Nos gustaría dar las gracias a la Sra. Christine A. Winters por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Neurociencia Básica del Programa de Investigación Intramural NINDS, NIH (Z01 NS002610).

El método descrito aquí se ha desarrollado utilizando instrumentos específicos, herramientas y software. Debido a que los laboratorios no va a utilizar la misma configuración experimental del enfoque es generalizado en lo posible. 1. Congelación Rápida El método analítico que se describe es absolutamente dependiente de enfoques criogénicos para: 1) el &quot;criofijación&quot; de las células o tejidos de una manera que preserva cuantitativamente la distribución de los componentes del tejido difusibles y elementos químicos como lo fueron en células vivas en el instante de la congelación , y 2) la preparación de ultrafina cryosections adecuado para formación de imágenes y análisis en un TEM. Estas técnicas se describen brevemente a continuación, pero los detalles necesarios para reproducir estos procedimientos en otros laboratorios están más allá del alcance de este artículo. Los lectores interesados ​​se denominan excelentes artículos recientes 9,14. Atención: En esta sección se describe el uso del jabón letano efied, que es altamente inflamable y potencialmente explosivo; se deben tomar las precauciones adecuadas. Operador también debe estar familiarizado con nitrógeno líquido (LN 2) las precauciones de seguridad, incluyendo la capa protectora de laboratorio, gafas y guantes cryoresistant. Nota: Aquí y en todas partes, todas las herramientas (pinzas, etc) que se utilizan para manejar muestras congeladas deben refrigerarse en LN 2 antes de su uso para evitar la descongelación accidental. Las células cultivadas sobre cubreobjetos <ol><li> Prepare un dispositivo de congelación de inmersión por condensación de etano gaseoso a -160 ° C en la LN 2 refrigerado por pocillo central. Llenar hasta la marca y tapar el pozo con la tapa basculante de aluminio cuando no esté en uso. </li><li> El uso de cuñas de papel de filtro, seque cubreobjetos de plástico de células cultivadas bajo condiciones apropiadas experimentalmente a una fina película acuosa. Seque desde el borde a fin de evitar el contacto con el tejido, la película residual ideal, determinado por ensayo y error, es tan delgada como sea posible pero sin then cuanto a evaporarse y permitir el secado de la superficie del tejido. </li><li> Sosteniendo el cubreobjetos por el borde con una pinza de sujeción, sumerja rápidamente en etano líquido, ya sea manualmente o utilizando el émbolo gravedad-alimentado. </li><li> Coloque el cubreobjetos congelado en un recipiente de espuma de poliestireno en las inmediaciones de LN 2, lo suficientemente grande para manipular el número deseado de cubreobjetos en recipientes de almacenamiento a largo plazo. Se recomiendan las latas con tapón de rosca de aluminio que no se aprovechan bajo LN 2. </li></ol> La congelación rápida de rodajas de cerebro cultivadas <ol start="5"><li> Bajo un microscopio de disección, ver y orientar una rebanada del hipocampo organotípicos, sin molestias y todavía unido a la inserción de la membrana cultura. Coloque los puntos de referencia en la membrana cerca del borde de la rebanada con un tipo Sharpie negro pluma y fotografía. </li><li> Todavía bajo el microscopio, cortar aprox. 5 x 5 mm cuadrados de membrana con cortes individuales centradas en las plazas. Evite tocar la rebanada o doblar el membrane. </li><li> Montar un trozo de membrana soportada, amortiguado por un ¼ de la almohadilla de agar de diámetro, en un disco de aluminio diseñada por encargo para adaptarse a una cryoultramicrotome (descrito más adelante). Rápidamente congelar la rebanada por neumáticamente impulsándola contra un bloque de zafiro LN 2 enfriado por medio de un dispositivo de &quot;congelación Slam&quot; personalizado. </li><li> Mover a almacenamiento como se describe para las células cultivadas. </li></ol> 2. Cryosectioning Advertencia: producir con éxito cintas secas cortadas de secciones ultrafinas, mientras que sencillo y lógico, requiere de un entrenamiento, paciencia y mucha práctica. <ol><li> Hornear un cryoultramicrotome equipado con un cryoattachment y enfriar a -135 ° C. </li><li> Cortar cubreobjetos congelados en aprox. 