Reconhecemos financiamento do NIH (NHLBI Contrato n º HHSN268201000044C a RW, SH e SYS).

1. Preparação de GST e nanopartículas (NP) Conjugados <ol><li> GST-TCO preparação: <ol><li> Adicionar 8 mL de solução de TCO-NHS (50 mM em DMSO) a 100 ul de GST (1 mg / ml em PBS) e agitar a mistura temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Retire o excesso de reagente, utilizando uma coluna de spin dessalinização Zeba. O filtrado recuperado contendo o conjugado de GST-TCO é armazenado a 4 ° C antes de usar. </li></ol></li><li> GST-Tz preparação: <ol><li> Adicionar 6 ml de solução-Tz-NHS (25 mM em DMF) a 75 ul de GST (1 mg / ml em PBS) e agitar a mistura temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Dilui-se a mistura de reacção com 25 ul de PBS e purificar usando uma coluna de spin de dessalinização. O filtrado contendo o conjugado de GST-Tz é armazenado a 4 ° C antes de usar. </li></ol> Nota: análises Massa (MALDI-TOF) mostrou que, em média ~ 10 Tz ou TCO moléculas foram conjugado com GST. </li><li> NP-TCO preparação: <ol><li> Adicione 100 ml de solução TCO-NHS (50 mM em DMSO) para150 ul de nanopartículas aminada (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml, em PBS, 3 nm núcleo de ferro Fe ~ 8000 / NP) e agitar a mistura temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Remover o excesso de reagente por filtração em gel utilizando uma coluna NAP-10 eluída com tampão PBS. Recolher o faixa colorida que contém o produto NP-TCO. </li><li> Concentra-se o filtrado para um volume final de ~ 150 ul usando um dispositivo de filtro de centrífuga (100 k MWCO). </li><li> Adicionar 50 ul de anidrido succínico, (0,1 M em DMSO) para a solução de NP-TCO e agitar à TA durante 1 hora (anidrido reage com quaisquer aminas restantes para formar ácidos carboxílicos terminais. Isto evita interacções não específicas com a superfície de dextrano). </li><li> Purifica-se o produto NP-TCO utilizando uma coluna NAP-10, efectuando a eluição com PBS. Armazene a solução de NP-TCO a 4 ° C antes de usar. </li></ol></li></ol> 2. Preparação da superfície Todos os ensaios de ressonância de plasma de superfície são realizados num instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) a25 ° C, utilizando um chip sensor CM5 e PBS-P como o tampão de corrida a menos que indicado de outra forma. Software de avaliação Biacore Controle e fornecido com o instrumento são empregados para a criação de experimentos e análise de dados. Dois modos de operação, assistentes de aplicativo e executar o manual será utilizado para elaboração e acompanhamento de superfície on-chip de captura de cicloadição. O modo de método construtor será usado para a criação de experiências de orientação de ligação inversa e para medir as taxas de reação de cicloadição. Os dados são o dobro referência subtraído e análises cinéticas são realizadas utilizando um modelo de ligação 01:01 Langmuir. <ol><li> Use o modelo assistente amina imobilização e selecione a imobilização das células de fluxo 1 (referência) e 2 (detecção). Modificar método amina para activar os grupos carboxílicos na superfície por injecção de uma solução 1:1 de EDC 0,4 M: 0,1 M de NHS para 480 segundos a uma taxa de fluxo de 10 mL / min. Definir a injeção de etanolamina para saciar restantes ésteres activados a 420 seg tempo de contato emuma taxa de fluxo de 10 mL / min. </li><li> Nome de entrada ligando, anti-GST (18 mg / ml em tampão acetato, pH 5,0) e ajustado para injectar para um tempo de contacto de 420 seg a uma taxa de fluxo de 10 mL / min. </li><li> Coloque os frascos de soluções exigidas em reagente cremalheira 2 certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salvar e iniciar a imobilização. Nota: Executar o assistente de imobilização dessa maneira resulta em níveis de imobilização anti-GST na faixa de ~ 14.000 a 17.000 RU. </li><li> Edite o assistente de imobilização apenas injetar GST ligante solução (20 mg / ml) para 420 segundos a 5 mL / min ao longo da célula de fluxo de referência 1. </li></ol> 3. Monitoramento On-chip Capture-cicloadição de funcionalizados Moléculas <ol><li> Monitoramento on-chip de captura de cicloadição em tempo real (Figura 2). <ol><li> Coloque GST-TCO (20 ug / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) e regeneração (glicina 10 mM, pH = 2,0) em frascos de solução reagente prateleira 2. Selecione o homemmétodo run ual, defina a taxa de fluxo de 5 mL / min e fluxo caminho para célula de fluxo 2. </li><li> Injectar solução de GST-TCO para 420 seg. </li><li> Injectar solução de Tz-BnNH 2 para 600 seg. </li><li> Regenerar a superfície com duas injecções de 30 seg de solução de regeneração. </li></ol></li><li> Monitorização de montagem no chip de estruturas multi-componentes em tempo real (Figura 3): <ol><li> Coloque GST-Tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 mg Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) e regeneração (glicina 10 mM, pH = 2,0) em frascos de solução reagente prateleira 2. Selecione o instrumento método de execução manual, definir a taxa de fluxo de 5 mL / min eo caminho do fluxo de célula de fluxo 2. </li><li> Injetar uma solução de GST-Tz para 60 seg. </li><li> Injetar uma solução de NP-TCO para 60 seg. </li><li> Injetar uma solução de Tz-BnNH 2 para 60 seg. </li><li> Regenerar a superfície com duas injecções de 30 seg de solução de regeneração. </li></ol></li></ol> 4. MCOMPANHAMENTO Densidade Imobilização e Determinação de Preços Cycloaddition <ol><li> Caracterização de pequenas