Varias personas contribuyeron al trabajo descrito en este documento. CVG construyó el montaje experimental, y LS, SHC, y CVG realizado los experimentos. CVG y SHC escribió el manuscrito. Todos los autores participaron posteriormente en el proceso de revisión y aprobó la versión final del manuscrito. Damos las gracias a Paul Sternberg para la cepa GCaMP. Algunas cepas de nematodos utilizadas en este trabajo fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que es financiado por el NIH Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR). El programa de análisis de imagen MATLAB se adaptó del que se utiliza en 18. Los autores recibieron el apoyo de la Universidad de Boston y el Massachusetts Life Sciences Center.

1. Configuración óptica <ol><li> El uso de un microscopio compuesto estándar con capacidades de imagen de epifluorescencia. Utilizamos una Nikon Eclipse Ti-U microscopio invertido con un iluminador Intensilight HG. </li><li> Para una mejor imagen y calidad de la señal utiliza un gran aumento, objetivo gran apertura numérica. Nos suelen utilizar una Nikon X60 1,4 NA objetivo de inmersión en aceite. En algunos casos es posible usar menor aumento (X40, X20) dependiendo del nivel de expresión del fluoróforo y fuerza de la señal. </li><li> Utilice una alta sensibilidad enfriado cámara CCD, tal como una cámara de Andor Clara para maximizar la sensibilidad de la imagen y minimizar el ruido de fondo. </li><li> Para fluoróforos individuales de color utilizan el filtro microscopio de fluorescencia estándar diseñado para establecer la longitud de onda particular del fluoróforo. Para GCaMP utilizar un filtro estándar de GFP conjunto optimizado para la excitación a 488 nm y emisión a 525 nm. No hay modificaciones ópticas se necesitan más. </li><li&gt; Para fluoróforos ratiometric, tales como cameleon, utilizar un sistema de imagen dual de tal manera que las imágenes pueden ser idénticos simultáneamente, se captura en dos longitudes de onda separadas. Esto se logra mediante la proyección de las imágenes de doble lado a lado en la cámara. Una configuración sencilla de lograr esto, utilizando componentes ópticos básicos en una placa de pruebas de calidad óptica, se ilustra en la figura 1. Se compone de: <ol class="ualpha"><li> Un filtro microscopio ajustado con 440 ± 20 nm de excitación y filtro de 455 nm de paso largo espejo dicroico. </li><li> Una máscara de imagen colocada en el plano de la imagen inicial inmediatamente fuera de la imagen de microscopio puerto (donde el sensor de la cámara CCD generalmente se sentaban). Esto limita el campo de visión de tal manera que se llene sólo un medio de sensor de la cámara. La colocación de esta máscara a los resultados de primer plano de la imagen en las fronteras y la superposición de imágenes nítidas sin que las dos imágenes se proyectan de lado a lado. </li><li> La lente de primer relé establecer una longitud focal lejos de tél plano de la imagen inicial tal que colima la luz. </li><li> Un espejo dicroico que divide la luz en las dos longitudes de onda de formación de imágenes separadas o canales que reflejan un color (&gt; 515 nm, amarillo), mientras que la transmisión de la otra (&lt;515 nm, cyan). </li><li> Filtros de emisiones (filtros de paso de banda) que restringen aún más la luz transmitida a las longitudes de onda específicas de imagen (cian a 485 ± 40 nm y amarillo a 535 ± 30 nm), </li><li> Las lentes de relé segundos (uno para cada canal) colocados en las trayectorias de rayos de tal manera que se vuelve a enfocar la luz a un segundo plano de imagen en la cámara CCD. </li><li> Un par de espejos y un segundo espejo dicroico dirige las trayectorias de rayos de tal manera que las dos imágenes recombinan y se proyectan de lado a lado en el sensor de la cámara CCD. Figura 4A muestra un ejemplo de la imagen resultante. </li></ol></li><li> La alineación óptica inicial: Iniciar la configuración y alineación de la óptica con un alto contraste image utiliza un objetivo de bajo aumento y se transmite de amplio campo de iluminación de luz (un rotulador negro dibujado en un portaobjetos de microscopio funciona bien). Llevar la imagen para enfocar a través de los oculares del microscopio y después se cambiaron al puerto microscopio para ser utilizado. Con la iluminación de luz de alta visualizar la imagen en una tarjeta en el plano focal inicial (unos pocos centímetros fuera del puerto microscopio). Coloque la primera lente de retransmisión (C) en la trayectoria del haz de tal manera que es una distancia focal desde el plano focal inicial y colima la luz mientras no desviar la trayectoria del haz (es decir, se centra directamente en la trayectoria del haz). Coloque la máscara en el primer plano focal, ajustado para restringir medio del campo de visión y producir una frontera nítida en la imagen. Coloque los espejos y filtros (D, E, G) de manera que la trayectoria del rayo se mantiene paralelo a la superficie de la mesa y se ejecuta en dos trayectorias paralelas de lado a lado, como se muestra en la Figura 1B. Centro de las lentes de relé segunda (F) en sus respectivas trayectorias de rayos ymoverlos hacia atrás y adelante a lo largo de los caminos para llevar las imágenes a un foco en una ficha colocada fuera el sensor de la cámara CCD será. Si se hace correctamente las dos imágenes deben ser parfocal con los oculares del microscopio y otros puertos de cámara. Por último colocar la cámara en posición y ajustar la alineación. </li><li> Alineación Fine Tuning óptico: Utiliza la imagen dual visto por la cámara CCD para afinar la alineación óptica. Utilizar una imagen de alto contraste y comenzar con un menor aumento, el cambio a un aumento mayor para la alineación final. Coloque la imagen transmitida (cian canal en la Figura 1B) para cubrir una media de campo de la cámara de vista moviendo la cámara en la posición X e Y. la imagen reflejada (canal amarillo en la Figura 1B) para cubrir la otra mitad del campo de ver mediante el ajuste de las últimas dos espejos (G) en su trayectoria del haz. Optimizar el enfoque moviendo la lente segundo relé para cada canal de un lado a otro a lo largo de la trayectoria del haz. Si se dejainalterada la configuración óptica debe ser estable y sólo requieren un ajuste excepcional sintonía fina. </li></ol> 2. Preparación de la muestra y la adquisición de datos. <ol><li> Adquirir animales que expresan un fluoróforo sensible al calcio en la neurona de interés desde el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) o de otras fuentes. Alternativamente animales transgénicos se pueden construir utilizando estándar de C. elegans técnicas. Expresión de células individuales no es necesario (y, a veces no es deseable si múltiples neuronas han de ser investigados, véase 12), siempre y cuando las imágenes y las mediciones de células múltiples se pueden separar fácilmente. Si el transgén fluoróforo no se integra en el genoma, la variación significativa en la expresión puede ocurrir de animal a animal. En este caso, la preselección de los animales con los niveles de expresión más altos, utilizando un microscopio de disección fluorescente aumenta la relación señal a ruido y mejora las mediciones. Los niveles de expresión fluoróforo need que es suficiente para ser fácilmente imágenes con la cámara bajo los parámetros de adquisición requeridas por el experimento. </li><li> Hacer las almohadillas de agarosa requeridos para la técnica de inmovilización deseado (ver más abajo 2,3) pulsando una pequeña gota de agarosa fundida entre dos placas de vidrio separadas por dos piezas de cinta de laboratorio. Si es necesario, almohadillas de agarosa puede ser transferida a una hoja de cubierta de vidrio antes de montar los animales. Véase la Figura 2. </li><li> Inmovilizar C. elegans para formación de imágenes utilizando una de las técnicas siguientes: <ol class="ualpha"><li> Paralización Farmacológica: Agregar un 0,05% a 2% Levamisol pastillas de agarosa (mezclándolo con la agarosa fundida antes de tomar las pastillas en 2,2). Elige animales 5-10 en la almohadilla y se cubre con un cubreobjetos. Aplique pequeñas cantidades de mezcla de cera caliente (50% de cera de parafina y 50% de vaselina) a las esquinas de la hoja de la cubierta para mantenerla en su posición. Permitir 5-10 minutos para el levamisol a surtir efecto y los animales a become completamente inmóvil. </li><li> Stiff Inmovilización Agarosa: C. elegans puede ser físicamente inmovilizada usando rígidos 10% almohadillas de agarosa y 0,05 m de diámetro nanopartículas de poliestireno. Hacer 10% de agarosa almohadillas (10% de agarosa en tampón de NGM en peso) como en 2,2. Añadir ~ 3 l de solución de bolas (1:10 microesferas de poliestireno en NGM en volumen) a la parte superior de la almohadilla. Rápidamente, recoger 5-10 C. elegans en la piscina de solución de bolas en el teclado y suavemente cubrir con un cubreobjetos. Use cera fundida se aplica a las esquinas de la hoja de la cubierta para mantenerla en su posición. (Para más detalles sobre esta técnica véase 7, así como un artículo anterior JoVE 8) </li><li> Encolado: C. elegans puede ser pegado en su lugar usando pequeñas cantidades de adhesivo de grado veterinaria aplicada a un lado del animal. </li><li> Los dispositivos microfluídicos: Numerosos dispositivos microfluídicos se han diseñado para sostener físicamente C. elegans en lugar de imágenes. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Colocar el portaobjetos preparado en el microscopio y se centran en la neurona deseado. Es a menudo más fácil para encontrar el C. elegans utilizando iluminación de campo claro con pocos aumentos. Luego de cambiar a gran aumento y de imágenes de fluorescencia para encontrar y centrarse en la neurona específica. </li><li> Estímulo: Si una respuesta neuronal a un estímulo específico que se desee (campo de luz, eléctrica, señales gustativas y olfativas, temperatura, etc), el aparato de estímulo debe ser diseñada en la configuración de microscopio, de tal manera que se puede administrar a los animales en la preparación de la muestra mientras que las imágenes. </li><li> Adquirir imágenes con la cámara CCD microscopio. Los tiempos de exposición y el nivel de luz de excitación depende de la señal de línea de base y nivel de expresión del fluoróforo, con las señales más débiles que requieren largos tiempos de exposición con resolución de tiempo concordantemente menos. Nos suelen utilizar tiempos de exposición ~ 300 ms. </li><li> Adquisición de imágenes de forma individual o como una TIme de intervalo. Debido a que C. elegans neuronas muestran generalmente lenta dinámica de activación (es decir, que carecen de los potenciales de acción basados ​​en sodio), velocidades de cuadro relativamente lentas de ~ 1 seg suelen ser suficientes para medir la dinámica de las neuronas. Velocidades de adquisición de hasta ~ 90 cuadros por segundo se han utilizado aunque éstos pueden estar limitados por el tiempo de integración necesaria para la fluorescencia débil. Los vídeos individuales de una sola neurona puede extender durante varios minutos (min ~ 5-10) o más si la inmovilización preparación es estable y la velocidad de cuadros relativamente lento. </li></ol> 3. Análisis de Datos <ol><li> Hay un número de diferentes paquetes de software de imágenes fluorescentes disponibles con capacidades de análisis dinámicos y radiométrica incluyendo ImageJ y NIS-elementos. Usamos un programa MATLAB personalizado simple que mide la media de la señal fluorescente sobre una región seleccionada de interés. </li><li> Para las imágenes individuales (o time-lapse películas que permanecenperfectamente inmóvil) seleccionar una región de interés (ROI) dentro de la neurona formado la imagen y una región separada cercano para la medición del fondo. Para imágenes ratiometric seleccionar ROI similar y las regiones de fondo para cada una de las dobles imágenes. </li><li> Un ligero movimiento de la neurona imagen formada dentro de una película de lapso de tiempo requiere un análisis adicional para seleccionar automáticamente la ROI en cada trama, lo que se puede lograr utilizando numerosos sistemas de seguimiento de objetos. Nuestro programa muestra una imagen comprimida de todas las imágenes de la película de la que está manualmente un límite aproximado (que abarca el objeto de los intereses de todos los marcos) seleccionado y selecciona una región de fondo independiente. Para la primera trama, una ROI se selecciona manualmente desde dentro de la región límite. Para cada trama posterior, el programa selecciona los píxeles más brillantes dentro de la región límite de generar un retorno de la inversión del tamaño correcto (es decir, el mismo número de píxeles como la ROI primer fotograma manual). Para las imágenes donde el objetivot de intereses es suficientemente brillante que el fondo circundante dentro de la región límite de este protocolo selecciona una ROI razonable para cada trama. </li><li> La señal fluorescente, F, para cada trama se calcula como la media de intensidad de los píxeles en la ROI menos la intensidad media en la región del