Este trabajo fue financiado por una beca de la National Science Foundation (adjudicación número IOS-1031416) y ha sido realizado en colaboración con Nathan Miller, Logan Johnson y Edgar Spalding, de la Universidad de Wisconsin y Brian Bockelman, Carl Lundstedt y David Swanson, de la Universidad de Holanda Computing Center de Nebraska.

1. Imagen de protocolo de toma Consideraciones: Este protocolo se lleva a cabo de manera más eficiente con dos personas, aunque es posible para uno de trabajar solo. El acuerdo de trabajo mejor en este laboratorio era para una persona para preparar platos para el escaneo mientras que otros trabajos sobre la configuración del escáner, luego ambos trabajan juntos para colocar las placas en los escáneres e iniciar el proceso de escaneado. También es importante señalar que los escáneres en este proyecto están orientados verticalmente con las tapas de escáner de descanso en la parte posterior del escáner. Se realizó un soporte personalizado para mantener los platos en esta posición vertical y se fija a la superficie de superficie plana con Tiras Command 3M (Figura 2). La cubierta de documentos desmontable que viene con el escáner utilizado en este protocolo (un Epson V700) estaba forrada por una cara de fieltro negro. La cubierta de documentos se posicionó en contra de la superficie plana con una cuerda elástica paramantener las placas en su lugar y para proporcionar contraste de la imagen (figura 3). Cualquier escáner de suficiente resolución podría ser utilizado para la captura de imagen. La perfección V700 de Epson fue elegido debido a su perfil de la plaza (por lo que es fácil de colocar en posición vertical), su alta resolución y las opciones adicionales para escanear desde el tanto de la cama y la tapa y utilizar el canal infrarrojo. Estas opciones adicionales que no fueron utilizadas en este protocolo. Una vez que las placas han sido retirados de la cámara de crecimiento, es imperativo que el protocolo de continuar hasta el final. Preparación Plate Se utilizaron placas de Petri estándar que contiene 10 ml de medio transparente y 9 semillas plantadas a través del centro de cada plato. Los procedimientos para el etiquetado de placas, preparación de medios y la siembra se puede encontrar en: <a href="http://www.doane.edu/doane-phytomorph">http://www.doane.edu/doane-phytomorph</a> <ol><li&gt; Recuperar la primera placa de agar y absorber la condensación recogida en la tapa y el borde de la tapa de la placa de agar con un Kimwipe. </li><li> Aplicar de Triton X-100 (un detergente) a la tapa con un Kimwipe - ser generoso. (Tenga en cuenta que Triton X-100 ayuda a prevenir la acumulación de condensación en la tapa cuando la placa se escanea. Una aplicación generosa (lo suficiente para crear una película sobre la superficie de la tapa) le ayudará a asegurarse de que la tapa permanece transparente durante todo el plazo del escáner .) </li><li> Envolver la placa con cinta de microporos para asegurar la tapa, y para permitir la ventilación. </li></ol> Configuración del escáner y la colección de imágenes Este protocolo asume que se está usando más de 1 escáner, y proporciona instrucciones para iniciar varios escáneres desde un único equipo. <ol start="4"><li> Crear carpetas para almacenar imágenes de cada escáner. Cada escáner celebrará dos platos, así que tenga esto en cuenta al crear carpetas. Unopodrían optar por utilizar los metadatos como componentes del nombre de archivo, como identificadores únicos para cada placa, edades de plántulas, tamaño de la semilla, y los identificadores de las poblaciones de plantados. Un ejemplo de un nombre de carpeta utilizado en la recogida de datos que contiene estos metadatos es &quot;1652-2-SM-9-92-17-1653-2-LG-88-79-161&quot;. </li><li> Establecer temporizadores de salida para el tiempo recogiendo designado (9 hr fue utilizada en este laboratorio). Asegúrese de ajustar el tiempo extra (una hora aproximadamente) para la preparación. (Tenga en cuenta que los escáneres deben ser conectados a los temporizadores de salida con el fin de establecer el tiempo de adquisición. Mientras que el software VueScan permite a un usuario para recoger imágenes en repetidas ocasiones, que no permite al usuario indicar la cantidad de imágenes para cobrar o por cuánto tiempo para recoger imágenes de .) </li><li> Encienda el primer escáner y esperar aproximadamente 10 segundos para el escáner para ir a través de sus primeros calentamientos. </li><li> Abra el programa VueScan vez. VueScan 9.0.20 versión fue utilizada en este protocolo (véase la Tabla de Materiales), aunque las versiones más recientes se pueden utilizar con poco modificción. Asegúrese de que el botón &quot;Más&quot; se ha pulsado en el panel inferior de la