Wir erkennen die Finanzierung von NIH (NHLBI Vertrag Nr. HHSN268201000044C Rw, SH und SYS).

1. Herstellung von GST und Nanopartikel (NP) Konjugate <ol><li> GST-TCO Zubereitung: <ol><li> Hinzufügen 8 ul TCO-NHS-Lösung (50 mM in DMSO) und 100 &amp;mgr; l GST (1 mg / ml in PBS) hinzugefügt und bei RT für 1 Stunde. </li><li> Überschüssiges Reagens unter Verwendung einer Zeba Spin Entsalzungssäule. Das zurückgewonnene Filtrat, das das GST-TCO-Konjugat wird bei 4 ° C vor der Verwendung gelagert. </li></ol></li><li> GST-Tz Zubereitung: <ol><li> Sie 6 ul Tz-NHS-Lösung (25 mM in DMF) und 75 &amp;mgr; l GST (1 mg / ml in PBS) hinzugefügt und bei RT für 1 Stunde. </li><li> Verdünne das Reaktionsgemisch mit 25 &amp;mgr; l PBS und Reinigung unter Verwendung einer Spin-Säule entsalzt. Das Filtrat, das das GST-Tz-Konjugat wird bei 4 ° C vor der Verwendung gelagert. </li></ol> Hinweis: Massenanalysen (MALDI-TOF) zeigt, dass im Durchschnitt ~ 10 Tz oder TCO-Moleküle wurden an GST konjugiert. </li><li> NP-TCO Zubereitung: <ol><li> 100 l TCO-NHS-Lösung (50 mM in DMSO), um150 ul aminierten Nanopartikel (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml in PBS, 3 nm Eisenkern ~ 8.000 Fe / NP) und schüttelt bei RT für 1 Stunde. </li><li> Entfernen überschüssiger Reagenzien durch Gelfiltration unter Verwendung einer NAP-10-Säule mit PBS-Puffer eluiert. Sammeln Sie die farbigen Bande, die das NP-TCO Produkt. </li><li> Das Filtrat wird bis zu einem Endvolumen von ~ 150 &amp;mgr; l unter Verwendung einer Filterzentrifuge (100 K MWCO). </li><li> Dann werden 50 ul Bernsteinsäureanhydrid (0,1 M in DMSO) mit dem NP-TCO-Lösung und Schütteln bei RT für 1 h (anhydrid mit den verbliebenen Amine terminalen Carbonsäuren reagiert. Dies verhindert unspezifische Wechselwirkungen mit dem Dextran-Oberfläche). </li><li> Reinige den NP-TCO-Produkts mit Hilfe einer NAP-10-Säule, wobei mit PBS. Bewahren Sie die Lösung von NP-TCO bei 4 ° C vor der Verwendung. </li></ol></li></ol> 2. Oberflächenvorbereitung Alle Oberflächen-Plasmonresonanz-Tests werden auf einem Biacore T100 Gerät (GE Healthcare) durchgeführt, bei25 ° C unter Verwendung eines CM5-Sensorchip und P-PBS als Laufpuffer, sofern nicht anders vermerkt. Biacore Steuer-und Auswerte-Software mit dem Gerät geliefert werden, zum Aufbau von Versuchen und Analyse von Daten beschäftigt. Zwei Betriebsarten, Anwendungs ​​Assistenten und Handlauf für die Oberflächenvorbereitung und-überwachung auf dem Chip-Capture-Cycloaddition verwendet werden. Die Methode builder-Modus wird für die Einrichtung umgekehrter Orientierung und Bindungsexperimente zur Messung Cycloaddition Reaktionsraten verwendet werden. Daten sind doppelt Referenz subtrahiert und kinetische Analysen werden mit einem 1:1 Langmuir Bindungsmodell durchgeführt. <ol><li> Verwenden Sie den Assistenten Vorlage Amin Immobilisierung und wählen Immobilisierung auf Flusszellen 1 (Referenz) und 2 (Nachweis). Verfahren zum Modifizieren Amin Oberfläche Carboxylgruppen durch Injektion einer 1:1-Lösung von 0,4 M EDC aktivieren: 0,1 M NHS für 480 Sekunden bei einer Flussrate von 10 &amp;mgr; l / min. Stellen Sie die Injektion von Ethanolamin zu verbleibenden aktivierten Ester bis 420 sec Kontaktzeit bei stilleneine Durchflussrate von 10 &amp;mgr; l / min. </li><li> Eingangs Ligand Name, anti-GST (18 &amp;mgr; g / ml in Acetatpuffer, pH 5,0) eingestellt, und für eine Kontaktzeit von 420 Sekunden bei einer Flussrate von 10 &amp;mgr; l / min injiziert. </li><li> Zeigen Lösung erforderlich Fläschchen in Reagenzhalter 2 dafür, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen. Speichern und starten Immobilisierung. Hinweis: Das Ausführen des Assistenten Immobilisierung auf diese Weise führt in anti-GST Immobilisierung Ebenen im Bereich von ~ 14.000 bis 17.000 RU. </li><li> Bearbeiten Sie die Immobilisierung Assistenten, um nur zu injizieren GST-Liganden (20 ug / ml)-Lösung für 420 s bei 5 ul / min über Referenzflusszelle ein. </li></ol> 3. Überwachung On-Chip-Capture-Cycloaddition funktionalisierter Moleküle <ol><li> Überwachung On-Chip-Capture-Cycloaddition in Echtzeit (Abbildung 2). <ol><li> Zeigen GST-TCO (20 ug / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) und Regeneration (10 mM Glycin, pH = 2,0)-Lösung in Ampullen Reagenzhalter 2. Wählen Sie den Mannmanuelle run-Methode, stellen Sie die Durchflussmenge bis 5 ml / min und Strömungspfad zu Zelle 2 fließen. </li><li> Inject Lösung von GST-Gesamtbetriebskosten für 420 sek. </li><li> Inject Lösung von Tz-BnNH 2 für 600 Sekunden. </li><li> Generieren Sie die Oberfläche mit zwei Injektionen von 30 Sekunden Regenerationslösung. </li></ol></li><li> Überwachen on-Chip-Montage von Mehrkomponentenstrukturen in Echtzeit (Fig. 3): <ol><li> Platzieren GST-Tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 ug Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 &amp;mgr; M) und die Regeneration (10 mM Glycin, pH = 2,0) Lösung in Ampullen Reagenzienrack 2. Wählen Sie das Instrument Handlauf-Methode das Durchflussmenge bis 5 ml / min und der Strömungspfad zu Zelle 2 fließen. </li><li> Spritzen Sie eine Lösung von GST-Tz 60 Sekunden. </li><li> Spritzen Sie eine Lösung von NP-TCO für 60 Sekunden. </li><li> Spritzen Sie eine Lösung von Tz-BnNH 2 für 60 Sekunden. </li><li> Generieren Sie die Oberfläche mit zwei Injektionen von 30 Sekunden Regenerationslösung. </li></ol></li></ol> 4. MONITORING Immobilisierung Dichte und Bestimmung von Cyclo Preise <ol><li> Charakterisierung von niedermolekularen Cycloaddition Raten (Abbildung 4). <ol><li> Wählen neuen Verfahren und Eingabe allgemeinen Parameter. In der Testschritte Panel einen neuen Schritt an und nennen