Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Agence Nationale pour la Recherche, programa PIRIbio Dynabiofilm y del CNRS programa Riesgo Interdisciplinario. Damos las gracias a Philippe Thomen por su lectura crítica del manuscrito y Christophe Beloin para la prestación del E. coli cepa utilizada en este trabajo.

1. Cultura de las bacterias y Suspensión Preparación <ol><li> Elige una colonia recién crecido de una placa de agar Lisogenia caldo (LB), inocular en 5 ml de medio LB líquido que contiene 100 μ g / ml ampicilina y 7,5 μ g / ml de tetraciclina y se incuba durante 5-6 horas a 37 ° C en una plataforma de agitación. </li><li> A continuación, añadir 100 μ l de cultivo bacteriano en 5 ml de medio mínimo (M63B1) suplementado con 0,4% de glucosa y las mismas concentraciones de antibióticos. Incubar este cultivo durante la noche recién diluido a 37 ° C en una plataforma de agitación. </li><li> Después de 16 horas de incubación, se añaden 100 l de la cultura de la noche a 5 ml M63B1, 0,4% de glucosa. Mantenga el tubo a 37 ° C para la plataforma de agitación hasta un 0,5 OD se alcanza. La suspensión es entonces listo para la inyección en el canal experimento para la formación de biopelículas. </li></ol> 2. Preparación de Partículas Magnéticas <ol><li> Tomar 10 partículas magnéticas mu l -2,8 μ m de diámetro - de las existencias y lavarlos 3 veces en medio mínimo de 190 l con la ayuda de un soporte de muestras magnético. </li><li> Ajustar la concentración de partículas de 5 x 10 6 cuentas / ml. Típicamente 50 l de la solución de bolas lavado se mezclan con un más 950 μ l de M63B1 con 0,4% de glucosa. </li></ol> 3. Preparación Channel y Crecimiento Biofilm <ol><li> Canal de montaje <ol><li> Corte dos cuadrados (800 μ m de lado) capilares de vidrio borosilicato de 10 cm de largo para obtener piezas de dos 8 cm de largo. </li><li> Pegue las dos piezas capilares sobre dos láminas de vidrio - reducir a la mitad primera - 2 cm de distancia con 1 cm de saliente en cada extremo como en la figura 1, utilizando un pegamento de cianoacrilato de acción rápida (los llamados super-pegamento). </li><li> Autoclave toda la configuración y la tubería necesaria requerida para su posterior conexión de canal. </li><li> Reúna todos los materiales estériles bajouna campana de flujo laminar: i) el canal montado y la trampa 1, ii) los tubos y conectores, iii) las dos trampas de burbujas - el filtro de burbujas utilizados comúnmente para fijar goteo de lactar (trampa de los niños 1) y la trampa de burbujas casero como 4 cm de largo tubo de mayor diámetro (trampa 2), iv) las abrazaderas, v) 30 ml jeringas llenas de M63B1, 0,4% de glucosa, y vi) la botella de residuos. </li><li> Conecte toda la instalación con conectores Luer Lock o cruces en el siguiente orden: 50 ml M63B1 jeringa controlada por la bomba de jeringa, filtro burbuja pediátrica, trampa de burbujas casero, capilar (Figura 1, panel B), y el tubo a la botella de residuos. A continuación, llenar la instalación con M63B1 estéril, 0,4% de glucosa, encender la bomba de jeringa a una velocidad de aproximadamente 10 ml / h, por encima de las tasas de experimentación. Rastrear con cuidado y eliminar todas las burbujas en el circuito. </li><li> El flujo del medio a través del sistema durante 10-15 minutos; al mismo tiempo la mezcla 1 ml de la suspensión de bacterias a una DO de 0,5 a partir de la sección1.3 con 1 ml de la solución de bolas se lavó preparado en la Sección 2.2. </li><li> Adjuntar (pero no cierre) abrazaderas para el tubo en dos posiciones: antes y después de los capilares. Cambie el flujo fuera. </li><li> Introducir la mezcla bacteriana en perlas en el capilar después de la casa hecha la trampa de burbujas con una jeringa de 1 ml, teniendo cuidado de sostener los extremos del tubo para evitar la entrada de aire. Vuelva a conectar el tubo y cierre las abrazaderas. </li><li> Repita el mismo procedimiento para el segundo capilar y se les presentarán todas las cámaras de aire para las burbujas. </li><li> Transferir el aparato al microscopio y déjelo reposar durante 15-20 minutos para permitir que las bacterias para asentarse y unirse a la superficie de los capilares. Instalar el capilar en la platina del microscopio con el contenedor de residuos a un nivel ligeramente superior. Coloque la bomba de jeringa en el mostrador junto al microscopio. Elevar la trampa de burbujas antes de que el capilar ligeramente más alto que el plano capilar para capturar burbujas. </li></ol></li><li> Biofilm Growth <ol><li> Ajustar la velocidad de flujo en la bomba de jeringa e iniciar el flujo, la biopelícula ahora desarrollar en la superficie capilar durante el período requerido - generalmente 24 o 48 horas en estos experimentos. </li><li> Centrarse en el plano inferior capilar e iniciar la grabación de lapso de tiempo de las imágenes de la muestra - por lo general una frecuencia de adquisición de 2 