fondo. Valores ratiométrica se calcula como la relación de las dos señales (YFP-YFP fondo) / (CFP-PPC fondo) -0,65. El factor de 0,65 compensa sangrado a través del canal de PPC en el canal de YFP, que será dependiente de los fluoróforos, así como el conjunto de filtro particular utilizado (este valor es normalmente ~ 0,6 para las configuraciones de cameleon). </li><li> El nivel de calcio relativa para cada trama se calcula como el porcentaje de cambio en intensidad normalizada a un valor de referencia inicial medido desde el primer fotograma (o una serie de fotogramas): Df / F = (F (t)-F o) / F o, donde F (t) es la fluorescencia en el tiempo t y o Fes el valor de referencia inicial. </li><li> Un ROI seleccionar el cuerpo de la célula genera las señales más fuertes más robustos, pero también es posible seleccionar y medir las señales de un retorno de la inversión a lo largo de los procesos nerviosos. </li></ol> 4. Resolución de Problemas <ol><li> Blanqueo: La exposición a la luz de excitación puede causar la decoloración del fluoróforo y se caracteriza por una disminución constante de la señal que es dependiente de los niveles de exposición. Mediciones ratiométrica ayudar a compensar esto. Sin embargo blanqueo selectivo de una longitud de onda pueden ocurrir (por lo general más rápido blanqueadores PPC YFP entonces). Si se produce decoloración reducir el nivel de exposición a la luz mediante la reducción de los tiempos de exposición y / o la intensidad de excitación (con filtros de densidad neutra en la vía de iluminación). Si es necesario, se puede compensar para el blanqueo mediante la ejecución de ensayos simulados (con la exposición de excitación mismo pero sin estímulo neuronal) y la cuantificación de la constante de tiempo de caída de la señal. </li><li><strong&gt; Inmovilización: Para el análisis de imágenes simple descrito aquí es fundamental el animal permanece relativamente quieto durante toda la filmación C.. elegans responder a la exposición a la luz y estímulos experimentales, haciéndolos más probable que se mueva en el momento de la grabación. Un ligero movimiento puede introducir ruido significativo en la medición, especialmente cuando se mide a partir de los procesos axonales. Análisis radiométrico ayuda a mitigar estos efectos hasta cierto punto y las mediciones desde el cuerpo celular son más robustos. Ejecución cuidadosa y perfeccionamiento de los procedimientos de inmovilización dará lugar completamente inmóvil animales. </li><li> Selección del fondo: selección cuidadosa de una región de fondo es necesaria para el análisis de imagen de éxito. Regiones fondo debe ser razonablemente uniforme y más oscuro que la neurona de imágenes. Debe estar lo suficientemente retirado para evitar la luz dispersada (y por lo tanto una señal de recogida) desde la neurona de imágenes. Nos encontramos con una región uniforme 20-50 m desde el retorno de la inversión funciona bien en la mayoría de los casos. </li><li> Óptica Proporcional: La correcta alineación de la óptica de imagen es esencial para generar una imagen dual clara. Archivos adjuntos Comerciales microscopio para obtener imágenes radiométrica están disponibles. Una técnica alternativa es emplear rápida de imagen secuencial usando una rueda de filtro rápido para cambiar rápidamente entre longitudes de onda de emisión durante la grabación de imágenes independientes para cada uno. </li><li> Análisis radiométrico: El análisis descrito aquí es una técnica relativamente simple que genera señales de sólidos en virtud de un promedio de más de un ROI. Se requiere un objeto reconocible brillante para seleccionar el ROI. Más análisis radiométrico sofisticado es posible por alineando con precisión y la cartografía de las dobles imágenes tales que la relación fluorescente se puede calcular píxel por píxel. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Genéticamente codificados indicadores de calcio se han utilizado ampliamente en C. elegans neurobiología. Numerosos grupos han empleado estas técnicas para estudiar la respuesta de las neuronas sensoriales primarias a estímulos externos como se demuestra aquí con la respuesta ASJ a un campo eléctrico. Ejemplos destacados incluyen sensación del tacto mecánico, productos químicos específicos, la temperatura y un campo eléctrico 12, 16-19. Actividad de interneuronas y células musculares tamb...