3 x 3 mm cuadrados utilizando un escalpelo afilado previamente enfriada. Incrustar piezas con culturas hacia arriba en un líquido &quot;cryoglue&quot; viscoso (una mezcla 01:06 de etanol y 2-propanol 11), en la norma 3pins de aluminio de diámetro mm diseñado para adaptarse a la tirada de muestras microtomo. Evite fugas cryoglue sobre la superficie de cultivo. Solidificar cryoglue mediante la reducción de la temperatura Caja criogénica a ≤ -160 ° C. <ul class="lalpha"><li> Por cortes de cerebro congelado, fije firmemente discos directamente a un mandril espécimen medida por medio de un collar de tornillo. </li></ul></li><li> Recorte las áreas seleccionadas de las muestras congeladas - por ejemplo, áreas de células ricas en piezas cubreobjetos o áreas identificadas de rebanadas - para un aprox. Cara del bloque 250 x 250 micras y aproximadamente 100 micras de profundidad utilizando una herramienta de diamante de corte. </li><li> Cintas Dry-corte de secciones delgadas de CA. -160 ° C usando un diamante cryoknife 35 °, esencialmente como se describe en referencs 4, 9. Velocidad de corte y superficie libre del cuchillo se determinan empíricamente, un buen punto de partida es 0,4 a 0,6 mm / seg a 9 °. El espesor nominal, es decir, muestra de antemano, de secciones hidratados is típicamente 80 nm, aunque secciones son en realidad 1,5-2.0x más gruesa, debido principalmente a la compresión. Para seccionamiento satisfactoria, un dispositivo antiestático es esencial. Coloque la punta de ionización de los dispositivos de 0,5 a 1 cm del borde de la cuchilla y ajustar la potencia de salida hasta que se producen cintas satisfactorias de secciones. </li><li> Emplear indagaciones pestañas pegando (con epoxi) pestañas para aplicadores de madera. Usando una sonda de este tipo, recoger y secciones de transferencia de la parte de atrás del cuchillo sobre, películas de soporte Pioloform carbono recubierto de resplandor descargada emitidos más de 100 de malla de las redes de cobre doblado y que descansan sobre un indio sobre de aluminio-medio doblado en un estante detrás de trabajo el cuchillo. Veces más de la mitad superior de la parrilla y el sobre, presione con una herramienta de prensado en frío. </li><li> Transferencia de rejillas envueltos a una celda de la malla conveniente y tienda en una lata de aluminio como se describe en el paso 1.4. </li></ol> 3. Criotransferencia de muestras para el microscopio electrónico El instrumento básico para EPMAen este laboratorio es un microscopio electrónico analítico operado a 120 kV y equipado para criomicroscopía, es decir, diseñado con un vacío limpio, espécimen-área anticontaminator, una cámara digital 2K x 2K de alta sensibilidad y soporte de la muestra criotransferencia. Compruebe de antemano la alineación microscopio y las condiciones de funcionamiento en ambos modos de bajos y de gran aumento y confirme una columna de vacío satisfactoria, idealmente ≤ 10 -7 Torr. Ponga a punto de ser necesario. <ol><li> Compruebe que el aislamiento por vacío del componente de Dewar del cryoholder es satisfactoria. Bomba según sea necesario. </li><li> Enfriar la cryoholder a su temperatura mínima, por lo menos 160 º C, mientras que en alto vacío dentro de la platina del microscopio, suelte el cable de conexión al titular a su caja de control. Incline el goniómetro 45 ° hacia la derecha antes de retirar el soporte para minimizar LN 2 derramar en el operador y microscopio superficies. </li><li> Prepare el cryoworkstation sobremesa enfriando el aislar integrald taza a ≤ 160 ° C. </li><li> Transferencia (quickly!) la cryoholder enfriado desde microscopio para crio estación de trabajo. Repliegue escudo heladas del titular. </li><li> Recuperar bajo LN 2 un sándwich rejilla de almacenamiento y el lugar en la mesa de trabajo de