The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.

1. Preparación de Cristalería y Culturas <ol><li> Antes de continuar con este experimento, preparar agar sangre al 5% de oveja (SBA) placas para el cultivo de MRSA. Incubar las placas SBA durante 24 horas a 37 ° C. Después de este tiempo, las colonias individuales, bien aisladas deben estar presentes para ser utilizado para inoculaciones subsiguientes en medios líquidos. Tienda rayado placas SBA con colonias individuales a 4 ° C durante 1-2 meses. NOTA: placas de agar sangre de oveja vienen en paquetes pre-hechos que contienen entre 20 a 25 platos basados ​​en el fabricante, y típicamente consisten en una base de agar de soja tríptico con la adición de 5% w / v de sangre de oveja. </li><li> Hacer 500 ml de caldo de soja tríptico (TSB) suplementado con 1% de glucosa y 0,1% de NaCl. Después de esto, recoger y limpiar 2 tubos de ensayo de vidrio. Si tapas autoclavables no están disponibles para tubos de ensayo, utilice papel de aluminio como una tapa. Autoclave TSB y tubos de ensayo, junto con una caja de puntas de pipeta 1 ml. </li><li> En virtud de un gabinete de bioseguridad o cerca de un Bollosen la hornilla, una pipeta 5 ml de TSB previamente en autoclave en tubos de ensayo en autoclave. Tenga cuidado para asegurarse de que el tiempo suficiente se le ha dado para que la TSB y tubos de ensayo enfriar a temperatura ambiente. Desde un 5% placa SBA previamente rayada, inocular una sola colonia en 6 ml de caldo TSB. Una contendrá el SARM, y el segundo tubo de ensayo se utilizó como control negativo para asegurar la esterilidad. </li><li> Tome tubos de ensayo TSB inoculadas y colocarlos en una incubadora recíproca durante 24 horas a 37 ° C ya 200 rpm. Después de este tiempo el crecimiento microbiano debería ser evidente en el tubo de ensayo MRSA mientras que ningún crecimiento debería haber ocurrido en el tubo de ensayo control. </li><li> Tomar 1 ml de cultivo de 24 horas y la pipeta en 6 ml de TSB fresco. Incubar a 37 ° C durante 6 horas a 200 rpm. </li><li> Pipeta 1 ml de 6 hr subcultura en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar durante 3 min a 850 x g. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de H2O desionizada Centrífuga, repetir y volver a suspender. </li></ol><ol><li> Tome acero inoxidable y discos de la muestra de AFM de oro (20 mm y 10 mm de diámetro, respectivamente) y limpiar cada lado con 5 ml de H2O desionizada Mantenga discos de la muestra en la mano dominante con unas pinzas y usar la mano subdominante de pipeta de 5 ml en cada lado del disco de la muestra. Después de lavar ambos lados, discos lugar de la muestra en un vaso que contiene 20 ml de H2O desionizada seguido por ultrasonidos durante 1 minuto. </li><li> Después de su uso sonicación fórceps para extraer discos de la muestra del vaso de precipitados. Coloque los discos de forma que se inclinan en un ángulo de 60 ° contra el borde de una placa de Petri abierta sobre una toalla de papel. Utilice la tapa de la placa Petri para cubrir los discos de secado. Deje que los discos se secan totalmente antes de continuar. El tiempo de secado puede variar entre 4 - 8 hr. </li><li> Una vez seco, el uso de fórceps para colocar discos de la muestra en una placa de Petri. <ol><li> Opcionalmente, funcionalizar la superficie de discos de la muestra con cualquier material (por ejemplo, colágeno, ácido hialurónico, las nanopartículas de plata, etc.). </li><li> Para este experimento, el uso de poli-L-lisina para recubrir la superficie del sustrato. Para poli-L-lisina funcionalización, pipeta de 200 a 400 l de 0,1% de poli-L-lisina (en H 2 O) en discos de muestra, y dejar incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en una placa de Petri. </li><li> Después de 1 hora, use pinzas para sujetar el disco de muestra, y se lava con 1 ml de H2O desionizada Deje que se seque con toallas de papel como se describe en el paso 2.2. </li></ol></li><li> Tome 2x células resuspendidas lavadas y placa 200-400 l en discos de la muestra dentro de un gabinete de bioseguridad. Si los discos de muestra están recubiertas con poli-L-lisina, se incuba durante 0,5 horas a temperatura ambiente. </li><li> Después de la incubación de las células en discos de muestra, lavar suavemente con discos de la muestra 1 ml de H2O desionizada Deje secar durante la noche antes de discos de formación de imágenes. </li></ol> 3. KPFM Imaging NOTA: Para este experimento,utilizar una serie Agilent 5500 ILM-AFM. <ol><li> Para iniciar AFM, encienda la unidad de cómputo junto con el controlador HEB y MAC III de la AFM. Software de imágenes Abrir AFM (por ejemplo, PicoView de Agilent). Asegúrese de seleccionar inicialmente ACAFM o el que sea la denominación