images / min informará adecuadamente el crecimiento de biopelículas. Esta monitores de vídeo biofilm crecimiento post-control (ver extractos en Videos 1, 2 y 3). </li></ol></li></ol> 4. Pinzas Magnéticas de instalación <ol><li> Atornillar las pinzas magnéticas en micromanipuladores XYZ controlados manualmente y atornillar los micromanipuladores en la platina del microscopio para ajustar la posición de las pinzas relativamente al capilar. Colocar las pinzas como en la Figura 2 para asegurar el gradiente de campo magnético apropiada se genera en la zona de observación. </li><li> Conecte las pinzas to el generador de funciones a través de la etapa de potencia para generar un período de 40 segundos de tiempo hecha de 24 segundos de la señal cero y 16 segundos de 4 A de corriente continua con un gatillo enviado al campo claro obturador luz después de 20 segundos para la sincronización de la señal que proporciona una secuencia de eventos como en la Figura 3. Nota: Estas dos operaciones se pueden conseguir en cualquier momento entre la instalación y la medición capilar principio. Ver experimentar boceto resumen en la figura 4. </li></ol> 5. Arrastramiento Curve Adquisición <ol><li> Utilice el control de movimiento XY de la platina del microscopio para traer el borde del polo magnético de la izquierda y el borde izquierdo del capilar en el mismo campo de observación. Tome el origen del referencial análisis en la intersección de x e y ejes definidos por el borde del capilar y el borde de la pieza polar, respectivamente (véase la Figura 2). </li><li> Ajuste la posición vertical del capilar mediante enfoque fino cperilla ontrol de la posición microscopio. Típicamente, la primera examinado plano se encuentra entre 4 a 7 μ m por encima de la parte inferior capilar. Vídeo 1 corresponde al campo XY que tiene su esquina superior izquierda en el origen de la referencia espacial. </li><li> Activar la secuencia de 40 segundos de eventos descritos en la sección 4.2 y en la Figura 3 por el cambio en el generador de corriente y, al mismo tiempo, accionar manualmente la secuencia de adquisición de la imagen de vídeo 1. </li><li> Mueva el capilar para el campo derecho vecino por un 250 μ m traducción de la platina del microscopio, a la izquierda y operar como en la sección 5.3 para generar vídeo 2 de la rebanada de 2 y así sucesivamente para obtener los videos requeridos. Típicamente 3 a 4 campos de 250 x 250 μ m 2 se recogen a lo largo del eje x antes de cambiar el plano y repitiendo las mismas operaciones para el nuevo plano. </li></ol> 6. Calibración Fuerza <ol><li> Preparar una solución de glicerol mezclando 39,8 g de glicerol con 190 μ l de agua bidestilada y 10 l de partículas magnéticas en un 2 x 10 9 partículas / ml y llenar un canal experimental con esta mezcla y colocarlo en la platina del microscopio como se describe para la muestra de biopelículas. </li><li> Después de instalar las pinzas magnéticas, como se indica en la sección 4, aplicar la fuerza magnética, como se indica en el punto 5.4 y hacer que las imágenes de lapso de tiempo para extraer cada velocidad de una partícula (v) y su posición en el capilar para obtener el archivo de calibración. Este archivo debe contener la fuerza aplicada en función de su posición en la zona de análisis del capilar de acuerdo con la ley de Stokes, F = 6πRηv (R: radio de la partícula). </li></ol> 7. Análisis <ol><li> Utilice un software de &quot;partícula rastreador&quot; para obtener los archivos de texto con las posiciones de las partículas en cada marco para todas las pilas de imágenes adquiridas, como se indica en la sección 5. Usíng la imagen frecuencia de adquisición pila, calcular el desplazamiento de las partículas como una función de tiempo (por ejemplo, Figura 5 y de vídeo 4). </li><li> Usando el archivo de calibración de fuerza, convertir las curvas de desplazamiento a curvas de cumplimiento (cumplimiento total del material - j (t) - como una función del tiempo) de acuerdo con la fórmula cumplimiento: <img alt="" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq1.jpg" width="106" /> que da la relación entre la deformación del material y la tensión aplicada para una partícula sonda de radio R incrustado en un medio viscoelástico incompresible, homogéneo según lo establecido previamente por Schnurr y compañeros de trabajo 19. </li><li> Ajustar las curvas de deformación por fluencia para el modelo general Burgers para materiales viscoelásticos y derivar los parámetros viscoelásticos, J 0, J 1, η 0, η 1 para cada partícula ( <strong&gt; Figura 6), según la fórmula de Burgers: <img alt="" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq2.jpg" width="169" /> Nota: Este análisis fenomenológico se ha empleado previamente para una amplia gama de materiales, incluyendo materiales biológicos tales como las biopelículas para interpretar los datos de reología macroscópicas 20-22. </li></ol>