Aquí presentamos métodos prácticos para la formación de imágenes in vivo del calcio en C. Elegans neuronas. El desarrollo de las codificadas genéticamente sensibles calcio-fluoróforos con alta relación de señal a ruido hace C. elegans un sistema efectivo comparativamente sencillo y rentable para la medición de la neurofisiología y la actividad. Nuestra formación de imágenes se realiza con un microscopio compuesto estándar utilizando amplio campo de imágenes de fluorescencia de los fluoróforos disponibles comúnmente. Se presentan varias técnicas que emplean diferentes fluoróforos y preparaciones diferentes de la muestra, discutir las fortalezas y debilidades de cada uno. Los datos se presentan a continuación, a partir de dos experimentos de ejemplo. Un excelente recurso adicional sobre las técnicas descritas aquí se pueden encontrar en WormBook, &quot;Imagen de la actividad de las neuronas y los músculos&quot; por R. Kerr, ( <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. Dos clases principales de genéticamentecamente codificados reporteros fluorescentes de calcio se utilizan comúnmente en C. elegans: GCaMP solo canal y cameleon FRET basada. Vamos a describir los métodos y ejemplos para mostrar los datos generados por cada uno. GCaMP se basa en una modificación de la proteína verde fluorescente (GFP) que es sensible a la concentración de calcio circundante. Esto se logra mediante la fusión de GFP y la calmodulina calcio de alta afinidad de proteína, de tal manera que la unión del calcio por la calmodulina lleva la molécula de GFP en una confirmación eficiente fluorescente 2. Los recientes avances en estos fluoróforos generar tamaño de la señal excepcional con hasta 500% de aumento en la intensidad de fluorescencia en un rango fisiológico de los niveles de calcio y la cinética razonablemente rápidos de ~ 95 ms tiempo de subida y el tiempo de decaimiento ~ 650 mseg 4. Durante períodos de tiempo relativamente cortos (minutos), estas señales pueden permitir grandes para obtener imágenes de resolución más baja (menor magnificación) y, dado un buen comportamiento initmedida de referencia ial, niega la necesidad de línea de base continua o mediciones comparativas. Cameleon tiene la ventaja de ser un fluoróforo FRET basada en el que genera una medición radiométrica comparando dos canales independientes o longitudes de onda 1. Se compone de dos fluoróforos diferentes (proteínas fluorescentes cian y amarillo, emisores de PPC y YFP) unidos por una proteína calmodulina. El complejo está iluminado con luz azul (440 nm) que excita la PPC. La unión de calcio trae los fluoróforos más juntos, aumentando la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) de la PPC (donante) a la YFP (aceptor) y provocando la emisión PPC (480 nm) para disminuir la emisión y YFP (535 nm) para aumentar . Los niveles relativos de calcio se mide como la relación de la intensidad YFP / CFP. Cinética Cameleon son más lentas que la de GCaMP, medido in vivo para tener un tiempo de subida de ~ 1 sec y un tiempo de desintegración de 3 ~ 5 seg. Sin embargo,la relación de las señales que se mueven opuestamente aumenta el tamaño de la señal y compensa un número de posibles artefactos debido a los cambios en la concentración de fluoróforo, el movimiento o la deriva enfoque y blanqueo. Codificados genéticamente reporteros fluorescentes negar gran parte de la preparación de la muestra requiere exógenamente con sondas administrados y C. elegans pequeño cuerpo transparente permite visualizar imágenes en el animal intacto utilizando fluorescencia sencilla de campo amplio. El principal reto técnico en preparación de la muestra es por lo tanto, para inmovilizar de forma segura a los animales. Hay un número de diferentes técnicas comúnmente utilizadas cada uno con ventajas y desventajas. El uso de un agente farmacológico para paralizar a los animales es fácil de implementar y permite el montaje de múltiples animales en una preparación (Levamisol, un agonista colinérgico que hace que el tejido muscular para aprovechar se utiliza típicamente 6). C. elegans también puede ser físicamente inmovilizada mediante el montaje de losen 10% de agarosa rígido 7, 8. Esto minimiza el impacto en la fisiología del animal, permite a largo plazo de imágenes (horas) y la recuperación de varios animales, pero es más difícil técnicamente. Ambas técnicas restringir el acceso físico a los animales (que están bajo un cubreobjetos) y, por tanto, sólo pueden utilizarse con ciertos estímulos experimentales (tal como luz, temperatura, campo eléctrico o daño láser). Para los estímulos que se requiere acceso físico, como el tacto o la administración de los productos químicos, muchos estudios han pegado con éxito C. elegans en su lugar (el uso de pegamento de grado veterinario) 9. Esto es técnicamente más difícil, es una preparación solo animal y no permite la recuperación de los animales. Por último, numerosos dispositivos de microfluidos han sido empleados que físicamente restringir C. elegans, preservando la fisiología animal, permitiendo la exposición a la mayoría de los tipos de estímulos (dependiendo del diseño del dispositivo) y puede permitir el intercambio rápido y la recuperación de los animales <sup&gt; 10, 11. Sin embargo microfluidos adicionales requieren habilidades técnicas y capacidades en diseño, fabricación e implementación. En actividad inmovilizado animales y estímulo respuesta generalmente se puede medir en sensorial y interneuronas. Actividad de las neuronas motoras requiere de técnicas más sofisticadas para la formación de imágenes en movimiento en los animales. Aquí vamos a presentar métodos detallados que emplean las dos técnicas más sencillas de paralización e inmovilización farmacológica con rigidez de agarosa. Los métodos presentados aquí pueden ser utilizados para medir la actividad neuronal y la fisiología celular en C. elegans. Damos un ejemplo de cada uno de: el uso de GCaMP para medir la respuesta de la neurona sensorial ASJ a un campo eléctrico externo, y utilizando cameleon para medir la respuesta de calcio fisiológica a la lesión con láser de una neurona. Estos ejemplos muestran las ventajas y los inconvenientes de los dos tipos de fluoróforos e ilustran lo que es posible con el sistema.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eclipse Ti-U inverted 
 microscope</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intensilight HG Illuminator</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>C-HGFI</td>
 <td>Fluorescent light source</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical table or 3'X3' optical 
 grade breadboard</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>If an optical table is not used an 
 optical grade breadboard on a 
 solid laboratory bench should 
 suffice.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clara Interline Camera</td>
 <td>Andor 
 Technology</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>High-sensitivity CCD camera</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>wtGFP Longpass Emission</td>
 <td>Chroma Technology 
 Corp.</td>
 <td>41015</td>
 <td>GFP filter set for imaging GCaMP</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 440 +/- 10 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D440/20x EX</td>
 <td>excitation filter for cameleon</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 455 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>455DCLP BS</td>
 <td>microscope dichroic for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 515 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>515DCLP BS</td>
 <td>dichroic mirror for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 535 +/- 15 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D535/30m EM</td>
 <td>YFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 480 +/- 20 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D485/40m EM</td>
 <td>CFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lens, 200 mm, Achromat</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>AC508-200-A1</td>
 <td>Relay lens for FRET optics (3)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver broadband mirror</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>ME2S-P01</td>
 <td>FRET optics (2)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NGM buffer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Levamisole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polybead Microspheres</td>
 <td>Polysciences, Inc.</td>
 <td>08691-10, 2.5% by 
 volume, 50 nm 
 diameter</td>
 <td>polystyrene nanoparticles for C. 
 elegans immobilization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, Strain 
 gpa-9::GCaMP3(in pha-1; 
 him-5 bkg) </td>
 <td>Sternberg Lab</td>
 <td>Strain PS6388</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, mec- 
 4::YC3.60</td>
 <td>Gabel Lab</td>
 <td>Strain CG1B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in vivo neuronal calcium imaging in c. elegans