correcta es en el AFM para la imagen en modo intermitente contacto. </li><li> Con unas pinzas de AFM en la mano dominante, y la celebración de la titular de clip de resorte abierto con la mano subdominante, coloque un voladizo KPFM en la cabeza pieza. Tenga cuidado al manipular y transferir la pieza de cabeza a la AFM AFM como esta unidad (al menos en el 5500 ILM-AFM) contiene la unidad de cristal piezo frágil que controla X, Y, Z y direccionalidades de escaneo. NOTA: Los voladizos KPFM utilizados en este caso eran Mikromasch DPE conductor (bajo ruido) voladizos con frecuencias de resonancia promedio de 80 kHz y constantes de resorte de 2,7 N / m. Voladizos con estas frecuencias de resonancia y constantes de resorte se eligieron debido a su facilidad de uso.Voladizos con constantes de resorte más grandes y frecuencias de resonancia más altas también se pueden usar para formación de imágenes. </li><li> Coloque con cuidado la cabeza pieza en el AFM y conectar los cables adecuados (en este caso dos cables tienen que ser enchufado: la luz láser y motor de elevación de fase). </li><li> Alinear el láser sobre la punta del cantilever. Algunas unidades contienen una funcionalidad de la cámara que permite una alineación más fácil. Si funcionalidad de la cámara no está presente en AFM, alinear en la punta en voladizo como se describe a continuación: <ol><li> Gire el mando a la derecha de adelante hacia atrás para mover el láser overtop el chip en voladizo. Cuando el láser alcanza el chip será bloqueado y ya no será visible. Sólo gire la perilla de un par de veces. </li><li> Gire el mando de adelante hacia atrás en sentido antihorario hasta el punto láser vuelve a aparecer. El láser es ahora en el borde del chip. </li><li> Gire el botón de izquierda a derecha para colocar el láser en el voladizo. A medida que el láser pasa sobre el voladizo desaparecerá y reaparecerá in rápida sucesión. El punto de láser debe ser visible en la cubierta de vidrio esmerilado en la unidad fotodiodo tarde sentarse. </li><li> Gire el mando de adelante hacia atrás hacia la izquierda para mover el punto por el voladizo hacia la punta hasta el punto en el vidrio esmerilado desaparece. </li><li> Gire el mando de adelante hacia atrás las agujas del reloj sólo ligeramente con el fin de posicionar el láser de modo que sólo se sienta en el extremo en voladizo. El punto láser volverá a aparecer en el cristal esmerilado. NOTA: Este es el método de posicionamiento láser para voladizos trampolín. Para ménsulas triangulares, el proceso de alineación difiere ligeramente. </li></ol></li><li> Una vez que el láser está alineado, mantenga el motor de elevación de fase en la posición &quot;abierto&quot; durante 10 segundos para asegurar suficiente espacio entre la palanca y la muestra al colocar la muestra a la AFM. </li><li> Coloque la muestra en la etapa de la muestra KPFM. Planta la muestra usando un alambre de cobre. Conecte los cables apropiados desde el AFM para la etapa de la muestra. Conecte los sTage a la AFM. En la mayoría de los casos, la etapa se mantiene en su lugar mediante imanes. </li><li> En el software de AFM, sintonice el voladizo y luego comenzar enfoque de la punta en voladizo a la muestra. Asegúrese de que el tiempo de estabilización se fija en no más de 10 mseg, y que las velocidades de aproximación no exceda de 2,0 m / seg, a fin de evitar daños en la punta. </li><li> Una vez que la punta en voladizo está en la superficie de la muestra, seleccione un tamaño de la ventana de imágenes y zona ideal de formación de imágenes. Optimizar ganancias I y P, junto con el punto de modo que la imagen topográfica se optimiza conjunto voladizo. <ol><li> Una vez que la imagen topográfica se optimiza, encienda módulo KPFM (modo AM FM o; aquí, use el modo FM). Cabe señalar que la imagen KPFM es muy difícil fuera de 5 micras ventana de imagen x 5 m. También, para la proyección de imagen óptima KPFM, utilice una resolución de 512 x 512 con una velocidad lenta exploración (desde 0,02 hasta 0,05 líneas / seg). </li></ol></li><li> Para la configuración de FM-KPFM (no ACAFM ajustes), establezca el porcentaje de transmisión entre 5-10%. Ajuste el fr voladizoecuencia entre 1 - 5 kHz con un ancho de banda de 2 kHz. Set I y P ganancias para los ajustes de FM-KPFM a 0,3%. <ol><li> Varíe el ancho de banda de la señal y yo y ganancias P entre las superficies de la muestra. Para optimizar las imágenes SP, ajustar aún más el ancho de banda de la señal y I y P ganancias para obtener imágenes óptimas. El rango recomendado de ganancias I y P son 0,22 a 0,35%. </li></ol></li><li> Procesar y analizar recoge imágenes KPFM utilizando software de procesamiento posterior de las imágenes para recopilar datos SP. </li></ol>