interfaz de usuario con el fin de mostrar las opciones del menú que se describen a continuación. </li><li> Establezca la repetición automática: cuadro desplegable a ninguno en la ficha de entrada y en la pestaña de cultivos establecido área Vista previa: para máxima (Figura 4). Presione en &#39;Vista previa&#39;. </li><li> Crear un cuadro de recorte que capturaría la región de interés utilizando el ratón para hacer clic y arrastrar a través de la región de interés en la imagen de vista previa. Los ajustes pueden ser alterados por la región de interés en la ficha Recortar. Los ajustes típicos utilizados para el cuadro de recorte fueron: desplazamiento x-0.675; y-desplazamiento en 1.924, aunque éste se ajustó a capturar el área de plántulas para cada escáner. El tamaño de la casilla de recorte utilizado fue 7.246 en ancho por 1,1 de altura (Figura 5). </li><li> Para mover el cuadro de recorte, mantenga pulsada la tecla Mayús mientras arrastra con el ratón. Asegúrese de que el cuadro de recorte contiene todas las plántulas a digitalizar más cualquier metadatos deseado que pudiera estar contenida en una etiqueta (Figura 5). </li><li> En la pestaña de cultivos, establecer el área de vista previa: a la caja de los cultivos y el Pulse &#39;Vista previa&#39;. </li><li> Ir a la ficha Salida y seleccione el archivo correcto para el escáner (Figura 5). </li><li> Repita los pasos 1.7 a 1.12 en todos los escáneres de un ordenador. Elija la opción &quot;sí&quot; cuando se le pregunta si desea abrir más de una instancia de VueScan. </li><li> Ir a través de cada ficha y comprobar la configuración es correcta. (Tenga en cuenta que los especificaciones pueden modificarse para adaptarse a las necesidades de cada laboratorio incluyendo el color de imagen, resolución, etc. Sin embargo, los valores utilizados en este protocolo pueden aplicarse directamente a la particular escanear el hardware de un laboratorio dado debido a la interfaz común del software VueScan. Consulte la lista de especificaciones adjunta para ver los parámetros utilizados en este proyecto, utilizando la versión 9.0.20 VueScan). </li><li> En la pestaña Input elegir continua en la repetición automática: campo, o elija un intervalo de tiempo más largo entre las imágenes si así lo desea. El intervalo de tiempo es la longitud de tiempo que el escáner se detiene después de guardar la última imagen y comenzar la recolección de la siguiente imagen. En el modo continuo, 3-4 min resolución se puede obtener en 4800 dpi. </li><li> Repita los pasos 1.14 a 1.15 para el resto de los escáneres conectados a un solo ordenador. </li><li> Coloque las placas preparadas en los escáneres correctas con plántulas orientados horizontalmente (no gravistimulate). </li><li> Coloque temporalmente un negro, fieltro fondo contra las placas para que no se caigan de la plantilla de plexiglás. Repita el procedimiento para exploraciónsocios. (Nota: En este proyecto, las piezas negras de fieltro se adjunta al documento cubre suministra con el equipo para evitar el deslumbramiento y para proporcionar un contraste contra el tejido de la raíz El color de fondo específico utilizado dependerá del color del tejido que se va a ver.). </li><li> Haga que una persona a su vez las placas de 90 ° (placas se volvieron hacia la izquierda en este protocolo) y de inmediato reemplazar el fondo de fieltro. </li><li> La otra persona debe estar de pie frente a la computadora para que puedan inmediatamente presione el botón &#39;Scan&#39;. </li><li> Asegure los antecedentes del escáner con una cuerda elástica (Figura 3). Haga que una persona sostenga el fondo en su lugar mientras otra posición el cable de bungee. (Nota: Inmediatamente después gravistimulation (rotación de las placas a 90 °) y la colocación del fondo de fieltro, &#39;Scan&#39; debe ser presionado). </li><li> Repetir los pasos 1.17 a 1.21 para el resto de los escáneres en un solo ordenadoreser. </li><li> Repita los pasos 1.6 a 1.22 para la siguiente serie de escáneres de corresponder. </li><li> No deje que los escáneres hasta varias imágenes han sido recogidos para asegurarse de que están ahorrando correctamente. </li><li> Es ideal para mantener a los lectores en un área que va a estar libre de perturbaciones para el tiempo de exploración designada. También es prudente considerar las condiciones ambientales en el área de exploración para asegurar respuestas ideales fenotípicas. </li><li> Cuando la recogida de datos se ha completado, pulse el botón de anulación verde en cada ventana VueScan que coincide con cada escáner. </li><li> Cierre de todos los programas en el equipo. </li><li> Reinicie el equipo y apague todos los escáneres antes de iniciar una nueva ronda de la colección de imágenes. </li></ol>