taxas de reação de cicloadição molécula (Figura 4). <ol><li> Selecione o método de entrada e novos parâmetros gerais. No painel passos de ensaio criar um novo passo e nomeie-Sample. Defina o Objetivo e Conecte configurações de base para amostra. </li><li> No painel Tipos Ciclo Crie uma nova etapa do ciclo e inserir os seguintes comandos; Capture, Sample, Regeneração 1 e Regeneração 2. </li><li> Seleccione o comando de captura; nome ligando de entrada (GST-TCO, 20 ug / ml), o tempo de contacto de 120 s a 5 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Segunda. Selecione o comando Amostra; entrada 180 seg Tempo de contato, 60 seg tempo de dissociação, a taxa de fluxo de 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Ambos. Selecione o comando Regeneração 1; nome solução de regeneração de entrada (10 mM de glicina-HCl pH 2,0), tempo de contato de 30 segundos a 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Second. Repita o mesmo para Regeneração 2 de comando. &lt;/ Li&gt; <li> Selecione Executar Setup e definir o caminho de fluxo para: 2-1. Selecione ao lado e preencha lista de amostras com solução de analito (Tz-BnNH 2) e uma série de concentração (0,3-10 mM, 1:2 diluição). Selecione ao lado de rack painel posição. Local frascos de solução reagente em rack de 2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Os dados de ligação e análise cinética são apresentados na Figura 4. </li></ol></li><li> Caracterização das taxas de reação de cicloadição NP (Figura 4). <ol><li> Abra o modelo de método salva por cima e alterar os seguintes parâmetros. Selecione o painel de captura; mudança de nome ligante para GST-Tz, 20 mg / ml. Selecione o painel Amostra; mudança tempo de contato de 120 segundos de tempo de contato e tempo de dissociação a 120 seg. </li><li> Selecione a lista de amostra; mudar analito a NP-TCO e séries concentração (7-224 nM, 1:2 diluição). Local frascos de solução em rack de reagente2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Os dados de ligação e análise cinética são apresentados na Figura 4. </li></ol></li></ol> 5. Medir o Binding of FKBP12 para AP1497 Imobilizado Os estudos de ligação de inversão de orientação empregar FKBP12 como o analito e AP1497 composto como ligando imobilizado (Figura 5). O método geral para este ensaio está configurado da seguinte forma utilizando a ferramenta método construtor: <ol><li> Selecione o método de entrada e novos parâmetros gerais. No painel etapas de ensaio e criar nome de captura, de amostra e regeneração passos. Selecione Finalidade correspondente e Conecte configurações de base. </li><li> Selecione o painel Tipos de ciclo e criar três etapas do ciclo: Capture, Sample e regeneração. </li><li> Insira o comando de captura duas vezes na etapa do ciclo de captura. Selecione a captura 1 painel e selecione solução de captura como variablE, o tempo de contacto definido para 300 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Segunda. Selecione o painel de Captura 2 e selecione solução de captura como variáveis, definir o tempo de contato de 250 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Second. </li><li> Insira o comando da Amostra segundo a etapa do ciclo de amostra. Selecione o painel Amostra; conjunto tempo de contato de 60 segundos, o tempo de dissociação a 200 segundos a uma vazão de 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Ambos. </li><li> Insira o comando Regeneração duas vezes sob a etapa do ciclo de regeneração. Selecione o painel Regeneração 1; nome solução de regeneração de entrada (10 mM de glicina-HCl pH 2,0), tempo de contato de 30 segundos a 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Second. Repita o mesmo para o painel de Regeneração 2. </li><li> Selecione Executar Setup e definir o caminho de fluxo para: 2-1. Selecione nomes de soluções de captura de próximos e de entrada (GST-TCO e AP1497-Tz), nome da amostra (FKBP12), série de concentração (0,020 a 5 mg / ml, 1:2 diluição) e MW (13.000). Local frascos de solução em reagent cremalheira 2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Dados da análise cinética são apresentados na Figura 5. </li></ol> 6. Medir o Binding of FKBP12 para AP1497 Anexado ao Imobilizado PN O método geral para a imobilização de nanopartículas, pequena molécula derivação e FKBP12 ensaio de ligação é configurado da seguinte forma utilizando a ferramenta método construtor: <ol><li> Abra o modelo de método salvou de cima e modificar. Insira um comando adicional de captura na etapa do ciclo de captura. Selecione um painel de captação; desmarcar solução de captura como solução de captura variável e nome 1 (GST-Tz). Conjunto de tempo de contacto de 60 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo de Segunda. Selecione o painel de Captura 2; desmarcar solução de captura como solução de captura variável e nome 2 (NP-TCO). Tempo conjunto de contacto de 90 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min edefinir o caminho de escoamento para o segundo. Selecione o painel de Captura 3; desmarcar solução de captura como solução de captura variável e nome 3 (AP1497-Tz). Tempo conjunto de contacto de 180 seg a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo de Segunda. </li><li> Selecione Executar Setup e definir o caminho de fluxo para: 2-1. Selecione ao lado duas vezes. Local frascos de solução reagente em rack de 2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Dados da análise cinética são apresentados na Figura 5. </li></ol>