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	<li>Seth, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+modeling+of+biofilm-infected+wounds:+a+review.">In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review.</a> J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).</li><li>Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+and+chronic+infections.">Biofilms and chronic infections.</a> JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).</li><li>Hoiby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+impact+of+bacterial+biofilms.">The clinical impact of bacterial biofilms.</a> Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).</li><li>Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impacts+of+hematite+nanoparticle+exposure+on+biomechanical,+adhesive,+and+surface+electrical+properties+of+E.+coli+cells.">Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).</li><li>Lorite, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+physicochemical+properties+at+the+micro+and+nano+length+scales:+role+on+bacterial+adhesion+and+Xylella+fastidiosa+biofilm+development.">Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li><li>Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+surface+potential+microscopy+of+spore+adhesion+on+surfaces.">Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces.</a> Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).</li><li>Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+plasma+membrane+surface+potential+of+PC12+cells+as+measured+by+Kelvin+probe+force+microscopy.">Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+the+positively+charged+bacterium+Strenotrophomonas+(Xanthomonas)+maltophilia+70401+to+glass+and+Teflon.">Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon.</a> J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).</li><li>Soon, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+surface+charge+of+colistin-susceptible+and+-resistant+Acinetobacter+baumannii+cells+measured+with+zeta+potential+as+a+function+of+growth+phase+and+colistin+treatment.">Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment.</a> J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).</li><li>Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Link+between+culture+zeta+potential+homogeneity+and+Ebp+in+Enterococcus+faecalis.">Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).</li><li>Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zeta+potential+as+a+measure+of+the+surface+charge+of+mycobacterial+cells.">Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells.</a> Ann Microbiol. , (2013).</li><li>Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+biological+samples.">Atomic force microscopy of biological samples.</a> Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).</li><li>Lindsay, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+tunneling+microscopy+and+atomic+force+microscopy+studies+of+biomaterials+at+a+liquid-solid+interface.">Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface.</a> J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).</li><li>Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kelvin+probe+force+microscopy+in+application+to+biomolecular+films:+frequency+modulation,+amplitude+modulation,+and+lift+mode.">Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode.</a> Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).</li><li>Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probe+force+microscopy+and+its+application.">probe force microscopy and its application.</a> Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).</li><li>Loppacher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM+demodulated+Kelvin+probe+force+microscopy+for+surface+photovoltage+tracking.">FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking.</a> Nanotechnology. 16 (3), (2005).</li><li>Domanski, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kelvin+probe+force+microscopy+in+nonpolar+liquids.">Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids.</a> Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).</li><li>Collins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+harmonic+Kelvin+probe+force+microscopy+at+the+graphene-liquid+interface.">Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface.</a> Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).</li><li>Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+potential+measurements+in+liquid+by+frequency+modulation+atomic+force+microscopy.">Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instru. 81, (2010).</li><li>Collins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+charge+screening+dynamics+and+electrochemical+processes+at+the+solid-liquid+interface+with+electrochemical+force+microscopy.">Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy.</a> Nature Comm. 5, 2871 (2014).</li><li>Pastar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+methicillin+resistant+Staphylococcus+aureus+USA300+and+Pseudomonas+aeruginosa+in+polymicrobial+wound+infection.">Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection.</a> PLoS One. 8 (2), (2013).</li><li>Brien, D. J., Gould, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+vancomycin+have+a+future+in+the+treatment+of+skin+infections.">Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections.</a> Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).</li><li>Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+surface+potential:+dual+effects+upon+ion+uptake+and.">Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and.</a> 155 (2), 808-820 (2011).</li><li>Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+teichoic+acid+net+charge+in+Staphylococcus+aureus+colonization+of+artificial+surfaces.">Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces.</a> Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).</li><li>Sinensky, A. M., Belcher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+and+high-resolution+protein/DNA+nanoarray+analysis+using+Kelvin+probe+force+microscopy.">Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+of+biomolecular+interaction+via+kelvin+probe+force+microscopy.">Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy.</a> ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