<ol>
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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+feature+counting+and+measurement+of+roots.">High-throughput feature counting and measurement of roots.</a> Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La observación fenotípica exacta es crucial para la comprensión de las manifestaciones de la función de genes dentro de un organismo. Una forma de adquirir información fenotípica es a través de la captura de datos de imagen de alta resolución. La plataforma basada en el escáner desarrollado ha permitido la recolección de muchas imágenes (200 imágenes / período de exploración) en alta resolución (4800 dpi) durante un número de horas. Además, esta plataforma se adapta fácilmente a una variedad de entornos de laboratorio y de la clase debido a la flexibilidad del software VueScan para funcionar miles de diferentes escáneres utilizando una interfaz común 18. El método que aquí se presenta llena un vacío en el alto rendimiento de captura de imagen que se extiende desde las grandes instalaciones de fenotipado de escala y los sistemas automatizados implementables en un solo laboratorio. Las plataformas de alto rendimiento disponibles en la actualidad tienden a usar el hardware de imágenes especializado, incluyendo cámaras montadas sobre soportes robóticos, para capturar imágenes de alta resolución de primarily arriba tejidos vegetales del suelo (por ejemplo, Centro para la Planta de Tecnología Integrativa y el Scanalyzer HTS por LemnaTec) 20,21. Sistemas de imagen especializados que utilizan tecnologías de resonancia magnética de rayos X y también se han desarrollado para la imagen de abajo tejidos de tierra con notable resolución a medida que crecen en el ambiente del suelo (por ejemplo, el Centro de Tecnología Integrativa Vegetal) 11,22,23. Este desarrollo de la tecnología más especializada es generalmente a costa de rendimiento, por lo que los estudios fenotípicos dinámicos más difícil. Es importante destacar que las necesidades de coste y de infraestructura para estas plataformas de gama alta hacen inviable principalmente para su aplicación en los laboratorios más pequeños. Plataformas también se han desarrollado, que utilizan la tecnología de captura de imágenes más estándar y son muy adecuadas para la medición de las respuestas dinámicas tales como la respuesta a un estímulo de la raíz de la gravedad. Por ejemplo, las cámaras CCD se han utilizado para capturar las respuestas de plántulas individuales a la luz y la gravedad en alto1,8,12 resolución espacial y temporal. Otros sistemas se han desarrollado lo que permite la medición de la orientación de la punta de la raíz de las múltiples raíces de una sola imagen (por ejemplo RootTipMulti por la iPlant Collaborative) 17,24. En el primer caso, el rendimiento es relativamente bajo dado que sólo una plántula se crea una imagen por cada cámara a la vez, mientras que en el último caso el rendimiento es superior, pero generalmente a costa de la resolución. El procedimiento descrito en este artículo se presenta una plataforma para la captura de imágenes de alta resolución en un alto rendimiento con equipos y software que son fácilmente disponibles y relativamente asequible. Utilizando esta configuración, 1.080 respuestas individuales de raíz se pueden recoger cada semana en un único laboratorio equipado con una batería de seis escáneres. En 15 meses de recogida de un promedio de 864 respuestas individuales a la semana, un total de 41.625 plantas de semillero se analizan en busca de un estudio de la genómica. Alrededor del 15% de las colecciones individuales falló debido a un error de configuración, Nefracaso rk o mal funcionamiento del