Este protocolo permite la proyección de imagen en tiempo real planta-ancha de la actividad del sistema de señalización sistémico de la planta con la supervisión de la dinámica del calcio y del glutamato apoplásico en respuesta a la herida. Este método de imágenes en tiempo real en toda la planta proporciona una herramienta robusta para comprender la dinámica de las señales rápidas y de larga distancia en las plantas, combinando una alta resolución temporal espacial y facilidad de uso. Este protocolo ofrece el potencial de proporcionar una nueva visión de las características espaciales y temporales del sistema de señalización de calcio en las respuestas de estrés biótico y abiótico en otras especies de plantas.
Demostrando el procedimiento estará Takuya Uemura, un becario postdoctoral de mi laboratorio. Comience por encender el microscopio estéreo fluorescente motorizado, equipado con una lente objetivo 1X y una cámara sCMOS. Configure los ajustes del dispositivo para irradiar con luz de excitación centrada en 470 nanómetros, seleccionados mediante un filtro que transmite luz entre 450 y 490 nanómetros.
Adquirir luz de emisión mediante un filtro que transmita entre 510 y 560 nanómetros. Retire la tapa del plato que contiene la planta y colócalo debajo de la lente objetivo. Compruebe la señal fluorescente de la planta.
Luego espere aproximadamente 30 minutos en la oscuridad hasta que las plantas se adapten a las nuevas condiciones ambientales. Ajuste el enfoque y la ampliación para ver toda la planta en el campo de visión. A continuación, establezca los parámetros de adquisición para detectar las señales fluorescentes utilizando el software de imágenes de microscopios.
Establezca el tiempo de grabación en 11 minutos. Imagen durante cinco minutos antes de comenzar el experimento para aclimatar la planta a la irradiación de luz azul del microscopio, luego comenzar a grabar. Determinar el promedio de fluorescencia basal registrar al menos 10 fotogramas antes de la herida o la aplicación de glutamato.
Para la proyección de imagen en tiempo real del ion cytosolic inducido herida del calcio y de los cambios apoplásticos de la concentración del glutamato, corte el pecíolo o la región media de la hoja L1 con las tijeras. Para la proyección de imagen en tiempo real del glutamato accionados cambios cytosolic del calcio, corte aproximadamente un milímetro de la extremidad de la hoja L1 a través de la vena principal con las tijeras. Después de al menos 20 minutos aplique 10 microlitros de glutamato milimolar de 100 a la superficie de corte de la hoja.
Para el análisis de la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo, defina una región de interés en el lugar donde se va a analizar la intensidad de fluorescencia. Defina dos ROIs para el cálculo de la velocidad de la onda de calcio. En el software de imágenes, haga clic en medición de tiempo, defina y circule.
Mida la distancia entre las dos regiones haciendo clic en anotaciones y medición, longitud y línea simple. Mida los valores de florescencia sin procesar en cada ROI a lo largo del tiempo haciendo clic en medir, luego exporte los datos sin procesar al software de hoja de cálculo, para convertir la señal fluorescente en números en cada punto de tiempo. Determine el valor de fluorescencia basal, que se adivía como F cero, calculando el promedio de F sobre los primeros 10 fotogramas en los datos registrados, luego normalice los datos de F como se describe en el manuscrito del texto.
Para el análisis de ondas de velocidad de calcio, defina un punto de rotación de señal significativo por encima de los valores preestimulados como representación de la detección de un aumento de calcio en cada ROI. Calcule la diferencia de tiempo en el aumento de calcio entre los dos ROIs y la distancia entre ellos para determinar las velocidades de cualquier onda de calcio. La propagación de un cambio herida-accionado en las concentraciones del ion cytosolic del calcio y del glutamato apoplásico se demuestra aquí.
Cortar el pecíolo de una hoja en plantas que expresan GCaMP-3 llevó a un aumento significativo en el calcio. Fue inducido localmente y después separado a través de la vasculatura. La señal se propagó rápidamente a las hojas vecinas en pocos minutos.
Al cortar una hoja y plantas que expresaban el sniffer básico del pegamento de la quitinasa I, un aumento apoplásico rápido del glutamato fue observado alrededor de la región del corte. En pocos minutos, la señal también se propagó a través de la vasculatura. Para la proyección de imagen en tiempo real de la propagación de la señal del calcio accionada por el uso del glutamato, el borde de una hoja en las plantas que expresaban CCaMP-3 fue cortado.
Esto causó un aumento cytosolic local de la concentración del ion del calcio, pero la señal desapareció dentro de algunos minutos. Después de aproximadamente 10 minutos, el glutamato fue aplicado a la superficie del corte, causando un aumento local rápido en la concentración de calcio cytosolic y después la propagación de esta señal a las hojas distales. Para medir los cambios dentro de una concentración sólida del calcio inducida hiriendo en la hoja sistémica, el cambio del curso del tiempo de la intensidad de la señal GCaMP-3 fue medido en dos regiones del interés.
Los cambios apoplásticos de la concentración del glutamato en respuesta a daño mecánico fueron medidos también. La firma del glutamato exhibió un solo pico en aproximadamente 100 segundos después de herir. Este experimento debe llevarse a cabo bajo condiciones controladas de temperatura y humedad debido a que están elevadas por los cambios en estas condiciones ambientales.
Este protocolo ofrece un potencial para proporcionar información sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la señalización a larga distancia a través del uso de mutantes que los elementos defectuosos y supuestos del sistema de señalización de laboratorio.