KPFM fue empleado como una novedosa técnica para la obtención de los datos eléctricos de superficie. Comúnmente se ha utilizado como un método para examinar la distribución de carga en química y sólo recientemente ha comenzado a aplicar para el estudio de sistemas biológicos en la micro y nano-escala. A partir de los datos recogidos, se encontró que los microbios no parecían adjuntar fácilmente para limpiar las superficies de acero inoxidable y oro, incluso después de 3 horas de incubación estática. Super...

Los biofilms producidos en las superficies del equipo y en las heridas cutáneas presentan un problema para la industria médica como biofilms son recalcitrantes a la eliminación y puede conducir a un aumento de las tasas de transmisión de enfermedades y la resistencia a los antimicrobianos. El apego es el primer paso en la formación de biopelículas y es el paso más crítico debido a su reversibilidad 1-3. Características de la superficie del sustrato juegan un papel crucial en el apego microbiana. Factores tales como la dureza superficial, porosidad, rugosidad, y la hidrofobicidad se ha demostrado que efectuar la unión microbiana; sin embargo, poca investigación examinar el papel de potencial de superficie de sustrato (SP) en la adhesión microbiana se ha hecho 4,5. Superficies cargadas negativamente impiden la unión de las esporas de Bacillus thuringiensis a la mica, silicio, y oro 6. Los cambios en el potencial de la membrana celular son indicativos de los cambios en la unión celular y la motilidad 5,7. Se ha observado que hom eléctricamentesuperficies ogeneous promueven más fácilmente microbiana adhesión 5. Caracterizar el potencial de superficie de las bacterias en la nanoescala puede proporcionar una forma novedosa para entender la cinética de adhesión de las bacterias a diversas superficies, y por lo tanto puede ayudar en el desarrollo de estrategias anti-incrustación biológica. A diferencia de otros métodos utilizados para caracterizar la cinética de electro de bacterias, tales como la dispersión de luz electroforética, el potencial zeta, y la determinación del punto isoeléctrico, Kelvin fuerza de sonda de microscopía (KPFM) permite el examen de las células individuales en lugar de culturas enteras 8-11. Esto es beneficioso cuando se quiere comparar célula-célula o del biofilm características eléctricas con alta exactitud y precisión. KPFM es un módulo de microscopía de fuerza atómica (AFM). AFM fue desarrollado como resultado directo del microscopio de efecto túnel (STM) 12. Las primeras imágenes publicadas usando STM fueron hechas por Gerd Binnig y Heinrich Rorhrer en 1982 12 </sup&gt;. Su invención fue capaz de resolver las estructuras atómicas por trama escanear una punta conductora fuerte sobre una superficie conductora en el aire. Las implicaciones de lograr imágenes de alta resolución biólogos que rápidamente intentaron utilizar STM a imagen muestras secas de ADN, las proteínas y los virus 12 emocionado. STM también se puede hacer en líquidos utilizando puntas de las sondas especializadas 13. Esto fue demostrado por Lindsay et al., Que utiliza STM y AFM a moléculas de ADN de imagen en 10 mM HClO 4 y en el agua, sobre electrodos de oro 13. KPFM se ha demostrado en la determinación de los potenciales superficiales de ADN y proteína de análisis 25 y biomoléculas interacción con ligandos 26. KPFM funciona midiendo la diferencia de potencial de contacto (CPD) entre una punta de AFM en voladizo conductora y una muestra idealmente conductor (Figura 1, i) 14,15. Las muestras no necesariamente tienen que ser conductora (es decir, sampl biológicaes). Imaging puede llevarse a cabo sobre mica, vidrio, y superficies de silicio (no conductores), siempre que la superficie no conductora es fino y no es un material conductor subyacente 6,7. El CPD es equivalente al potencial de tensión de la superficie y puede ser descrito como la diferencia en las funciones de trabajo entre la punta (punta φ) y la muestra (muestra φ), dividido por la carga del electrón negativo (- e). Cuando una punta de AFM conductora se pone cerca de una superficie de la muestra (separados por la distancia d), se genera una fuerza electrostática (F es) debido a la diferencia en las energías de Fermi (Figura 1, ii, a) 15. En este punto, las energías de vacío de la punta y la muestra (E v) están en equilibrio y alineado. Al llevar la punta más cerca de la superficie de la muestra, la superficie de la punta y la muestra entra en contacto eléctrico y actuar como condensadores de placas paralelas (Figura 1, ii, b </strong&gt;) 14,15. En el punto, las energías de Fermi de la superficie de la punta y la muestra se alinean, alcanzando un equilibrio de estado estacionario (Figura 1, ii, b). La superficie de la punta y la muestra se cargará y se formará una V CPD debido a una diferencia en E funciona &#39;s V y de trabajo. Actos Un F es en el área de contacto eléctrico debido a la CPD V formada. Esta fuerza se anula posteriormente a través de la aplicación de una V DC externa a la punta que tiene la misma magnitud que el CPD V formado (Figura 1, ii, c). Esto aplica voltaje DC elimina la carga superficial en el área de contacto eléctrico, y la cantidad de V DC necesario eliminar las F es de CPD V es igual a la diferencia en las funciones de trabajo entre la sasuperficie mple y propina 15. Cabe señalar que la función de trabajo de la punta es conocido y es proporcionada por los fabricantes. En todos los métodos KPFM, una tensión de CA (V AC, aproximadamente 100 - 500 mV) se aplica también a la punta con el fin de generar fuerzas eléctricas oscilantes entre la punta y la muestra 14. Esto proporciona una mejor resolución en la medición de los cambios en V CPD y / o F es. En este sentido, los cambios en la frecuencia o amplitud de la oscilación eléctrica pueden ser corregidos por V DC, y la superficie de mapas de potencial pueden ser generados. Los datos de las áreas específicas de estos mapas pueden ser analizados para proporcionar información eléctrica sobre las características topográficas específicas. KPFM puede funcionar en tres modos: (1) el modo de elevación, el modo (2) la modulación de amplitud (AM) y modulación de frecuencia (FM) 14,16 (3). Modo de elevación fue el inc inicialarnation de KPFM. Modo de elevación se basa en un método de dos pasos en el que una punta de oscilar, se arrastra a través de la superficie para obtener una imagen topográfica. Para el segundo pase la punta