equipo. Otro 22% de respuestas fracasaron debido a la falta de germinación o crecimiento de las raíces insuficiente para provocar una respuesta de crecimiento. El último conjunto de datos consta de 27.475 respuestas de plántulas individuales a un estímulo gravedad desde 163 líneas endogámicas recombinantes, además de 99 líneas casi isogénicas. Los datos fueron recogidos en un solo laboratorio, haciendo de este un enfoque de muy alto rendimiento. Incluso teniendo en cuenta que los equipos utilizados para la adquisición es relativamente barato, que ha funcionado de forma fiable durante más de dos años, incluso con un uso intensivo. Aunque este protocolo ha sido muy útil para los objetivos de investigación de este grupo, todavía existen algunas limitaciones. Debido a el rendimiento de alrededor de 50 GB de datos de imagen sin comprimir por día, era evidente que se necesita una gran cantidad de espacio a las imágenes de la casa a menos esquemas de compresión eficaces podrían desarrollarse. El problema de almacenamiento se resolvió temporalmente mediante la compra de discos duros externos para cada equipo. Además, dos 1Red 0 TB dispositivos de almacenamiento asociados fueron adquiridos. Más tarde, se desarrollaron algoritmos de compresión, como se describió anteriormente, que puede ayudar a reducir el tamaño de los datos hasta en un 60% (Figura 8). Es importante señalar que la velocidad a la cual los datos pueden ser guardados en un dispositivo de almacenamiento asociado red depende de la velocidad de la conexión de red. Esquemas de compresión también se han visto limitadas por el deseo de evitar la pérdida de datos de imagen. También se están considerando otras limitaciones propias de un sistema de imagen basado en el escáner. Por ejemplo, en un enfoque basado en el escáner de plántulas están expuestos a luz de alta intensidad en los rangos blanco y potencialmente infrarrojos durante cada exploración. Esto probablemente afecta el crecimiento de las plántulas, aunque las plántulas todavía se pueden observar a someterse respuestas sólidas a un estímulo gravedad (Figura 7). Una mejora en el futuro podría incluir la programación de este tipo de escáneres que sólo LEDs infrarrojos están activos. Un área en la developmen activot es la creación de algoritmos de análisis y de concordancia con la resolución y el rendimiento de estos datos de la imagen. El gran conjunto de datos generados con este método basado en el escáner ha sido ideal para el desarrollo de herramientas robustas para el alto rendimiento fenotipificación de las imágenes de plántulas. El algoritmo de compresión empleado en estas imágenes que se muestran en la Figura 7 es compatible con la afirmación de que son susceptibles a aplicaciones de análisis de imagen. Además, las imágenes generadas pueden ser analizados por el algoritmo previamente publicado, RootTrace 17,24, si se recogen en una resolución más baja (menos de 1.200 dpi), y las plantas de semillero individuales se dividen en segmentos de la imagen utilizando el algoritmo de compresión descrito anteriormente antes del análisis. Datos de crecimiento de las raíces podrían ser extraídos de las imágenes reducidas a 1200 dpi, mientras que los datos del ángulo de punta podrían extraerse de las imágenes reducidas a 900 dpi (observación no publicada). El procedimiento descrito en este documento se inscribe en su propio nicho en el mundo de la root de imágenes, ya que es de alto rendimiento y alta resolución sin dejar de ser relativamente asequible. Una ventaja adicional de este método es que puede ser fácilmente modificado para requisitos particulares para adaptarse a las necesidades de imagen de un grupo de investigación en particular.

