+Microbacterium+nematophilum,+induces+morphological+change+in+the+nematode+C.+elegans.">A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans.</a> Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

Los métodos presentados aquí por aguja y lesiones láser ofrecen enfoques complementarios para evaluar la capacidad del epitelio epidérmico para reparar los daños. Herida láser es relativamente localizado y (dependiendo de la configuración del láser) puede limitarse a la epidermis, mientras que la herida de la aguja interrumpe la epidermis, la cutícula, y membranas basales internos probables. Heridas de aguja puede parecerse más precisión las heridas infligidas por agentes patógenos o daños mecánicos en el ...

Mecanismos de curación de heridas en la piel son de interés biológico básico y relevante para la salud humana. La cicatrización de heridas en los vertebrados y mamíferos comprende una compleja serie de respuestas coordinadas de múltiples tejidos y de señalización 1. Muchos simples organismos modelo genético también son capaces de curar las heridas de la piel 2. Por tanto, es de interés analizar modelos genéticamente tratables de la reparación de heridas de la piel. Nosotros y otros han comenzado a utilizar Caenorhabditis elegans como nuevo modelo para la curación de heridas de la piel 3,4. El objetivo de este protocolo es permitir a un conjunto más amplio de investigadores de utilizar C. elegans como una herramienta para investigar los mecanismos moleculares y celulares de la epidermis cicatrización de la herida. El C. piel elegans comprende la epidermis (también conocidos como hipodermis) y la cutícula extracelular 5. La epidermis adulto se forman a partir de un pequeño número de sincitios multinucleados, de los cuales el más grande es el sincitio known como hyp7. La epidermis es un epitelio simple que segrega la cutícula en su superficie apical. La piel puede defenderse activamente contra los patógenos que penetran en la piel y reparar pequeñas heridas 4. La reparación de heridas de la C. piel elegans es robusta, ya que casi todos los animales de tipo salvaje sobreviven pueden sobrevivir pequeñas heridas punzantes causadas por agujas o daño local de la piel causada por la irradiación láser. C. heridas de la piel elegans desencadena una serie de respuestas, incluyendo una respuesta inmune innata epidérmico, cierre de la herida, y la formación de cicatrices 4. La epidermis adultos es post-mitótico, y cicatrización de heridas implica respuestas celulares locales en oposición a la proliferación epidérmica o la migración celular. Hemos demostrado que las heridas de la piel provoca un aumento grande y sostenido en epidérmica Ca 2+, requiriendo el canal de TRPM membrana GTL-2 e internos Ca 2 + tiendas 3. Se requiere señal El epidérmica Ca 2+ para la formación y el cierre de los anillos F-actina en el wositio und. Heridas también induce la respuesta inmune innata que activan la transcripción de AMPs como PNL-29. La transcripción inducida por heridas de AMP depende de una TIR-1 / PMK-1 p38 MAP quinasa cascada que actúa de forma autónoma en la epidermis 4. Los defectos en cualquiera de la vía de señalización de Ca2 + o en la respuesta inmune innata dará lugar a una menor supervivencia después de la herida. La estructura relativamente simple de la C. elegans epidermis, su maleabilidad genética y ventajas en vivo de imágenes hacen que sea un excelente sistema para estudiar varios aspectos de la reparación de la herida. Aquí presentamos los protocolos para los dos métodos comunes de heridas: las heridas de aguja y lesiones láser. Herida de la aguja no requiere equipo especializado (que no sea el extractor de aguja), y con la experiencia se puede realizar en cientos de gusanos por día. Heridas de aguja se realiza en animales en crecimiento en placas de agar. Por el contrario, las heridas de láser se realiza en Anesanimales anestesiados montados en agar almohadillas bajo un cubreobjetos, y es adecuado para imágenes en vivo de las respuestas celulares a los daños.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri plate</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Worm pick (platinum wire)</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 solution</td><td>Home-made</td><td></td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Use 500 ml for 50 worms</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR tubes</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

El C. elegans epidermis y cutícula forman una sencilla capa de piel y sofisticado que puede reparar daños localizados resultante de la herida. Los estudios de las respuestas de la herida y la reparación en este modelo han iluminado nuestro entendimiento del citoesqueleto y respuestas genómicas a daños en los tejidos. Los dos métodos más comúnmente utilizados para lesionar al C. elegans piel del adulto son pinchazos con agujas de microinyección y la irradiación láser local. Aguja hiriendo localmente altera la cutícula, la epidermis, y la matriz extracelular asociada, y también puede dañar los tejidos internos. Resultados de irradiación láser en daños más localizado. Heridas desencadena una sucesión de respuestas ensayadas fácilmente incluyendo elevada epidérmica Ca 2+ (segundo minutos), la formación y el cierre de un anillo que contiene actina en el sitio de la herida (1-2 horas), elevado transcripción de genes de péptidos antimicrobianos (2-24 hr), y la formación de cicatrices. Esencialmente, todos los animales adultos silvestres sobreviven herida, dondecomo mutantes defectuosos en la reparación de heridas u otras respuestas muestran una menor supervivencia. Se presentan los protocolos detallados de aguja y las heridas de láser, y ensayos para la cuantificación y visualización de las respuestas de la herida y los procesos de reparación (dinámica de Ca, la dinámica de actina, la inducción péptido antimicrobiano y supervivencia).