Sie es Sample. Stellen Sie den Zweck und Schließen Basis-Einstellungen zu probieren. </li><li> In der Platte Zyklustypen erstellen einen neuen Zyklus Schritt und setzen Sie die folgenden Befehle, Capture-, Probe, Regeneration 1 und 2 Regeneration. </li><li> Wählen Sie den Befehl Capture-, Eingabe-Ligand-Namen (GST-TCO, 20 pg / ml), der Kontaktzeit 120 s bei 5 ml / min eingestellt und Strömungspfad: Zweiter. Wählen Sie den Befehl Muster; Eingang 180 Sek. Kontaktzeit, 60 Sek. Dissoziation Zeit, 30 ml / min Volumenstrom und Strömungspfad gesetzt: Beides. Wählen Sie den Befehl Regeneration 1, Eingang Regenerationslösung Namen (10 mM Glycin-HCl pH 2,0), der Kontaktzeit von 30 Sekunden bei 30 ml / min eingestellt und Strömungspfad: Zweiter. Wiederholen Sie den Befehl für 2 Regeneration. &lt;/ Li&gt; <li> Wählen Sie Setup ausführen und Strömungspfad zu: 2-1. Wählen nächste und füllen Beispielliste mit Analyt-Lösung (Tz-BnNH 2) und Konzentrationsreihe (0,3-10 uM, 1:2 Verdünnung). Wählen Sie neben Position Panel Rack. Platz-Lösung in Ampullen Reagenzhalter 2 und Verdünnungsreihe in 96-Well-Platte dafür, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen. Sparen Methodenvorlage und starten Bindungsassay. Bindungsdaten und kinetische Analyse sind in Fig. 4 gezeigt. </li></ol></li><li> Charakterisierung von NP-Cycloaddition Raten (Abbildung 4). <ol><li> Öffnen Sie die gespeicherte Methodenvorlage von oben und ändern Sie die folgenden Parameter. Wählen Sie das Aufnahmefenster; Änderung Ligand Namen GST-Tz, 20 ug / ml. Wählen Sie die Mustertafel; Änderung Kontaktzeit auf 120 Sekunden Kontaktzeit und Dissoziation Zeit, um 120 Sekunden. </li><li> Wählen Sie die Beispielliste, ändern Analyten NP-TCO und Konzentrationsreihe (7-224 nM, Verdünnung 1:2). Platz-Lösung in Ampullen Reagenzhalter2 und Verdünnungsreihe in 96-Well-Platte dafür, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen. Sparen Methodenvorlage und starten Bindungsassay. Bindungsdaten und kinetische Analyse sind in Fig. 4 gezeigt. </li></ol></li></ol> 5. Die Messung der Bindung von FKBP12 immobilisiert AP1497 Umgekehrt Orientierung Bindungsstudien beschäftigen FKBP12 als Analyt und Verbindung AP1497 als immobilisierte Liganden (Abbildung 5). Die allgemeine Methode für diesen Test ist wie folgt mit der Methode Builder-Tool einstellen: <ol><li> Wählen neuen Verfahren und Eingabe allgemeinen Parameter. In der Testschritte Platte erstellen und benennen Capture-, Muster-und Regenerationsschritte. Wählen entsprechenden Zweck und Schließen Basis-Einstellungen. </li><li> Wählen Zyklustypen Platte und erstellen 3-Zyklus vor: Capture-, Probe-und Regeneration. </li><li> Legen Sie die Capture-Befehl zweimal unter Capture-Schritt-Zyklus. Wählen Sie das Capture-1-Panel und wählen Sie Capture-Lösung als variable, gesetzt Kontaktzeit auf 300 s bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / min eingestellt und Strömungspfad: Zweiter. Wählen Sie das Capture-2-Panel und wählen Sie Capture-Lösung, wie variabel, bei einer Flussrate von 5 ml / min eingestellt und Strömungspfad gesetzt Kontaktzeit 250 Sek.: Zweiter. </li><li> Legen Sie die Probe unter dem Befehl Musterzyklusschritt. Wählen Sie die Mustertafel; Satz Kontaktzeit auf 60 sec, Dissoziation Zeit auf 200 s bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml / min eingestellt und Strömungspfad: Beides. </li><li> Setzen Sie den Befehl Regeneration zweimal unter der Regeneration Zyklusschritt. Wählen Sie die Regeneration ein Tafel; Eingangsregenerationslösung Namen (10 mM Glycin-HCl pH 2,0), der Kontaktzeit von 30 Sekunden bei 30 ml / min eingestellt und Strömungspfad: Zweiter. Wiederholen Sie das gleiche für die Regeneration 2-Panel. </li><li> Wählen Sie Setup ausführen und Strömungspfad zu: 2-1. Wählen nächste und Input-Capture-Lösung Namen (GST-TCO und AP1497-Tz), Probennamen (FKBP12), Konzentrationsreihe (0,020 bis 5 g / ml, Verdünnung 1:2) und MW (13.000). Platz-Lösung in Ampullen reAgent Rack 2 und Verdünnungsreihe in 96-Well-Platte dafür, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen. Sparen Methodenvorlage und starten Bindungsassay. Kinetischen Analysedaten sind in Fig. 5 gezeigt. </li></ol> 6. Die Messung der Bindung von FKBP12 an AP1497 an immobilisiertes NPs angebaute Das allgemeine Verfahren zur Immobilisierung von Nanopartikeln, kleines Molekül Derivatisierung und FKBP12-Bindungstest wird wie folgt mit der Methode Builder-Tool-Set-up: <ol><li> Öffnen Sie die gespeicherte Methodenvorlage von oben und ändern. Legen Sie eine zusätzliche Capture-Befehl unter Capture-Schritt-Zyklus. Wählen Sie das Capture-1 Tafel; deaktivieren Capture-Lösung als Variablenname und Capture-Lösung 1 (GST-Tz). Set Kontaktzeit bis 60 s bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / min eingestellt und Strömungspfad zum Zweiten. Wählen Sie das Capture-2-Panel, deaktivieren Sie Capture-Lösung als Variablenname und Capture-Lösung 2 (NP-TCO). Satz Kontaktzeit auf 90 s bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 &amp;mgr; l / min undgesetzt Strömungspfad auf den zweiten. Wählen Sie das Capture-3-Panel; deaktivieren Capture-Lösung als Variablenname und Capture-Lösung 3 (AP1497-Tz). Set Kontaktzeit auf 180 s bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / min eingestellt und Strömungspfad zum Zweiten. </li><li> Wählen Sie Setup ausführen und Strömungspfad zu: 2-1. Wählen Sie zweimal auf Weiter. Platz-Lösung in Ampullen Reagenzhalter 2 und Verdünnungsreihe in 96-Well-Platte dafür, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen. Sparen Methodenvorlage und starten Bindungsassay. Kinetischen Analysedaten sind in Fig. 5 gezeigt. </li></ol>