Recogida de datos fenotípicos de alta resolución es útil en los estudios que tienen como objetivo comprender la interacción de la genética y el medio ambiente en la mediación del organismo función 1,2. Los estudios de esta naturaleza también son inherentemente de gran escala, por lo que es necesario, además, que los métodos empleados para medir fenotipos en este contexto ser altos en el rendimiento de 3,4. En el establecimiento de métodos para la investigación phenomics escala, intercambios entre la salida y la resolución entran en juego. Métodos que son más altos en el rendimiento también tienden a ser más bajos en la resolución, por lo que es más difícil de detectar pequeños efectos de la genética o el medio ambiente 5. Alternativamente, los métodos que miden más cuidadosamente un fenotipo deseado también tienden a ser menores en el rendimiento, por lo que es difícil para medir los efectos genéticos y ambientales ampliamente. Además, los métodos manuales para la cuantificación de fenotipos, incluyendo inspección visual, pueden estar sujetas a variación debido a las diferencias en los ingresos per humanacepción 6. Tecnologías de la imagen pueden proporcionar un puente útil entre el rendimiento y la resolución en la obtención de observaciones fenotípicas 7-9. En general, una imagen es relativamente fácil de capturar, facilitando el rendimiento, y cuando se toma en suficiente resolución, fenotipos sutiles se puede detectar 1,2,7. Tecnologías de la imagen tienden a ser modificable para adaptarse a un sistema o proceso de interés y son generalmente escalable 10-12. Debido a esto, las tecnologías de imágenes son ideales para el desarrollo de estudios a gran escala de la función del organismo. La respuesta de la raíz primaria a un estímulo gravedad es un proceso fisiológico complejo que se produce dentro de un órgano morfológicamente sencilla. La respuesta implica la activación de vías de señalización que se propagan a través del órgano de la raíz y su progresión está determinada por factores genéticos y ambientales, incluyendo factores genéticos influenciados por el ambiente 12-14 </sup&gt;. La respuesta de la raíz primaria a un estímulo gravedad se ha estudiado por lo menos desde Darwin, todavía hay mucho que aprender acerca de cómo funciona, sobre todo en los primeros eventos de señalización y en los factores que median la respuesta plasticidad 12,14,15. Obtener un conocimiento detallado de la dinámica de esta respuesta es importante en la búsqueda de formas de mejorar la capacidad de las plantas de semillero para convertirse exitosamente establecida dentro de un entorno determinado 16. Además, la forma de la raíz hace que sea susceptible para aplicaciones de procesamiento de imágenes 8,12,17. Tomados en conjunto, la respuesta gravitrópica raíz es un sistema ideal para el desarrollo de la tecnología de formación de imágenes de alto rendimiento para el propósito de llevar a cabo estudios de genómica a nivel de la función del organismo. En este informe se presenta un alto rendimiento, método de alta resolución de captura de imagen de la respuesta gravitrópica raíz utilizando escáneres planos baratos, disponibles en el mercado. La visión general de laprotocolo se muestra en la Figura 1. Las plántulas sembradas en placas de agar se colocaron sobre los escáneres planos orientados verticalmente equipados con los titulares de plexiglás de encargo de la placa. Las imágenes se recogieron cada pocos minutos a 4800 dpi y se guardan en una unidad local o en el servidor de datos. Metadatos asociados con cada serie de imágenes se almacena en una base de datos y las imágenes almacenadas se procesan. El método utiliza el software VueScan para la captura de imágenes. VueScan puede ser utilizado para ejecutar más de 2.100 escáneres diferentes en Windows, Mac, o sistemas operativos Linux (ver Tabla de Materiales). Se utilizó una resolución del escáner de 4800 ppp en esta aplicación para que coincida con la resolución alcanzada en los estudios anteriores utilizando cámaras CCD fijas 1,8,12. La flexibilidad del software VueScan junto con la interfaz común se utiliza para cualquier escáner se ejecuta permite a los usuarios adoptar fácilmente prácticamente cualquier hardware del escáner de suficiente resolución para el protocolo presentado en este documento. Rendimiento actual permite la colección de216 respuestas individuales por día. La tecnología es adaptable y escalable para su uso en las instituciones que van a escuelas preparatorias para investigar universidades. Además, las imágenes recogidas son de calidad suficiente para aplicaciones de análisis de imagen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V700 Photo Scanners</td>
			<td>Epson</td>
			<td>B11B178011</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas Scanner Template</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made. See Figure 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart Strap Bungee Cords</td>
			<td>SmartStraps</td>
			<td>Wal-Mart 1079478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brinks Digital Outdoor Timers</td>
			<td>Brinks</td>
			<td>Wal-Mart 42-1014-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VueScan Software</td>
			<td>Hamrick Software</td>
			<td><a href="http://www.hamrick.com/">http://www.hamrick.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Segmentation Software</td>
			<td>Chris Wentworth, Doane College</td>
			<td></td>
			<td>https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Micropore Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-061-655</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made by gluing two cookie racks together.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flatbed scanners to collect high-resolution time-lapsed images of the arabidopsis root gravitropic response