se eleva una distancia predeterminada por encima de la muestra (10 a 100 nm) y se explora de nuevo a través de la misma zona. Debido a este método de dos pasos, modo de elevación, en comparación con AM- FM-KPFM, toma más tiempo para la adquisición de imágenes. El aumento de la punta lejos de la superficie asegura que sólo se mide de largo alcance F es. Además, la diafonía entre topografía y de la superficie mediciones de potencial se desacopla a expensas de una mayor resolución lateral y sensibilidad. AM-KPFM mejora la resolución lateral y la sensibilidad mediante el uso de personas con doble frecuencias para medir simultáneamente la topografía de la muestra y potencial de superficie (exploración de una pasada) 14. En el modo AM, el voladizo se hace oscilar mecánicamente, generalmente 5% por debajo de su primera frecuencia de resonancia (f 0), y eléctricamente oscilado (tediante una V AC) en su segunda frecuencia de resonancia (f 1). Los cambios en la amplitud de f 0 conducen a la generación de los datos topográficos, mientras que los cambios en la amplitud de f 1, debido a los cambios en es F y V CPD, dan superficiales posibles datos de medición. f 0 y f 1 del voladizo están separados por frecuencias y energías importantes que señalan la diafonía se minimiza 14. La caja electrónica de cabeza (HEB) de la AFM separa las dos señales para indicar tanto topográfica y datos de superficie potenciales simultáneamente en una exploración. FM-KPFM mejora la resolución incluso más allá de AM-KPFM sobre superficies biológicas 14. FM-KPFM funciona de manera distinta AM-KPFM en que mide los cambios en los gradientes de fuerza electrostática en lugar de fuerza electrostática (F es) 15. Al igual que el modo AM, el modo de FM utiliza dual-frecuencias y una singlmecanismo de análisis de correo-pass para obtener topográfico y superficie de datos posibles de forma simultánea 14. En el modo FM, el voladizo se hace oscilar mecánicamente a f 0 y eléctricamente oscila a una frecuencia baja modificada (f mod, típicamente 1 - 5 kHz). Al interacciones electrostáticas, f 0 y f mezcla mod para producir bandas laterales f 0 ± f mod. Estas bandas laterales son muy sensibles a cambios en la fuerza electrostática, y pueden separarse de f 0 HEB a través de la AFM. Desde FM-KPFM mide los cambios en los gradientes de fuerza electrostática, las puntas forma del ápice y su mantenimiento / integridad juegan un papel crítico en la superficie global potencial de resolución 14, 15. Superficie resolución potencial utilizando AM y FM están en el rango de 1 nm lateralmente 14 -16. Cabe señalar que la imagen KPFM se puede hacer en líquidos no polares, y más recientemente, se ha demostrado que ser hecho en (&lt;10 mm) líquidos polares iónica baja (enKPFM modos de bucle abierto que no requieren una realimentación de polarización, obviando la aplicación de una polarización DC) como el agua MilliQ; Sin embargo, las imágenes KPFM aún no se ha hecho en las células vivas en soluciones polares 17-20. Retos adicionales asociados con la formación de imágenes SP en el líquido es que las soluciones comúnmente utilizados para las células que mantienen (es decir, tampón fosfato salino) tienen altas concentraciones de iones móviles, lo que llevaría a reacciones de Faraday, la dinámica de carga de polarización inducida, y difusión de los iones / redistribución 20. Por lo tanto, para este experimento, las mediciones se tomaron a partir de células de MRSA secos y muertos en superficies de acero inoxidable funcionalizados con poli-L-lisina acero y oro en condiciones ambientales. Imaging puede llevarse a cabo en condiciones de aire o de vacío en muestras biológicas que han sido previamente secado o inmovilizadas sobre superficies 20. Las condiciones de humedad también se han demostrado afectar de imágenes KPFM de las superficies 6. En este estudio, hemos empleado FM-KPFMy AFM para examinar el papel de la SP en la unión de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina USA100 (MRSA) a las superficies de acero inoxidable y oro funcionalizadas poli-L-lisina. MRSA ganó recientemente condición de resistente a múltiples fármacos (MDR) &quot;superbacteria&quot; debido a su resistencia seleccionado naturalmente a muchos antibióticos β-lactámicos y cefalosporinas 21. Infecciones de MRSA son ahora más difícil, difícil, y formidable para tratar, lo que lleva a la utilización de los antimicrobianos más severas tales como vancomicina o oxazolidinonas que tienen altos niveles de toxicidad en los seres humanos, y por lo tanto no se puede utilizar como tratamientos a largo plazo 22. El acero inoxidable fue elegido debido a su relevancia médica y el uso común como material en agujas hipodérmicas, orinales, manijas de puertas, lavabos, etc. El oro fue utilizado como un metal comparativa. FM-KPFM se utilizó para examinar si la membrana microbiana SP cambia tras la unión de los sustratos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5500ILM Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9435S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AFM/STM Metal Specimen Discs</td>
			<td style="width:71px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:119px;">#16219</td>
			<td>Stainless steel sample discs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes</td>
			<td style="width:71px;">Mikromasch</td>
			<td style="width:119px;">#HQ:DPE-XSC11</td>
			<td>There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.&#160; We utilized cantilever B for experiments.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs</td>
			<td style="width:71px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:119px;">#16218-G</td>
			<td>Gold sample discs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PicoView Software</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9797B</td>
			<td>5500ILM Atomic Force Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pico Image Software (Pico Image Basic)</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9797AU-1FP</td>
			<td>5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#91201513</td>
			<td>Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#221261</td>
			<td>Pre-made plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#257107</td>
			<td>Comes as a dry powder.&#160; Instruction on how to make come on the container.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface potential measurement of bacteria using kelvin probe force microscopy