la cryoworkstation. Un anillo de retención para el pocillo de muestra del titular también se coloca sobre la mesa. </li><li> Abra el sobre de indio y mover la rejilla plegable cerrado al pozo del espécimen cryoholder. Asegure la rejilla con el anillo de retención con la herramienta de llave suministrada y cerrar el escudo de escarcha. </li><li> Quite rápidamente la cryoholder del cryoworkstation y colocarlo en la bolsa de aire del microscopio y pasar por la secuencia de bombeo lo más rápido posible. En la inserción, debe haber una interrupción mínima de la columna de vacío. </li><li> Goniómetro Retorno a 0 ° de inclinación. Volver a conectar y reenergize la caja de control y confirme que la temperatura de la muestra es ≤ 150 ° C. </li><li> Vuelva a llenar el Dewar delContenedor de muestras y permitir que el vacío y la temperatura para recuperarse plenamente. </li></ol> 4. Inspección Visual de las secciones <ol><li> Repliegue el escudo helada del soporte para exponer la muestra y encienda el haz de electrones. </li><li> Visualmente evaluar la muestra a bajo aumento, por lo general 250X, y la baja iluminación. Como se ilustra en la Figura 1, las secciones deben ser delgada y lisa, no plegado o superposición, plana y bien unido a la película de soporte, y generalmente no oscurecido por barras de la rejilla. </li><li> Opcionalmente fotografiar secciones seleccionadas. (NOTA: Reducir al mínimo la exposición del haz, ya que las secciones congeladas hidratado son muy susceptibles al daño inducido por haz.) Utilice la etapa automatizado goniómetro digital para almacenar coordenadas de las secciones seleccionadas. </li></ol> 5. La liofilización de las Secciones <ol><li> De secado por congelación secciones mediante el aumento de la temperatura titular a ca. -100 ° C durante ~ 30 min. </li><li> Recool titular a -160 ° C o menos. </li><li&gt; Antes de imágenes, apague la unidad de control cryoholder y cable controlador físicamente desconexión para evitar la imagen de deriva debido al ciclo térmico y / o captador de vibraciones. </li></ol> 6. Obtención de imágenes de células y orgánulos Imágenes estructurales de las secciones liofilizados se obtienen a ca. -160 ° C como en dosis bajas, las imágenes para bajar de cero grabados digitalmente utilizando una cámara CCD de exploración lenta 2k x 2k controlado por software apropiado. <ol><li> Active la EM en modo hi-mag. </li><li> Elija e imagen en ~ 2000 X (como TIFF, ver Figura 2) celdas seleccionadas y áreas subcelulares de interés en las secciones de alta calidad cuyas ubicaciones fueron registrados y almacenados previamente. (NOTA: Las secciones secas ahora son sustancialmente menos frágiles y menos susceptibles al daño por haz de electrones. </li><li> Evaluar las imágenes con el fin de seleccionar las regiones de interés (ROI) para el análisis de rayos X. Este paso se puede realizar opcionalmente fuera de línea, en cuyo caso la EM se puede girarfuera y el espécimen se dejó calentar hasta temperatura ambiente. </li></ol> 7. Adquisición de Rayos X Spectra Espectros de rayos X se puede grabar utilizando cualquiera de los diversos comercial o de diseño personalizado de rayos X sistemas de análisis mínimamente consistentes en una placa de rayos X (EDX) detector de dispersión de energía, asociados electrónica del pulso en el procesador y el software de adquisición y visualización compatible. (El sistema utilizado en esta práctica se describe en la Tabla 1.) <ol><li> Configurar la EM para la adquisición de rayos X mediante la inserción del detector EDX en la columna (si es necesario), la retirada de la apertura del objetivo, y la inserción y el centrado de las aberturas radiación parásita. Ajuste el cryoholder a la temperatura más baja a la que se evita la contaminación de escarcha de la muestra, pero por lo menos por debajo de -100 ° C. </li><li> Incline el soporte de 20 ° hacia el detector. </li><li> En condiciones de formación de imágenes de campo amplio, y asumiendo uno tiene la intención de analizar la matriz de un individual mitocondrias, elija una mitocondria para el análisis, se mueve hacia el centro del campo y el enfoque. </li><li> Vaya al modo de contado (en algunos microscopios sólo convergen el haz usando segundo enfoque del condensador) y aumentar la intensidad del haz de aprox. 