Los esfuerzos de investigación en biología exigen cada vez más el uso de metodologías que permitan la recolección de grandes volúmenes de datos de alta resolución. Un reto laboratorios pueden enfrentar es el desarrollo y el logro de estos métodos. Observación de los fenotipos en un proceso de interés es un objetivo típico de los laboratorios de investigación que estudian la función del gen y esto se logra a menudo a través de captura de imagen. Un proceso particular que se presta a la observación utilizando enfoques de imagen es el crecimiento correctivo de una raíz de plántulas que se ha desplazado de la alineación con el vector de gravedad. Plataformas de imágenes que se utilizan para medir la respuesta gravitrópica raíz puede ser costoso, relativamente baja en el rendimiento y / o mano de obra. Estas cuestiones se han abordado mediante el desarrollo de un método de captura de imagen de alto rendimiento utilizando todavía en alta resolución, escáneres de bajo costo, de superficie plana. Usando este método, las imágenes se pueden capturar cada pocos minutos a 4800 dpi. La configuración actual permite la recolección de 216 r individuoesponses por día. Los datos de imagen recogidos son de amplia calidad para aplicaciones de análisis de imágenes.

Imágenes representativas Este enfoque permite una rápida producción de series de tiempo de alta resolución de crecimiento de las plántulas de Arabidopsis. Imágenes primero y último de una corrida escáner se muestran en las figuras 7A y 7B. Figuras 7C y 7D muestran resultados óptimos a partir de la mitad de una imagen de escáner completo. Algunas cuestiones que pueden afectar a la calidad de imagen se muestran en las Figuras 7A y 7B. Estos temas incluyen la variación en la germinación, la variación en la trayectoria de crecimiento de las plántulas en el inicio de la carrera, y la acumulación de condensación durante el escaneo. La condensación puede ser resuelto en gran medida mediante el aumento de la cantidad de Triton X-100 se aplica a la parte interior de la tapa de la placa. Otros factores que podrían inhibir la colección de imágenes precisas son la configuración incorrecta del cuadro de recorte con respecto a las placas de posición de la placa y de posicionamiento de manera que están sesgadas con respecto al cuadro de recorte. Aplicación de Análisis de Imagen: Compresión de imagen Una vez se ha obtenido una secuencia de tiempo de las imágenes de escáner, debe ser almacenado de forma segura en una forma accesible de la red para facilitar el análisis de imágenes. Los archivos de imagen asociados con un avance de exploración individual ocupan una cantidad significativa de espacio en el disco duro. Un solo archivo TIFF recogida en 4800 dpi es de unos 220 MB y una carrera escáner típico genera 200 archivos de imagen. Por lo tanto, alrededor de 44 GB de espacio en disco duro es necesario por corrida. Para reducir los costes de almacenamiento y de transmisión de red asociados con análisis de imagen es deseable para reducir la cantidad de espacio necesario para almacenar datos de imagen, mientras que al mismo tiempo reducir al mínimo la pérdida de datos. Análisis Downstream implicará la identificación de cada plántula en archivos de imágenes posteriores asociados a una prueba experimental. Por lo tanto, la segmentación a cabo una plántula de la imagen del escáner se puede facilitar el análisis de aguas abajo. Debido a la segmentación de la plántula lejos del resto de the imagen también puede reducir significativamente el almacenamiento de fondo innecesarios pixeles, este enfoque también conduce a una reducción significativa en el tamaño de datos. Además, si el análisis de aguas abajo se centra en tejido de la raíz que puede no ser necesario retener la información de color desde los píxeles de raíz son relativamente estrecho en su espacio de color. Un protocolo de procesamiento de imagen de la computadora y el código para reducir el tamaño de los datos tanto por segmentar a cabo plántulas individuales y convertir imágenes a escala de grises se ha desarrollado. El enfoque da como resultado una reducción del 60% en los requisitos de espacio de almacenamiento. El flujo de trabajo utilizado para lograr esta compresión de datos se describe en los siguientes pasos: <ol><li> Comience con una serie de tiempo de los archivos de imagen de escáner en una sola carpeta. </li><li> Para cada imagen, convertir de RGB a escala de grises (Figura 8, arriba). </li><li> Dividir la imagen en los lados izquierdo y derecho. </li><li> Extraiga cada plántula de la imagen en su propio archivo (Figura 8).Esto se hace mediante la aplicación de un umbral para convertir píxeles a negro o blanco y luego el cálculo de la intensidad total de píxeles de cada fila de imagen. La fila con la mayor