Láser o heridas aguja activarán elevación rápida y sostenida de los niveles de Ca epidérmicas, como se visualiza con sensores de Ca como GCaMPs (Figura 1). La elevación Ca se produce en cuestión de segundos, y sigue siendo elevado durante decenas de minutos. Aguja hiriendo reproducible resulta en la formación de anillos de F-actina en los sitios de la herida (Figura 2); éstos aparecen en cuestión de minutos, y poco a poco cerca sobre 1-2 horas después de la herida. Anillos de...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans at JoVE.com

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.3K vistas.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

Video: Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

En vivo láser axotomía en C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Investigación

Neurociencias

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Microinyección de Heridas Ensayo y<em&gt; In vivo</em&gt; Localización de la herida epidérmica Reporteros de respuesta en<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Bioingeniería

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Un dispositivo para realizar la migración de células / Curación de Heridas en una placa de 96 pocillos

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Biología del Desarrollo

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Un modelo de Drosophila para estudiar la poliploidización inducida por heridas

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

Evaluación de la cicatrización aguda de heridas utilizando los modelos de esponja de alcohol de polivinilo subcutáneo dorsal y modelos de herida sin piel de cola excisional.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Inmunología e Infección

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

Ensayo de migración de arañazos y cámara dorsal Skinfold para análisis In Vitro e In Vivo de sanación de heridas

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Medicina

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Biología

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while protecting them from infection. Therefore, it is not surprising that the ability to repair epithelial wounds is critical to all metazoans. Epithelial wound healing in vertebrates involves overlapping processes, including inflammatory responses, vascularization, and re-epithelialization. Regulation of these processes involves complex interactions between epithelial cells, neighboring cells, and the extracellular matrix (ECM); the ECM contains structural proteins, regulatory proteins, and active small molecules. This complexity, together with the fact that most animals have opaque tissues and inaccessible ECMs, makes wound healing difficult to study in live animals. Much work on epithelial wound healing is therefore performed in tissue culture systems, with a single epithelial cell-type plated as a monolayer on an artificial matrix. Clytia hemisphaerica (Clytia) provides a unique and exciting complement to these studies, allowing epithelial wound healing to be studied in an intact animal with an authentic ECM. The ectodermal epithelium of Clytia is a single layer of large squamous epithelial cells, allowing high-resolution imaging using differential interfering contrast (DIC) microscopy in living animals. The absence of migratory fibroblasts, vasculature, or inflammatory responses makes it possible to dissect the critical events in re-epithelialization in vivo. The healing of various types of wounds can be analyzed, including single-cell microwounds, small and large epithelial wounds, and wounds that damage the basement membrane. Lamellipodia formation, purse string contraction, cell stretching, and collective cell migration can all be observed in this system. Furthermore, pharmacological agents can be introduced via the ECM to modify cell:ECM interactions and cellular processes in vivo. This work shows methods for creating wounds in live Clytia, capturing movies of healing, and probing healing mechanisms by microinjecting reagents into the ECM.

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

This paper describes a method to create wounds in the epithelium of a live Clytia hemisphaerica medusa and image wound healing at a high resolution in vivo. Additionally, a technique to introduce dyes and drugs to perturb signaling processes in the epithelial cells and extracellular matrix during wound healing is presented.

Caracterización de la cicatrización de heridas epiteliales in vivo utilizando el organismo modelo cnidario Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while ...

Epidermal Laser Wounding: Inducing Localized Damage to Examine Repair Processes in C. elegans

Source: Xu, S. and Chisholm, A. D. <a href="https://www.jove.com/video/51959/methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans">Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in&#160;C. elegans.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2014).
This video introduces a method of laser wounding, which is used to cause very precise injuries in the worm epidermis.&#160; The sample protocol is from a study of wound response and repair.

Herida epidérmica por láser: inducción de daño localizado para examinar los procesos de reparación en C. elegans

Source: Xu, S. and Chisholm, A. D. Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in&#160;C. elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2014).
This video ...

Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video