<ol>
	<li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine/trans-cyclooctene+cycloaddition.">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).</li><li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes.">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).</li><li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+intracellular+biomarkers+and+mediators+of+cell+activation+using+nanosensors+and+bioorthogonal+chemistry.">Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry.</a> ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).</li><li>Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+probes+for+polo-like+kinase+1+imaging+and+quantification.">Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).</li><li>Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diels-Alder+cycloaddition+for+fluorophore+targeting+to+specific+proteins+inside+living+cells.">Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).</li><li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry+amplifies+nanoparticle+binding+and+enhances+the+sensitivity+of+cell+detection.">Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection.</a> Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).</li><li>Liong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+pathogen+detection+using+bioorthogonal+chemistry+and+diagnostic+magnetic+resonance.">Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance.</a> Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).</li><li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+bioorthogonal+chemistry+enables+immobilization+of+in+situ+modified+nanoparticles+and+small+molecules+for+label-free+monitoring+of+protein+binding+and+reaction+kinetics.">On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics.</a> Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).</li><li>Pol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+correct+protein+concentration+for+kinetics+and+affinity+determination+in+structure-function+analysis.">The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis.</a> J Vis Exp. (37), e1746 (2010).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+proteins+to+which+small-molecule+probes+and+drugs+bind+in+cells.">Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).</li><li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+affinity+and+kinetic+analysis+of+targeted+small+molecule-modified+nanoparticles.">Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles.</a> Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).</li><li>Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+targeting+of+nanoparticles+by+multivalent+attachment+of+small+molecules.">Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules.</a> Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).</li><li>Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+assay+for+chloramphenicol.">Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol.</a> Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).</li><li>Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-mediated+multivalent+binding+for+the+enhanced+capture+of+tumor+cells.">Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).</li><li>Keelan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotoxicology:+nanoparticles+versus+the+placenta.">Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta.</a> Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).</li><li>Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+size+and+surface+properties+determine+the+protein+corona+with+possible+implications+for+biological+impacts.">Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).</li><li>Lundqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+protein+corona+around+nanoparticles:+a+test+study.">The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study.</a> ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).</li><li>Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvalent+interactions+in+biological+systems:+implications+for+design+and+use+of+multivalent+ligands+and+inhibitors.">Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).</li><li>Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+random+and+oriented+antibody+immobilization+techniques+on+the+binding+capacity+of+immunosensor.">Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor.</a> Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).</li><li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions:+progressing+towards+the+dream.">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).</li><li>Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+based+assay+for+the+detection+and+characterization+of+promiscuous+inhibitors.">Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors.</a> J Med Chem. 51, 574-580 (2008).</li><li>Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RGS+protein+inhibitor+CCG-4986+is+a+covalent+modifier+of+the+RGS4+Galpha-interaction+face.">The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face.</a> Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método de captura-cicloadição descrita aqui permite a rápida imobilização, reversível de nanopartículas modificadas e pequenas moléculas para a interação baseada em chip sem rótulo e estudos cinéticos. O protocolo de imobilização pode ser realizada em minutos, que requerem &lt;10 uM concentrações de ligandos de pequenas moléculas. Modulando concentração de ligante e densidades de imobilização tempo de contato pode ser rigorosamente controlado. Nossos dados mostram que no chip reações bioorthogo...