intensidad se identifica y cada píxel se clasifica como &#39;planta&#39; o &#39;nonplant&#39; basado en la intensidad de sus vecinos. El centro de cada &#39;planta&#39; dentro de esta fila se encuentra y desde ese momento un cuadro de recorte de un tamaño predeterminado se dibuja (Figura 8, abajo). </li><li> Crear una carpeta separada para cada lado de la imagen (izquierda y derecha) con subcarpetas separadas para cada plántula para el almacenamiento de archivos de imágenes de series de tiempo individual. </li><li> Archive las carpetas resultantes en un archivo ZIP comprimido. </li></ol> Es un código que lleva a cabo estos pasos se ha desarrollado utilizando el lenguaje de programación Python 20. El algoritmo permite una reducción de aproximadamente 60% en el tamaño de datos y tiene éxito en la identificación de todas las plantas de semillero individuales en 90% de la imag escánerarchivos electrónicos analizados hasta el momento. Los códigos están disponibles gratuitamente para su descarga bajo la Licencia Pública General GNU versión 3 (véase la Tabla de Materiales). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. El procedimiento de exploración se inicia con la siembra de la semilla (hasta nueve semillas de Arabidopsis por placa) y termina con el almacenamiento de datos y procesamiento de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. T emplate para la construcción de apoyo para la placa de Petri. Ple<html> xiglas se cortan de tal manera que la anchura encaja la superficie plana (en este caso 227 mm) y la longitud era de 128 mm. Dos círculos con un diámetro de 88 mm se cortaron de la pieza restante de tal manera que se distribuyeron de manera uniforme a lo largo de la anchura y la longitud del soporte. El soporte se fija a la superficie plana con Tiras Command 3M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3.jpg" width="500px" /> Configuración del escáner Figura 3. Después de plántulas han sido gravistimulated y la cubierta de documentos colocados. Esta es la configuración del escáner en el paso 1.21 de configuración del escáner y de la colección de imágenes.&quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4. Captura de pantalla de los ajustes seleccionados para el paso 1.8 de configuración del escáner y de la colección de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5.jpg" width="500px" /> Figura 5. Captura de pantalla del software VueScan durante los pasos 1.9 y 1.10 de la configuración del escáner y de la colección de imágenes. El cuadro rojo destaca el tamaño de la cosecha, mientras que la caja azul se destacan los ajustes específicos fo<html> r x-e y-offset se utiliza con el fin de capturar las plántulas y la información de la etiqueta. La región de la cama plana para digitalizar se muestra como una línea de puntos en el área de vista previa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 6" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6.jpg" width="400px" /> Figura 6. Selección de la carpeta de destino para el paso de 1,12 de configuración del escáner y de la colección de imágenes. Al pulsar el botón @ junto al cuadro de diálogo Buscar carpeta por defecto (flecha roja) permite al usuario seleccionar la carpeta de destino adecuado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . re 7 &quot;fo: content-width =&quot; 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; Figura 7 (AD). Las imágenes anteriores son ejemplos de los recogidos utilizando el método descrito en este artículo. Paneles A, B y C, D son los primeros y finales imágenes, respectivamente, a partir de un único período de exploración. A, B muestran la completo del área de escaneado, mientras que C, D son una región recortada de la zona explorada, mostrando una sola placa. Varias inconsistencias pueden ser observados. El panel A muestra la variación en la germinación y en la trayectoria de crecimiento. Grupo B (los mismos plántulas como imagen; 9 horas posteriores) muestra que las placas se pueden acumular condensación. Los paneles C y D se consideran buenos resultados debido a la sólida o crecimientof plántulas y la calidad de imagen a lo largo de la carrera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8.jpg" width="600px" /> Figura 8. El algoritmo de compresión de imágenes que creó convierte una imagen de escáner a escala de grises (arriba). La imagen se divide en mitades derecha e izquierda y se eliminan bordes de la imagen (no se muestra). Las posiciones de las plántulas individuales de cada medio se identifican mediante la búsqueda de la fila con la intensidad de píxel total más grande. Esas posiciones se utilizan para definir una nueva área de recorte, se aplica a todas las plantas de semillero en la placa (abajo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