<ol>
	<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Battling+biofilms.">Battling biofilms.</a> Scientific American. 285, 74-81 (2001).</li><li>Branda, S. 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B., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+a+mixed+culture+biofilm+from+rheometer+creep+analysis.">Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis.</a> Biofouling. 19, 279-285 (2003).</li><li>Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+bacterial+biofilm+adhesion+and+viscoelasticity+by+microbead+force+spectroscopy.">Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).</li><li>Poppele, E. H., Hozalski, R. 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W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+fluid-biofilm+interaction+using+a+Burger+material+law.">A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).</li><li>Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+antimicrobial+treatments+change+the+viscoelastic+properties+of+bacterial+biofilms.">Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms.</a> Biofouling. 27, 207-215 (2011).</li><li>Apgar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-particle+tracking+measurements+of+heterogeneities+in+solutions+of+actin+filaments+and+actin+bundles.">Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles.</a> Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Esta partícula magnética de la siembra y tirando experimento habilitado en la cartografía 3D in situ de los parámetros viscoelásticos de un biofilm creciente en su estado original. Este enfoque reveló la heterogeneidad mecánica de la E. coli biofilm crecido aquí y dio pistas para señalar los componentes de biopelículas que soportan las propiedades físicas del biofilm, lo que sugiere fuertemente una implicación fundamental de la matriz extracelular y con mayor precisión su grado de...