3 nA (medido con una taza de Faraday o similar) en un lugar de 100 nm. </li><li> Inicie el software de adquisición de espectro y empezar 100 seg adquisiciones, que se puede ver el tiempo en directo en la pantalla del monitor. Ahorra espectro registrado (Figura 2). Se prefiere el formato de la EMSA estándar de la industria. </li><li> Apague el EM y transferir el archivo (s) de múltiples espectros a una (sin conexión) estación de trabajo de análisis. </li></ol> 8. Análisis de X-ray Spectra Análisis cualitativo Un espectro EDX (Figura 2, recuadro) es esencialmente un gráfico XY de la intensidad de rayos X de energía vs. Spectra contiene información cualitativa y cuantitativa sobre la composición elemental de tanalizó el volumen, en la que la energía &quot;característica&quot; de un pico identifica el elemento que da lugar a que el pico mientras que la intensidad refleja la cantidad de ese elemento. Los picos característicos montan en la parte superior de un fondo que varía lentamente, el &quot;continuum&quot;. (La leyenda de la Figura 2 se analiza más detalles sobresalientes de espectros EDX.) La energía de los colectores de pico para toda la tabla periódica están definidos por la estructura electrónica conocida de elementos, por lo tanto, todos los enlaces de software EDX a una base de datos que identifica automáticamente los componentes de un analito. En un contexto fisiológico, los elementos de interés general que se adaptan bien al análisis EDX incluyen Na (K α en 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) y Ca (3,69 keV). <ol><li> Tome ventaja de la base de datos de software disponible y las rutinas de asignación de picos para identificar los principales elementos en los espectros. En una muestra biológica esperar encontrar picos de Na, Mg, P, S, Cl, K y Ca. (ATENCIÓN:Los dos últimos elementos se superponen!) </li></ol> Análisis cuantitativo El análisis cuantitativo de los espectros EDX consiste en extraer el área integrada de los picos identificados y convertir este valor a una concentración. Para el análisis biológico, el enfoque establecido es el método pico / continuo Pasillo 4,7,10, que se aprovecha del hecho de que la intensidad del continuo (definido anteriormente y en la Figura 2) es proporcional a la masa seca del volumen analizado . Por lo tanto, la relación de pico de área de zona / continuo, cuando se compara con la misma relación en los espectros de las normas de composición conocida, especifica la concentración en el compartimento celular específico. Tenga en cuenta que este enfoque proporciona concentraciones en unidades de moles por peso, por lo general expresa en mmol / kg de peso seco. Esta unidad es inusual y para la interpretación puede requerir la conversión adicional a, por ejemplo, mmol / L de peso húmedo o / mg de proteína mmol, como se describe ELsewhere 4,10. <ol start="2"><li> Extracto de las áreas de pico (y estimaciones de error) de elementos biológicos entre Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), es decir, Na, Mg, P, S, Cl, K y Ca, utilizando una de las rutinas de ajuste integrado en el software de análisis (véase la Tabla 1, especialmente la nota 4). Este laboratorio utiliza Simplex o múltiple de mínimos cuadrados apropiado. Tenga en cuenta que este ajuste requiere una cuidadosa atención a la resolución de la superposición entre K y Ca picos (ver Figura 2). </li><li> Integrar el continuo entre 1,45 a 1,61 keV. Regiones libres de interferencia alternativos pueden ser utilizados. </li><li> Calcular proporciones pico / continuo y luego concentraciones en comparación con las normas. Propagar errores a través del análisis. </li><li> Utilice el software estadístico estándar y las fórmulas para calcular los promedios que reflejan la variabilidad biológica. </li></ol>