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Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Este protocolo describe un proceso para la toma rápida de imágenes de plantas de semillero de Arabidopsis en respuesta a un estímulo de gravedad, utilizando escáneres planos disponibles en el mercado. El método permite barato, la captura de grandes volúmenes de imágenes de alta resolución susceptibles de algoritmos de análisis de aguas abajo.

El uso de escáneres planos para recopilar de alta resolución de duración transcurrido Imágenes de la gravitrópica Respuesta Arabidopsis Root

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

using-flatbed-scanners-to-collect-high-resolution-time-lapsed-images

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K vistas.  Doane College.  Este protocolo describe un proceso para la toma rápida de imágenes de plantas de semillero de Arabidopsis en respuesta a un estímulo de gravedad, utilizando escáneres planos disponibles en el mercado. El método permite barato, la captura de grandes volúmenes de imágenes de alta resolución susceptibles de algoritmos de análisis de aguas abajo. 

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Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando la respuesta de optocinético para estudiar la función visual del pez cebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Investigación

Biología

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Un método simple para imágenes Arabidopsis Uso de hojas perfluorodecalina como un medio de imágenes infiltrativas

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de<em&gt; Cotiledones Arabidopsis</em&gt; Epidermis durante la germinación

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

El uso de alta resolución de tomografía computarizada para visualizar la estructura tridimensional y la función de la Planta Vasculatura

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Lateral sistema inducible Raíz en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Y maíz

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Una alta resolución Método de Seguimiento activación fosforilación dependiente de IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Método estandarizado para la esterilización de alto rendimiento de semillas de Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...