Reações de conjugação eficientes são ferramentas valiosas para a fixação de moléculas bioativas em superfícies para uma variedade de aplicações biotecnológicas. Recentemente, o bioorthogonal muito rápido [4 +2] de reacção de cicloadição entre trans-cicloocteno (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) tem sido utilizado para marcar as superfícies das células, estruturas subcelulares, anticorpos e nanopartículas 1. - 7 Aqui, usamos o [4 +2] reação de cicloadição em combinação com captura de antígeno / anticorpo (GST / anti-GST) para síntese reversível on-chip de estruturas multi-componentes para a superfície Plasmon Resonance (SPR) análise da interação e monitorar o processo em tempo real (Figura 1). 8,9 Notavelmente, a estratégia de captura de cicloadição permite a regeneração da superfície utilizando um protocolo estabelecido. 8 Consequentemente, a montagem de superfícies de sensores estáveis ​​com controlo sobre a orientação e densidade de ligando para a variedade de ensaio novo formatos é agora possível. Utilizaçãoesta estratégia que demonstram a imobilização de moléculas pequenas TCO / Tz derivatizados e caracterizar as taxas de cicloadição de uma variedade de condições de tampão. Escolhemos a interacção conhecida entre FKBP12 e AP1497 uma molécula que se liga a FKBP12 10-12 por exemplo, para verificar se a estratégia de captura de cicloadição preserva a capacidade da molécula pequena de interagir com o seu alvo, quer directamente, quando ligado a antigénios GST imobilizadas ou nanopartículas imobilizadas (NPS). Este método proporciona várias vantagens. Em primeiro lugar, a imobilização reversível de pequenas moléculas em chips sensores agora é possível. Em segundo lugar, TCO / Tz imobilização de pequenas moléculas também permite estudos de interacção livre de rótulo que revertem a orientação de estudos SPR canônicas, e pode fornecer uma visão complementar de uma interação de ligação. Em terceiro lugar, este método permite a síntese de microfluidos de nanopartículas alvo, e a avaliação imediata da sua bindinpropriedades g. Este promete melhorar a eficiência da avaliação ou triagem nanopartículas alvo, e também diminuir as quantidades requeridas de nanopartículas. 13-15 Em quarto lugar, esta abordagem pode medir a cinética de reacção de reacções de cicloadição bioorthogonal em tempo real, sob fluxo contínuo. Finalmente, a imobilização química do TCO / Tz é robusta na presença de soro. Tomados em conjunto, prevemos que esta abordagem versátil amplamente facilitar a construção de superfícies estáveis ​​sensores para uma grande variedade de estudos microfluídicos com relevância para a in vitro e em aplicações celulares in vivo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sensor Chip CM5</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coupling kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1000-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST capture kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAP-10 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0854-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST, lyophilized in 1X PBS</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Z02039</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhFKBP12</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3777-FK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant P-20</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1000-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine 2.0</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1003-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba spin desalting column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>89882</td>
			<td>7 K MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>UFC810096</td>
			<td>100 K centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCO-OH</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCO-NHS</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tz-BnNH2</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tz-NHS</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td>764701</td>
			<td>Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-NH2 = CLIO-NH2</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP1497, AP1497-Tz</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Biosensor</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Biacore T100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic on-chip capture-cycloaddition reaction to reversibly immobilize small molecules or multi-component structures for biosensor applications