<ol>
	<li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine/trans-cyclooctene+cycloaddition.">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).</li><li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes.">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).</li><li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+intracellular+biomarkers+and+mediators+of+cell+activation+using+nanosensors+and+bioorthogonal+chemistry.">Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry.</a> ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).</li><li>Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+probes+for+polo-like+kinase+1+imaging+and+quantification.">Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).</li><li>Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diels-Alder+cycloaddition+for+fluorophore+targeting+to+specific+proteins+inside+living+cells.">Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).</li><li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry+amplifies+nanoparticle+binding+and+enhances+the+sensitivity+of+cell+detection.">Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection.</a> Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).</li><li>Liong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+pathogen+detection+using+bioorthogonal+chemistry+and+diagnostic+magnetic+resonance.">Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance.</a> Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).</li><li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+bioorthogonal+chemistry+enables+immobilization+of+in+situ+modified+nanoparticles+and+small+molecules+for+label-free+monitoring+of+protein+binding+and+reaction+kinetics.">On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics.</a> Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).</li><li>Pol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+correct+protein+concentration+for+kinetics+and+affinity+determination+in+structure-function+analysis.">The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis.</a> J Vis Exp. (37), e1746 (2010).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+proteins+to+which+small-molecule+probes+and+drugs+bind+in+cells.">Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).</li><li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+affinity+and+kinetic+analysis+of+targeted+small+molecule-modified+nanoparticles.">Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles.</a> Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).</li><li>Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+targeting+of+nanoparticles+by+multivalent+attachment+of+small+molecules.">Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules.</a> Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).</li><li>Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+assay+for+chloramphenicol.">Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol.</a> Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).</li><li>Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-mediated+multivalent+binding+for+the+enhanced+capture+of+tumor+cells.">Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).</li><li>Keelan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotoxicology:+nanoparticles+versus+the+placenta.">Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta.</a> Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).</li><li>Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+size+and+surface+properties+determine+the+protein+corona+with+possible+implications+for+biological+impacts.">Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).</li><li>Lundqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+protein+corona+around+nanoparticles:+a+test+study.">The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study.</a> ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).</li><li>Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvalent+interactions+in+biological+systems:+implications+for+design+and+use+of+multivalent+ligands+and+inhibitors.">Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).</li><li>Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+random+and+oriented+antibody+immobilization+techniques+on+the+binding+capacity+of+immunosensor.">Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor.</a> Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).</li><li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions:+progressing+towards+the+dream.">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).</li><li>Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+based+assay+for+the+detection+and+characterization+of+promiscuous+inhibitors.">Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors.</a> J Med Chem. 51, 574-580 (2008).</li><li>Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RGS+protein+inhibitor+CCG-4986+is+a+covalent+modifier+of+the+RGS4+Galpha-interaction+face.">The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face.</a> Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier beschriebene Methode Capture-Cycloaddition ermöglicht eine schnelle, reversible Immobilisierung von modifizierten Nanopartikeln und kleine Moleküle für markierungsfreie Chip-basierte Interaktion und kinetische Untersuchungen. Die Immobilisierung Protokoll kann in Minuten erfordern &lt;10 uM Konzentrationen von niedermolekularen Liganden durchgeführt werden. Durch Modulation Liganden-Konzentration und Kontaktzeit Immobilisierung Dichten genau kontrolliert werden. Unsere Daten zeigen, dass auf dem Chip bioort...