Potencial de superficie es una característica física comúnmente pasado por alto que desempeña un papel dominante en la adhesión de los microorganismos a las superficies del sustrato. Kelvin fuerza sonda microscopía (KPFM) es un módulo de microscopía de fuerza atómica (AFM) que mide la diferencia de potencial de contacto entre las superficies en la nano escala. La combinación de KPFM con AFM permite la generación simultánea de potencial de superficie y mapas topográficos de muestras biológicas tales como células bacterianas. Aquí, empleamos KPFM para examinar los efectos de potencial de superficie sobre la adhesión microbiana a superficies médicamente relevantes como el acero inoxidable y oro. Superficie potencial mapas revelaron diferencias en el potencial de superficie para las membranas microbianas en diferentes sustratos de material. Un gráfico de paso a la altura fue generado para mostrar la diferencia en el potencial de superficie en una zona límite entre la superficie del sustrato y los microorganismos. Los cambios en el potencial de la superficie de la membrana celular se han relacionado con el cambios en el metabolismo celular y la motilidad. Por lo tanto, KPFM representa una herramienta poderosa que se puede utilizar para examinar los cambios de potencial de superficie de la membrana microbiana sobre la adhesión a diversas superficies de sustrato. En este estudio, se demuestra el procedimiento para caracterizar el potencial de la superficie de las células individuales resistentes a la meticilina Staphylococcus aureus USA100 en acero inoxidable y oro usando KPFM.