El gusano nematodo C. elegans es un organismo modelo ideal para relativamente simple, formación de imágenes de bajo coste neuronal in vivo. Su pequeño cuerpo transparente y simple, bien caracterizado sistema nervioso permite la identificación y obtención de imágenes de fluorescencia de cualquier neurona en el animal intacto. Técnicas sencillas de inmovilización con un impacto mínimo sobre la fisiología del animal permitir extendido time-lapse de imágenes. El desarrollo de los fluoróforos de calcio genéticamente codificados sensibles como cameleon 1 y 2 GCaMP permitir la formación de imágenes in vivo de calcio neuronal relacionada tanto fisiología celular y la actividad neuronal. Numerosas cepas transgénicas que expresan estos fluoróforos en neuronas específicas están fácilmente disponibles o se pueden construir utilizando técnicas bien establecidas. A continuación, se describen los procedimientos detallados para medir la dinámica del calcio dentro de una sola neurona in vivo utilizando tanto GCaMP y cameleon. Se discuten las ventajas y disadvantedades de ambos, así como varios métodos de preparación de la muestra (inmovilización animal) y análisis de imagen. Finalmente, se presentan los resultados de dos experimentos: 1) Usando GCaMP para medir la respuesta sensorial de una neurona específica a un campo eléctrico externo y 2) Utilizando cameleon para medir la respuesta de calcio fisiológico de una neurona a daño traumático láser. Técnicas de formación de imágenes de calcio tales como éstos se utilizan ampliamente en C. elegans y se han extendido a las mediciones en los animales que se desplazan libremente, neuronas de forma simultánea y la comparación entre fondos genéticos. C. elegans presenta un sistema robusto y flexible para imágenes in vivo neuronal con ventajas sobre otros sistemas modelo de sencillez técnica y coste.