Effizienten Konjugationsreaktionen sind wertvolle Werkzeuge für die Befestigung bioaktiver Moleküle auf Oberflächen für eine Vielzahl von Anwendungen der Biotechnologie. Vor kurzem hat die sehr schnell bioorthogonale [4 +2]-Cycloaddition zwischen trans-Cycloocten (TCO) und 1,2,4,5-Tetrazins (Tz) wurde verwendet, um Zelloberflächen subzellulärer Strukturen, Antikörpern und Nanopartikeln zu markieren ein. - 7 Hier verwenden wir die [4 +2]-Cycloaddition in Verbindung mit Antigen / Antikörper-Capture (GST / anti-GST) für reversible on-Chip-Synthese von Mehrkomponenten-Strukturen für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Interaktionsanalyse und Überwachung der Prozess in Echtzeit (Abbildung 1). 8,9 Insbesondere die Einnahme-Cycloaddition Strategie ermöglicht Regeneration Oberfläche mit einem festgelegten Protokoll. 8 Als Folge Montage stabile Sensorflächen mit der Kontrolle über Liganden Orientierung und Dichte für eine Vielzahl von neuen Tests Formate ist nun möglich. MitDiese Strategie, die wir zeigen die Immobilisierung von TCO / Tz-derivatisierten kleine Moleküle und zeichnen die Cycloaddition Raten in einer Vielzahl von Pufferbedingungen. Wir wählten die bekannte Interaktion zwischen FKBP12 und einem Molekül, das AP1497 10-12 FKBP12 bindet, als ein Beispiel, um zu überprüfen, dass das Capture-Cyclo Strategie erhält die Fähigkeit des kleinen Moleküls um sein Ziel zu interagieren, wenn entweder direkt an immobilisierte GST-Antigene gebunden oder immobilisiert Nanopartikel (NP). Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile. Zuerst wird nun die reversible Immobilisierung von kleinen Molekülen auf Sensorchips möglich. Zweitens TCO / Tz Immobilisierung kleiner Moleküle ermöglicht auch markierungsfreie Interaktionsstudien, die die Ausrichtung der kanonischen SPR Studien umzukehren, und kann eine komplementäre Ansicht eines Bindungswechsel bieten. Drittens, ermöglicht dieses Verfahren die mikrofluidische Synthese gezielt Nanopartikel und sofortige Auswertung ihrer Binding Eigenschaften. Dies verspricht, die Effizienz der Auswertung oder Screening-Nanopartikel gezielt zu verbessern und auch eine Verringerung der Mengen von Nanopartikeln erforderlich. 13-15 Viertens, kann dieser Ansatz die Reaktionskinetik der bioorthogonale Cycloadditionsreaktionen in Echtzeit unter Dauerstrom zu messen. Schließlich ist die TCO / Tz Immobilisierung Chemie in Gegenwart von Serum robust. Insgesamt erwarten wir, dass dieses vielseitige Ansatz wird allgemein erleichtern Aufbau stabiler Sensorflächen für eine Vielzahl von mikrofluidischen Studien mit Relevanz für die in-vitro-und in-vivo-Zellanwendungen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sensor Chip CM5</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coupling kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1000-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST capture kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAP-10 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0854-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST, lyophilized in 1X PBS</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Z02039</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhFKBP12</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3777-FK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant P-20</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1000-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine 2.0</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1003-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba spin desalting column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>89882</td>
			<td>7 K MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>UFC810096</td>
			<td>100 K centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCO-OH</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCO-NHS</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tz-BnNH2</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tz-NHS</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td>764701</td>
			<td>Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-NH2 = CLIO-NH2</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP1497, AP1497-Tz</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Biosensor</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Biacore T100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic on-chip capture-cycloaddition reaction to reversibly immobilize small molecules or multi-component structures for biosensor applications