La capacidad de medir SP usando KPFM se basa en el principio de que tanto la superficie de la muestra y la punta en voladizo son conductoras hasta cierto punto. Acero inoxidable y oro actuaron como superficies conductoras a las que se adjuntaban MRSA. KPFM imágenes fueron tomadas de 15 células de MRSA en ambas superficies con 512 x 512 resoluciones, y con áreas de escaneado que van desde 5 x 5 m a 10 x 10 m. Scanning se llevó a cabo con velocidades de línea que van desde 0,02 líneas / seg a 0,05 líneas / seg. Por...

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Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

surface-potential-measurement-bacteria-using-kelvin-probe-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.6K vistas.  University of Guelph. Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces. 

Video: Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. For example, they play an important role in directing cell migration during wound healing. Here we describe the manufacture and use of ultrasensitive vibrating probes for measuring extracellular electric currents. The probe is an insulated, sharpened metal wire with a small platinum-black tip (30-35 &mu;m), which can detect ionic currents in the &mu;A/cm2 range in physiological saline. The probe is vibrated at about 200 Hz by a piezoelectric bender. In the presence of an ionic current, the probe detects a voltage difference between the extremes of its movement. A lock-in amplifier filters out extraneous noise by locking on to the probe's frequency of vibration. Data are recorded onto computer. The probe is calibrated at the start and end of experiments in appropriate saline, using a chamber which applies a current of exactly 1.5 &mu;A/cm2. We describe how to make the probes, set up the system and calibrate. We also demonstrate the technique of cornea measurement, and show some representative results from different specimens (cornea, skin, brain).

The manufacture, calibration and use of non-invasive vibrating probes to measure bioelectric current in various biological systems is described.

Medición de la corriente bioeléctrica con una sonda vibrante

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

Investigación

Bioingeniería

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

La medición de la cohesión agregado por tensiometría tejido de la superficie

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Medición de la fuerza isométrica máxima generada por las fibras musculares esqueléticas permeabilizadas

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...