Los biofilms bacterianos son comunidades de bacterias asociadas a superficies biológicas o artificiales 1-3. Se forman por un mecanismo de adhesión-crecimiento, junto con la producción de matriz extracelular rica en polisacáridos que protege y estabiliza el edificio 4,5. Estos biofilms no son simplemente conjuntos pasivos de células pegadas a las superficies, pero los sistemas biológicos complejos dinámicos organizados y. Cuando las bacterias cambian de estilo de vida planctónica biofilm, no se observan cambios en la expresión genética y la fisiología celular, así como una mayor resistencia a los antimicrobianos y el anfitrión defensas inmunológicas son en el origen de muchas infecciones persistentes y crónicas 6. Sin embargo, el desarrollo controlado de estas estructuras que viven también ofrecen oportunidades para aplicaciones industriales y ambientales, como la biorremediación de sitios de desechos peligrosos, bio-filtración de agua industrial o la formación de bio-barreras para proteger el suelo y el agua subterránea de contamiación. Aunque cada vez se describen las características moleculares específicas para modo biofilm de la vida, los mecanismos que impulsan el desarrollo de la comunidad y persistencia siguen siendo poco claras. Uso de los recientes avances en las mediciones a microescala usando electroquímica de barrido o microscopía de fluorescencia, estas organizaciones vivos han sido demostrado que presentan una considerable estructural, química y la heterogeneidad biológica 7. Sin embargo, hasta ahora, la mecánica de biopelícula se han examinado principalmente macroscópicamente. Por ejemplo, la observación de serpentinas biofilm deformación debida a las variaciones en las tasas de flujo de fluido 8,9, compresión uniaxial de piezas de biopelícula elevación de medio de agar o cultiva en cubierta se desliza 10,11, cizallamiento de biopelícula obtenida de el medio ambiente y después se transfirió a un paralelo reómetro de placas 12,13, la espectroscopia de fuerza atómica utilizando una cuenta de vidrio y recubierto con una biopelícula bacteriana unida a un cantilever de AFM 14 o un micr dedicadoocantilever método para la medición de la resistencia a la tracción de los fragmentos de biofilm separados 15,16 se han aplicado durante los diez últimos años, el suministro de información útil sobre la naturaleza viscoelástica del material 17. Sin embargo, parece probable que la información sobre las propiedades mecánicas de biopelícula in situ se pierde cuando se retira el material de su entorno nativo, que era a menudo el caso en estos enfoques. Por otra parte, el tratamiento de la biopelícula como un material homogéneo no encuentra información sobre la posible distribución de las propiedades físicas de la comunidad. Por lo tanto, las implicaciones exactas de la mecánica de la estructura en la formación de biopelículas y rasgos biológicos tales como los patrones de expresión de genes o gradientes químicos casi no se pueden reconocer. Para avanzar hacia una descripción microscópica de las propiedades físicas del biofilm, se requieren nuevas herramientas dedicadas. Este documento detalla un enfoque original concebido para lograrmedición de los parámetros mecánicos locales in situ, sin alterar la biopelícula y permitiendo dibujo de la distribución espacial de las propiedades del material a microescala y luego la heterogeneidad mecánica. El principio del experimento se basa en el dopaje de un biofilm creciente con micropartículas magnéticas seguido de su carga remota utilizando pinzas magnéticas en la biopelícula madura. El desplazamiento de partículas bajo la aplicación de fuerza magnética controlada fotografiado bajo el microscopio permite la derivación de parámetros viscoelástico local, cada partícula que informa sobre su propio entorno local. A partir de estos datos, el perfil mecánico 3D de la biopelícula se puede extraer, revelando condición dependencias espaciales y ambientales. Todo el experimento se muestra aquí en una E. biofilm coli hecha por una cepa genéticamente modificada que lleva un plásmido F-como desreprimida. Los resultados se detallan en un trabajo reciente 18 proporcionan una visión única del interior de la mecánica de biopelículas intactas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 1: Reagents and cells</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="20" rowspan="2" style="height:22px;width:216px;">Magnetic particles</td>
			<td rowspan="2" style="width:323px;">Life technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:224px;">14307D</td>
			<td colspan="2" rowspan="2" style="width:496px;">Micrometric magnetic particle, 2.8 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr height="2">
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Ampicillin (Antibiotic)</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">A9518</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetracycline (Antibiotic)</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">87128</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacterial strain MG1655gfpF</td>
			<td style="width:323px;">UGB, Institut Pasteur, France</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 2:&#160; Capillaries and tubing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Filters for pediatric perfusion</td>
			<td style="width:323px;">Prodimed-Plastimed</td>
			<td style="width:224px;">6932002</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hollow Square Capillaries</td>
			<td style="width:323px;">Composite Metal Scientific</td>
			<td style="width:224px;">8280-100</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing silicone peroxyde</td>
			<td style="width:323px;">VWR international</td>
			<td style="width:224px;">228-0512</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Diameter 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing silicone peroxyde</td>
			<td style="width:323px;">VWR international</td>
			<td style="width:224px;">228-0700</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Diameter 3mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Table 3: Biofilm growth</td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td style="width:495px;"></td>
			<td style="width:1px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysogeny Broth (LB) solution</td>
			<td style="width:323px;">Amresco-VWR</td>
			<td style="width:224px;">J106-10PK</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">standard medium used to grow bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M63B1 solution</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Standard minimum&#160; medium used to grow bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">G8270</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 4: Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera EMCCD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:224px;">C9100-02</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Heater controller</td>
			<td style="width:323px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:224px;">300354</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Function generator</td>
			<td style="width:323px;">Agilent technologies</td>
			<td style="width:224px;">33210A</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power amplifier</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe pumps</td>
			<td style="width:323px;">Kd Scientific</td>
			<td style="width:224px;">KDS-220</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shutter</td>
			<td style="width:323px;">Vincent Associates</td>
			<td style="width:224px;">Uniblitz T132</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:216px;">Magnetic tweezers</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 5: Optics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:224px;">TE-300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20&#160; 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55</td>
			<td style="width:323px;">Chroma</td>
			<td style="width:224px;">1)#49020 2)#31002</td>
			<td>Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 6: Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:323px;">NIH - particle tracker plugin</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

remote magnetic actuation of micrometric probes for in situ 3d mapping of bacterial biofilm physical properties