<ol>
	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. 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Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

Los autores informan de ningún conflicto de intereses.

El método analítico basado en microscopio electrónico de que aquí se presenta permite la detección, identificación, y cuantificación de varios elementos de interés biológico, incluidos Na, K, P, Ca y especialmente. Estos análisis pueden llevarse a cabo en subcelular, es decir, dentro de la orgánulo, la resolución debido a la capacidad de localizar e identificar estructuras de interés en imágenes de alta calidad de criosecciones preparados a partir de muestras congeladas rápidamente. Tenga en cuen...

Los iones de calcio son, posiblemente, la entidad de señalización celular más importante y versátil en biología, que juega un papel esencial en los procesos normales tan diversos como la transmisión sináptica y la expresión génica. Por otro lado, el calcio es igualmente importante en la muerte celular. En particular, la desregulación del calcio es un factor clave en el daño neuronal en el ictus, Parkinson, Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas 3,5. Por lo tanto, es críticamente importante entender cuantitativamente cómo se distribuye de calcio dentro de las células, y cómo esto cambia después de estímulos fisiológicos o fisiopatológicos. Este objetivo se complica por el hecho de que el calcio se distribuye dinámicamente entre los dos estados físicos - libre en solución o unido a un sustrato - y que las concentraciones de calcio celular cambian a lo largo de varios órdenes de magnitud, como consecuencia de la estimulación. Si bien existen varias metodologías avanzadas disponibles para el análisis de free de calcio intracelular, la determinación de las concentraciones de calcio total en compartimentos intracelulares definidos se limita de manera realista a un enfoque, a saber, microanálisis de sonda de electrones (EPMA). EPMA es una técnica que las parejas un espectrómetro de rayos X para un microscopio electrónico de transmisión (TEM). El cañón de electrones TEM se centra una sonda electrónica submicras estacionaria en una región subcelular de interés y los rayos X de elementos específicos emitidos como resultado del bombardeo de electrones son recogidos y analizados (ver referencias 7, 4 para revisiones técnicas detalladas). Ventajas de EPMA incluyen sola resolución a nivel de orgánulo y sensibilidad submilimolar. En la práctica, sin embargo, requiere EPMA cryotechniques e instrumentos especializados para la preparación y análisis de muestras. Aquí se describen las herramientas, técnicas e instrumentos adecuados para la medición de calcio intracelular usando EPMA. Calcio intramitocondrial es de i especiall interés en cuenta el papel fundamental que desempeña la sobrecarga de calcio mitocondrial en las enfermedades neurodegenerativas.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