Aquí se presentan los resultados de dos experimentos separados. El primero emplea GCaMP para medir la respuesta de una neurona sensorial específico a un estímulo externo definido, dando un buen ejemplo de cómo los reporteros fluorescentes de calcio se puede utilizar para controlar ópticamente la actividad neuronal en intacto C. elegans. El segundo emplea cameleon para medir el calcio intracelular transitoria activa dentro de una neurona en respuesta al daño del láser específico, lo que ilustra cómo la ...

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Con su pequeño cuerpo transparente y bien documentado neuroanatomía y una serie de técnicas genéticas susceptibles y reactivos,<em&gt; C. elegans</em&gt; Hace que un organismo modelo ideal para<em&gt; In vivo</em&gt; Imagen neuronal utilizando relativamente simples y de bajo costo técnicas. Aquí se describe imagen única neurona dentro de animales adultos intactos utilizando genéticamente codificados indicadores de calcio fluorescente.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

in-vivo-neuronal-calcium-imaging-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

24.8K vistas.  Boston University School of Medicine. Con su pequeño cuerpo transparente y bien documentado neuroanatomía y una serie de técnicas genéticas susceptibles y reactivos, C. elegans Hace que un organismo modelo ideal para In vivo Imagen neuronal utilizando relativamente simples y de bajo costo técnicas. Aquí se describe imagen única neurona dentro de animales adultos intactos utilizando genéticamente codificados indicadores de calcio fluorescente.

Video: In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Investigación

Bioquímica

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

Imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre con vibración no localizada y bien controlada

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Comportamiento

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

En vivo de imágenes de Dauer-específica neuronal Remodelación en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Neurociencias

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Biología del Desarrollo

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Biología

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

Imágenes de espinas dendríticas en Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Calcium Imaging: A Method to Visualize Neural Activity in Live C. elegans

Source: Turek, M. et al. <a href="https://www.jove.com/video/52742/agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis">Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video introduces the concepts behind calcium imaging and includes an example protocol for time-lapse imaging of worms contained in molded agarose wells.

Imágenes de calcio: un método para visualizar la actividad neuronal en C. elegans vivos

Source: Turek, M. et al. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video ...

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

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