La adhesión bacteriana y el crecimiento en las interfaces conducen a la formación de estructuras tridimensionales heterogéneos llamados biopelículas. Las células que habitan en estas estructuras se mantienen juntas por interacciones físicas mediadas por una red de sustancias poliméricas extracelulares. Los biofilms bacterianos impactan muchas actividades humanas y la comprensión de sus propiedades es fundamental para un mejor control de su desarrollo - el mantenimiento o la erradicación - en función de su resultado adverso o beneficioso. En este trabajo se describe una nueva metodología con el objetivo de medir in situ las propiedades físicas locales de la biopelícula que había sido, hasta ahora, el examen sólo desde una perspectiva de material macroscópico y homogénea. El experimento descrito aquí implica la introducción de partículas magnéticas en un biofilm creciente a las semillas sondas locales que pueden ser accionados de forma remota sin molestar a las propiedades estructurales de la biopelícula. Pinzas magnéticas fueron dedicados devellado para ejercer una fuerza definida sobre cada partícula incrustado en la biopelícula. La instalación se monta en el escenario de un microscopio para permitir la grabación de imágenes con lapso de tiempo del período de partículas de arrastre. Las trayectorias de las partículas se extraen entonces de la secuencia de tracción y los parámetros viscoelásticos locales se derivan de cada curva de desplazamiento de partículas, proporcionando de este modo la distribución-3D espacial de los parámetros. Obtener conocimientos sobre el perfil mecánico biofilm es esencial desde el punto de vista de un ingeniero para el control de la biopelícula, sino también desde una perspectiva fundamental para aclarar la relación entre las propiedades arquitectónicas y la biología específica de estas estructuras.

Un análisis típico proporcionará la distribución espacial de los parámetros viscoelásticos en la escala de micras en una biopelícula que viven sin molestar a su disposición original. Los resultados típicos se muestran en la Figura 7, donde los valores de J 0 - se dan como una función del eje z a lo largo de la profundidad y de la eje y a lo largo de una dimensión lateral de la biopelícula - el cumplimiento elástica. Cada punto corresponde a una perla que el análisis de la curva ...

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Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Este trabajo muestra una metodología original basada en el accionamiento a distancia de las partículas magnéticas sembradas en una biopelícula bacteriana y el desarrollo de las pinzas magnéticas específicas para medir in situ las propiedades mecánicas locales de la materia viva complejo construido por los microorganismos en las interfases.

El accionamiento a distancia magnética del micrométrica Sondas para<em&gt; In situ</em&gt; Mapping 3D bacterianas Biofilm Propiedades Físicas

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

9.1K vistas.  Sorbonne Universités, UPMC.  Este trabajo muestra una metodología original basada en el accionamiento a distancia de las partículas magnéticas sembradas en una biopelícula bacteriana y el desarrollo de las pinzas magnéticas específicas para medir in situ las propiedades mecánicas locales de la materia viva complejo construido por los microorganismos en las interfases. 

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Investigación

Bioingeniería

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

X-ray fluoroscopy-guided endovascular procedures have several significant limitations, including difficult catheter navigation and use of ionizing radiation, which can potentially be overcome using a magnetically steerable catheter under MR guidance.
	The main goal of this work is to develop a microcatheter whose tip can be remotely controlled using the magnetic field of the MR scanner. This protocol aims to describe the procedures for applying current to the microcoil-tipped microcatheter to produce consistent and controllable deflections.
	A microcoil was fabricated using laser lathe lithography onto a polyimide-tipped endovascular catheter. In vitro testing was performed in a waterbath and vessel phantom under the guidance of a 1.5-T MR system using steady-state free precession (SSFP) sequencing. Various amounts of current were applied to the coils of the microcatheter to produce measureable tip deflections and navigate in vascular phantoms.
	The development of this device provides a platform for future testing and opportunity to revolutionize the endovascular interventional MRI environment.

Current applied to an endovascular microcatheter with microcoil tip made by laser lathe lithography can achieve controllable deflections under magnetic resonance (MR) guidance, which may improve speed and efficacy of navigation of vasculature during various endovascular procedures.

Magnéticamente Asistencia Remota Controlada microcatéter desviación de la punta bajo la resonancia magnética

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

La fabricación de una funcionalizado magnética bacteriana NANOCELULOSA con nanopartículas de óxido de hierro

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

El rápido escaneo de electrones resonancia paramagnética abre nuevas vías para Imaging fisiológicamente parámetros importantes<em&gt; En Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Configuración optimizada y protocolo para la proyección de imagen de dominio magnético con In Situ la medición histéresis

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Mejora 3D hidrogel culturas de células Glial primarias para In Vitro modelado de neuroinflamación

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositivos eléctricos y de campo magnético para la estimulación de tejidos biológicos

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...