En este artículo se describen las herramientas, las técnicas y los instrumentos adecuados para las mediciones cuantitativas de contenido elemental intracelular mediante la técnica conocida como microanálisis de sonda de electrones (EPMA). Calcio intramitocondrial es un enfoque particular debido al papel crítico que la sobrecarga de calcio mitocondrial desempeña en las enfermedades neurodegenerativas. El método se basa en el análisis de los rayos X generados en un microscopio electrónico (EM) por la interacción de un haz de electrones con la muestra. Con el fin de mantener la distribución natural de los elementos difusibles en especímenes de microscopía de electrones, EPMA requiere &quot;criofijación&quot; de tejido seguido de la preparación de secciones criogénicas ultrafinas. La congelación rápida de las células cultivadas o cultivos de cortes organotípicos se lleva a cabo por inmersión de congelación en etano líquido o por la congelación de golpe contra un bloque de metal en frío, respectivamente. Criosecciones nominalmente 80 nm de espesor se cortan en seco con un cuchillo de diamante en ca. -16076; C, montada en / rejillas de cobre Pioloform recubierto de carbono y cryotransferred en una crio-EM utilizando un soporte cryospecimen especializada. Después de la inspección visual y la cartografía de la ubicación a ≤ -160 ° C y la dosis de electrones de baja, cryosections congelados hidratado son liofilizada a -100 º C durante aproximadamente 30 min. Imágenes de nivel de Orgánulos de criosecciones secos se registran, también a baja dosis, por medio de una cámara CCD de barrido lento y regiones subcelulares de interés seleccionado para el análisis. Los rayos X emitidos desde ROI por un centrado, sonda de electrones estacionaria, de alta intensidad son recogidos por una placa de rayos X de dispersión de energía (EDX) espectrómetro, procesada por la electrónica asociada, y presentada como un espectro de rayos X, es decir, una gráfico de la intensidad de rayos X de energía vs. Software adicional facilita: 1) la identificación de los componentes elementales de sus &quot;características&quot; energías pico y huellas dactilares, y 2) el análisis cuantitativo mediante la extracción de las áreas de pico / fondo. Este documento concluye con dos ejemplos que ilustran típicaAplicaciones EPMA, una en la que el análisis de calcio mitocondrial proporcionado una visión crítica de los mecanismos de lesión excitotóxica y otro que revelaron la base de la resistencia a la isquemia.

Las células del cerebro típicamente sufrir una lesión excitotóxica como resultado de la liberación de neurotransmisores patológico que se produce en condiciones isquémicas. EPMA fue fundamental para descubrir cómo la capacidad de las mitocondrias neuronales para secuestrar grandes cantidades de calcio subyace al mecanismo de la lesión. La micrografía de electrones en la Figura 3 ilustra la apariencia de las mitocondrias en criosecciones liofilizados de las neuronas del hipocampo en cultivo con...

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Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

En este trabajo se describe la aplicación de la microscopía electrónica cryoanalytical para la medición cuantitativa de contenido de calcio total y su distribución en la resolución subcelular en muestras biológicas fisiológicamente definidos.

Medición de calcio total en neuronas por Sonda de Electrones X-ray microanálisis

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

measurement-total-calcium-neurons-electron-probe-x-ray

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K vistas.  National Institutes of Health.  En este trabajo se describe la aplicación de la microscopía electrónica cryoanalytical para la medición cuantitativa de contenido de calcio total y su distribución en la resolución subcelular en muestras biológicas fisiológicamente definidos. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

A gran escala de grabación de las neuronas por medio de sondas de silicio móviles en comportarse roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the structure of neurites is critical to understanding how these processes move materials and signals that support synaptic communication. Electron microscopy (EM) has been traditionally used to assess the ultrastructural features within neurites; however, the exposure to organic solvent during dehydration and resin embedding can distort structures. An important unmet goal is the formulation of procedures that allow for structural evaluations not impacted by such artifacts.
Here, we have established a detailed and reproducible protocol for growing and flash-freezing whole neurites of different primary neurons on electron microscopy grids followed by their examination with cryo-electron tomography (cryo-ET). This technique allows for 3-D visualization of frozen, hydrated neurites at nanometer resolution, facilitating assessment of their morphological differences. Our protocol yields an unprecedented view of dorsal root ganglion (DRG) neurites, and a visualization of hippocampal neurites in their near-native state. As such, these methods create a foundation for future studies on neurites of both normal neurons and those impacted by neurological disorders.

To preserve neuronal processes for ultrastructural analysis, we describe a protocol for plating of primary neurons on electron microscopy grids followed by flash freezing, yielding samples suspended in a layer of vitreous ice. These samples can be examined with a cryo-electron microscope to visualize structures at the nanometer scale.

Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato de Calcio La transfección de Primaria neuronas del hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Localización del Locus Coeruleus en el cerebro de ratón

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.