Métodos para a rápida imobilização superfície de pequenas moléculas bioativas com controle sobre orientação e densidade de imobilização são altamente desejáveis ​​para aplicações de biossensores e microarray. Neste estudo, nós usamos um covalente bioorthogonal altamente eficiente [4 +2] reação de cicloadição entre trans-cicloocteno (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) para permitir a imobilização microfluídicos de moléculas TCO / Tz-derivados . Nós monitoramos o processo em tempo real, em condições de fluxo contínuo, utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR). Para permitir a imobilização reversível e estender o intervalo experimental de a superfície do sensor, que combinam um componente de captura de antígeno-anticorpo não-covalente com a reacção de cicloadição. Ao apresentar alternadamente TCO ou Tz metades à superfície do sensor, vários processos de captura de cicloadição são agora possíveis em uma superfície do sensor para montagem on-chip e interação estudos de uma variedade de estruturas multi-componentes. Nós illustrate este método com duas experiências diferentes de imobilização sobre um chip de biossensor; uma molécula pequena, AP1497, que liga a proteína de ligação de FK506 12 (FKBP12), e a mesma molécula pequena, como parte de uma nanopartícula funcionalizado situ imobilizada e em.

Os dados e valores foram adaptados de referência 8. Imobilização reversível eficiente de moléculas pequenas bioactivos com controlo sobre a orientação e densidade desempenha um papel chave no desenvolvimento de novas aplicações de biossensores. Utilizando a reacção bioorthogonal rápido entre TCO e Tz, nós descrevemos um processo para a montagem de forma gradual e, a regeneração da superfície de ligandos, com retenção da actividade biológica. Figura 2 mostr...

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Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Nós apresentamos um método para a rápida imobilização, reversível de moléculas pequenas e montagens de nanopartículas funcionalizadas para a superfície Plasmon Resonance (SPR) estudos, usando seqüencial on-chip química cicloadição bioorthogonal e antígeno-anticorpo de captura.

Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

microfluidic-on-chip-capture-cycloaddition-reaction-to-reversibly

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.7K visualizações.  Massachusetts General Hospital.  Nós apresentamos um método para a rápida imobilização, reversível de moléculas pequenas e montagens de nanopartículas funcionalizadas para a superfície Plasmon Resonance (SPR) estudos, usando seqüencial on-chip química cicloadição bioorthogonal e antígeno-anticorpo de captura. 

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