Methoden für die schnelle Oberfläche Immobilisierung von bioaktiven kleinen Molekülen mit der Kontrolle über Orientierung und Immobilisierungsdichte für Biosensor und Microarray-Anwendungen sehr wünschenswert. In dieser Studie verwenden wir eine hocheffiziente kovalente bioorthogonale [4 +2]-Cycloaddition zwischen trans-Cycloocten (TCO) und 1,2,4,5-Tetrazins (Tz), um den mikrofluidischen Immobilisierung von TCO / Tz-derivatisierten Moleküle ermöglichen . Wir überwachen den Prozess in Echtzeit unter Dauerdurchflussbedingungen mit Oberflächenplasmonresonanz (SPR). Reversible Immobilisierung zu ermöglichen und sich die experimentellen Bereich der Sensorfläche verbinden wir eine nicht-kovalente Antigen-Antikörper-Einfang-Komponente mit der Cycloaddition. Durch abwechselndes präsentiert TCO oder Tz Einheiten an die Sensoroberfläche, mehrere Capture-Cycloadditionen nun auf einer Sensoroberfläche für On-Chip-Aufbau und Wirkungsstudien zu einer Vielzahl von Mehrkomponentenstrukturen. Wir illustrate dieses Verfahren mit zwei verschiedenen Experimenten Immobilisierung auf einem Biosensorchip, ein kleines Molekül, AP1497, die FK506-bindendes Protein 12 (FKBP12) bindet und die gleiche kleine Molekül als Teil eines immobilisierten und in situ-funktionalisierten Nanopartikel.

