Este protocolo se puede utilizar para estudiar la poliploidización inducida por heridas. Un proceso de reparación de tejido de conservación, en el que las células crecen en lugar de dividirse en la mosca de la fruta adulta. Se puede hacer una simple herida punzante para inducir poliploidía en el epitelio de la mosca en solo dos días.
El tamaño de la célula epitelial, la ploidy y la organización, se pueden evaluar fácilmente. Comience por recoger dos viales, que contienen de 10 a 15 moscas de fruta hembra recién cerradas de la cepa de interés. Y envejeciendo las moscas en frascos de alimentos frescos, con aproximadamente cinco moscas macho por vial a 25 grados centígrados, hasta tres a cinco días de edad.
Para las heridas abdominales, al final de la incubación, utilice un solo pasador de acero inoxidable de 0,1 milímetros para ensamblar varios soportes de pasador, con el extremo afilado de cada pasador que se sale. Anestesia las moscas de la fruta femenina envejecida en una almohadilla de mosca de dióxido de carbono bajo un microscopio estéreo. Y usa un pincel para colocar las moscas en una fila.
Usar gafas de seguridad, con un soporte de pasador en una mano y fórceps en la otra, utilizar los fórceps para colocar las moscas con sus abdomens ventrales hacia arriba. A continuación, perfore las moscas hembra adultas dentro de la región derecha azul epitelial del objetivo A4 a ambos lados de la línea media ventral agitar las noches y devolver las moscas heridas al vial de alimentos hasta el punto de tiempo experimental deseado después de la lesión. En el punto final experimental, compruebe la presencia de la herida y la cicatriz en cada mosca anestesiada bajo el microscopio estéreo y llene un pozo de un plato de disección de vidrio de nueve pozos con la solución de Grace.
Usando un par de fórceps, agarra una hembra herida volando por el lado dorsal del tórax y sumerge la mosca en el pozo de solución. Con la otra mano, utilice un segundo par de fórceps para perforar y quitar la cutícula dorsal por debajo del objetivo A6, en la parte posterior de la mosca de la fruta. Si no se extraen los órganos internos, aplique presión en el lado dorsal del abdomen para exprimir los órganos restantes.
Utilice los fórceps para romper el abdomen completo en la unión del tórax por encima del objetivo A2 y transferir el abdomen a un pozo que contenga aproximadamente 100 microlitros de la solución de Grace. Una vez recogidos todos los abdomens, reduzca el volumen de la solución de Grace en el pozo de recolección a 30 microlitros. Usa fórceps en una mano para sostener el lado dorsal del abdomen hacia abajo y usa la otra mano para insertar la hoja inferior de las tijeras de primavera de Venecia en la cavidad abdominal de cada abdomen y corta a lo largo de la línea media dorsal hasta que el abdomen esté completamente abierto.
Agregue 30 microlitros de la solución de Grace en cada área de montaje de una placa de disección seca con 4.1 milímetros por área de montaje abdominal Y coloque el abdomen fileteado en la gota de solución. Cuando todos los abdomens han sido fileteados y colocados, fijar el abdomen al plato en las cuatro esquinas dorsales. Teniendo cuidado de que los tejidos estén acostados sin rasgar o estirar demasiado el tejido abdominal.
A continuación, reemplace la solución de Grace por 30 microlitros una solución fijadora por área de montaje. Y coloque una etiqueta de cinta en la parte inferior de cada plato para marcar cada control y grupo experimental. Para montar las muestras de tejido mosca.
Después de la tinción, utilice fórceps para desanclar los abdomens de la placa de disección bajo el microscopio estéreo. Y utilice fórceps para transferir cada muestra por su flanco dorsal en aproximadamente 30 microlitros de medio de montaje en hojas de cubierta de vidrio individuales. Bajo el microscopio estéreo orientar el tejido abdominal de modo que el interior esté mirando hacia abajo hacia el resbalón de la cubierta y use fórceps para tirar de los abdomens orientados hasta el borde de cada gota de medios.
Coloque cada resbalón de cubierta montado en un portaobjetos de vidrio etiquetado. Y usa un tejido de laboratorio para eliminar cualquier exceso de medio de montaje. A continuación, selle los bordes del resbalón de la cubierta con esmalte de uñas transparente y guarde las diapositivas en la caja deslizante a cuatro grados centígrados hasta que se tonúquenlos.
La proteína de unión septada rápida tres que etiqueta las uniones celulares, proporciona un indicador de si se produjeron perturbaciones de procesamiento durante la preparación. Los abdomens con grandes arañazos de área no manchada que perturban la zona de la herida, deben ser desechados y no incluidos en el análisis. La reparación de heridas se completa cuando una célula multinucleada grande central cubre la costra de la herida.
Las brechas de más de 10 micrómetros en la lámina epitelial se consideran defectos en el cierre de la herida y la reepilación. En este análisis representativo utilizando moscas con activación de células mitóticas inhibidas, el 52% de las heridas fueron incapaces de formar una hoja epitelial continua sobre la costra de la herida. Este ensayo de cicatrización de la herida de membrana proporciona más información en la medida del defecto de reparación de la herida, lo que permite agrupar los defectos de reepillamentación como completamente abiertos, parcialmente cerrados o completamente cerrados.
Por ejemplo, en este experimento la inhibición de la poliploidización inducida por heridas por el bloqueo simultáneo de la replicación de endo y la fusión celular, causó que el 92% de las heridas epiteliales permanecieran completamente abiertas. Mientras que la activación del ciclo celular mitótico dio lugar a un defecto de cierre de herida epitelial. Además, la actividad del ciclo celular se detectó mediante la incorporación de la EDU analógica de timidina y la ploidea epitelial se determinó midiendo directamente el contenido de ADN nuclear.
Al diseccionar el epitelio abdominal, tenga cuidado de no tocar el tejido con ninguna de las herramientas de disección, ya que esto rayará la muestra. Después de la disección, la proliferación celular, la muerte celular, el tamaño de la incisión de pérdida celular o las evaluaciones de contenido de ADN nuclear se pueden realizar para comprender mejor la poliploidización inducida por heridas. u otros procesos dentro del epitelio.