Daten und Zahlen wurden von der Referenz 8 angepasst. Effiziente reversible Immobilisierung von bioaktiven kleinen Molekülen mit der Kontrolle über Ausrichtung und Dichte spielt eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von neuen Anwendungen in der Biosensorik. Verwendung des schnellen bioorthogonalen Reaktion zwischen TCO und Tz beschreiben wir ein Verfahren zur schrittweisen Aufbau und Regeneration von Ligand Oberflächen unter Beibehaltung der biologischen Aktivität. Fig. 2</str...

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Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Wir präsentieren eine Methode für die schnelle, reversible Immobilisierung von kleinen Molekülen und funktionalisierte Nanopartikel Baugruppen für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Studien mit sequentiellen On-Chip-Cycloaddition bioorthogonale Chemie und Antikörper-Antigen-Capture.

Mikrofluidik-On-Chip-Capture-Cycloaddition reversibel Unbeweglichkeitseffekt kleine Moleküle oder Mehrkomponenten-Strukturen für Biosensor-Anwendungen

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

microfluidic-on-chip-capture-cycloaddition-reaction-to-reversibly

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.7K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital.  Wir präsentieren eine Methode für die schnelle, reversible Immobilisierung von kleinen Molekülen und funktionalisierte Nanopartikel Baugruppen für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Studien mit sequentiellen On-Chip-Cycloaddition bioorthogonale Chemie und Antikörper-Antigen-Capture. 

Serie: Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications