Damos las gracias a Chris Webster para la realización de los experimentos preliminares muestran en la Figura 3 de los resultados representativos y Jason Watts y Chris Webster útil para los comentarios sobre el manuscrito. Los fondos para este estudio fue proporcionado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (Estados Unidos) (R01DK074114) a JLW. Algunas cepas de nematodos utilizadas en este trabajo fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis, que es financiado por la Oficina de NIH de los programas de infraestructuras de investigación (OD010440 P40).

Los ácidos grasos poliinsaturados son sensibles al calor, la luz y el oxígeno. Por lo tanto, se debe tener cuidado en la preparación de platos de suplementos de ácidos grasos tales que los ácidos grasos no están expuestos a un exceso de calor y luz. Medios NGM que contienen 0,1% de Tergitol (NP-40) se trata en autoclave y se enfría parcialmente, después de lo cual las sales de sodio de ácidos grasos se añaden con agitación constante. Las placas se dejaron secar en la oscuridad. La absorción de los ácidos grasos por C. elegans cultivadas en estas placas a continuación pueden ser monitoreados mediante cromatografía de gases. 1. Preparación de ácido graso medio suplementado <ol><li> Medir los componentes del medio en un matraz de tamaño adecuado. Por 1 L, añadir 17 g de Bacto-agar, 2,5 g de triptona, 3 g de NaCl, 1 ml de colesterol 5 mg / ml disuelto en etanol, y 10 ml de 10% de Tergitol disuelto en agua. </li><li> Añadir 80% del volumen final deseado de agua Millipore y se esterilice en autoclave a lo largo de los medios de comunicación con las botellas de vidrio vacía (igual al número de diferentesconcentraciones de ácidos grasos a ensayar), así como apropiado cilindros graduados. </li><li> Medios de enfriar en un baño de agua a 55 ° C. Mientras que los medios de comunicación se está enfriando preparar la solución madre de trabajo de la sal sódica del ácido graso rompiendo abierto el vial de vidrio, utilizando las medidas de seguridad y la garantía de las partículas de vidrio no se mezclan con los ácidos grasos. Pesar ácido graso suficiente para hacer una reserva de trabajo 100 mM. </li><li> Se lleva la solución de ácido graso a una concentración final de 100 mM con agua purificada. Disolver completamente la sal sódica del ácido graso suele tardar unos 20-30 min. Se purga la solución de trabajo de ácido graso con argón o nitrógeno, porque el contacto con un gas inerte impide la oxidación. Se tapa el vial y almacenar el inventario de trabajo en la oscuridad hasta que los medios de comunicación se ha enfriado. </li><li> (Opcional) Si se desea medios RNAi, medir la ampicilina y isopropileos β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) soluciones aquí. </li><li> Cuando el agar se ha enfriado a 55 ° C por 1 L de añadir: 1ml de 1 M MgSO4, 1 ml de 1 M de CaCl 2, y 25 ml de tampón de fosfato (108,3 g de KH 2 PO 4 y 35,6 g de K 2 HPO 4 por 1 L de autoclave). Agregue la ampicilina esterilizada filtro y soluciones IPTG si hacer las placas de RNAi. Para todos los tipos de placas, añadir agua estéril para llevar el volumen final a los medios de comunicación 1 L. </li><li> Cerca de una llama, transferir multimedia a un autoclave y de tamaño apropiado cilindro graduado y luego añadir agua estéril caliente al volumen deseado. Traslado de regreso a los medios de comunicación frasco inicial y mezclar por agitación. </li><li> Cerca de una llama, la transferencia de los medios de comunicación en un número de botellas igual al número de concentraciones a ensayar midiendo con un autoclave y de tamaño apropiado cilindro graduado. Mantener las alícuotas de medios como líquido usando un baño de agua hasta que la solución de trabajo de ácidos grasos ha disuelto completamente. </li><li> Coloque una botella sobre una placa de agitación y revuelo hasta que los medios de comunicación es caliente al tacto, pero no caliente. Asegúrese de dejar lo suficientetiempo para agitar en la solución madre de ácido graso y verter en las placas antes de los medios de comunicación comienza a solidificarse. Si placa de agitación tiene control de temperatura, ajústelo a 55 ° C. </li><li> Diluir la solución de trabajo de ácido graso 100 mM en los medios de comunicación para la concentración final deseada. Medios Revuelva hasta que el precipitado blanco se encuentra en solución (aproximadamente 1 minuto). Medios todavía pueden ser ligeramente turbia después. </li><li> (Opcional) Si los medios de comunicación de RNAi se desea añadir ampicilina a 0,1 mg / ml e IPTG a 2 mM de concentración final. </li><li> Vierta multimedia mediante una ayuda de la pipeta automática y una pipeta estéril ml 25, la adición de 8 ml de medio por placa de 60 mm o 25 ml de medio por placa de 100 mm. Repita adición de ácido graso y la placa de vertido pasos para las botellas restantes. </li><li> Después de que el agar se haya solidificado, cubrir las placas de ácidos grasos-complementado con una caja o almacenar a temperatura ambiente en un cajón bien ventilado para protegerlo de la oxidación de la luz. </li><li> Semilla E. OP50 coli sobre placas de dos días después de placas se han secado.Para placas de 60 mm, de pipeta 300 l de un cultivo durante la noche OP50 (crecido a 37 ° C). Si se vertieron placas de RNAi, semilla con 300 l de bacterias RNAi después las placas se han secado durante cuatro días. Puede ser necesario ajustar debido a las diferencias en la humedad en diversos entornos de laboratorio Placa tiempo de secado. </li><li> Incubar las placas en un ambiente oscuro, a temperatura ambiente, mientras que el césped bacteriano se está secando. </li></ol> 2. Inducir Germ destrucción celular por suplementación de DGLA <ol><li> C. elegans cultivadas en placas que contienen mM DGLA 0,3 (20:03 n-6) se vuelven estériles debido a la destrucción de las células germinales en ambos nematodos adultos y de larvas de etapa. <ol><li> Preparar una población sincronizada de larvas L1 mediante el tratamiento de los hermafroditas grávidas con solución de hipoclorito alcalina (para una solución de 10 ml: 0,5 ml de NaOH 5 M, 2,5 ml de lejía doméstica, y 7 ml de H2O). Mueva suavemente los hermafroditas grávidas en esta solución hasta que el gusano adultos se disuelven. Los huevos se conservan y se pueden sedimentaron por centrifugación a baja velocidad. </li><li> Lavar la preparación de huevo 3 veces en tampón M9 (3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml de 1 M MgSO4, H 2 O a 1 L. Añadir MgSO4 después de la esterilización en autoclave). Para proporcionar el oxígeno suficiente, volver a suspender los huevos en un tubo de plástico de 15 ml a un volumen final de 5 ml de tampón M9 y el rock en un agitador durante la noche. </li><li> Larvas L1 debe ser añadido a las placas suplementadas dos días después de la siembra con OP50, o un día después en placas de las bacterias de RNAi. Incubar gusanos a 20 ° C durante tres días o hasta que alcanzan el estado adulto. </li></ol></li><li> Los gusanos adultos se pueden calificar de esterilidad usando un microscopio de disección con suficiente alto aumento para visualizar los embriones en desarrollo en el útero. El éxito de la pérdida de células germinales aparecerá como un claro vacío útero de huevos. </li><li> Los gusanos también pueden ser marcados mediante la fijación y la tinción con la nucleico unacid colorante diamindinophenylindole (DAPI), lo que facilita la visualización de los núcleos en las células germinales y embriones en desarrollo. Una mancha DAPI rápida se consigue recogiendo los gusanos en una gota de tampón M9 en un vidrio de reloj 9. <ol><li> Flood vidrio de reloj con 1 ml de una 0,2 ng / m. DAPI en solución de etanol al 95%, deje reposar durante aproximadamente 5 min. </li><li> Elige gusanos en una gota de VectaShield en una diapositiva, y luego cubra con un cubreobjetos. </li><li> Cubreobjetos Seal y almacenar a 4 ° C en la noche oscura para la tinción óptima, sin embargo diapositivas también se pueden ver inmediatamente. Puntuación para la presencia o ausencia de núcleos de células germinales utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una lámpara UV y filtro. </li></ol></li></ol> 3. Confirmación de ácidos grasos captación por cromatografía de gases Composición de ácido graso total de C. elegans se pueden determinar mediante la producción de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), que después se separan y cuantifican usando CHR de gasomatography 4. <ol><li> Recoger 500-1.000 gusanos adultos lavándolas fuera de las placas con agua y transferir a un 13 mm x 100 mm tubo de tapón de rosca de vidrio silanizado. </li><li> Deje que los gusanos se depositan por gravedad, y luego eliminar la mayor cantidad de agua posible con una pipeta Pasteur de vidrio. </li><li> Lavar los gusanos una vez con agua, y luego otra vez eliminar la mayor cantidad de agua posible. </li><li> FAME se forman mediante la adición de 1 ml de 2,5% de H 2 SO 4 en metanol, y después de calentar a 70 ° C durante 1 hora en un baño de agua. </li><li> Retire los tubos del baño de agua y enfriar durante 1 min. </li><li> Extraer FAME mediante la adición de 1,5 ml de agua y 0,25 ml de hexano. </li><li> Crónica tubos y agitar vigorosamente. </li><li> Tubos centrífuga en una centrífuga clínica de sobremesa durante 1 min a velocidad máxima para separar hexano de disolvente acuoso. </li><li> Traslado hexano (capa superior) para una inserción GC vial dentro de un vial GC, teniendo cuidado de no transferir ninguno de la fase acuosa. Para GC unnálisis, 1-2 l de FAME en hexano se inyectó en una columna de cromatografía de gas capilar polar adecuado para el análisis FAME. El Agilent 7890 GC inyector se fijó en 250 ° C, con una velocidad de flujo de 1,4 ml / min, y el horno del GC se programa para una temperatura inicial de 130 ° C, que se mantuvo durante 1 min. Posteriormente, se aumenta la temperatura 10 ° C / min hasta 190 ° C, y luego en rampa de nuevo a 5 º C / min hasta 210 ° C y se mantuvo durante 1 min. </li><li> Para asegurarse de que se ha producido la absorción de DGLA, analizar FAME por ionización de llama de detección (FID) o espectrometría de masas (MS) de detección, usando patrones auténticos para la identificación de la C. elegans ácidos grasos. </li></ol>

<ol>
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A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides.</a> Lipids. 11, 370-379 (1976).</li><li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP(3)-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans.">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26, 554-566 (2012).</li><li>Edmonds, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mediator+subunit,+MDT-15,+integrates+regulation+of+fatty+acid+metabolism+by+NHR-49-dependent+and+-independent+pathways+in+C.+elegans.">A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans.</a> Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).</li><li>Lesa, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+are+required+for+efficient+neurotransmission+in+C.+elegans.">Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans.</a> J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).</li><li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans.">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176, 865-875 (2007).</li><li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+desaturation+links+germ+cell+loss+to+longevity+through+NHR-80/HNF4+in+C.+elegans.">Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans.</a> PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ARC/Mediator+subunit+required+for+SREBP+control+of+cholesterol+and+lipid+homeostasis.">An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis.</a> Nature. 442, 700-704 (2006).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí se describe un método para la suplementación de C. elegans con ácidos grasos insaturados. Como se mencionó anteriormente, se debe tener cuidado en la preparación de platos PUFA complementados porque la naturaleza reactiva de los dobles enlaces en PUFAs hace que estos ácidos grasos para ser sensibles a la oxidación a través del calor y de la luz 11. Para evitar la oxidación, es importante agregar el PUFA al medio de agar líquido después de los medios de comunicación se ha enfriado a ...

Los ácidos grasos son componentes estructurales esenciales de las membranas, así como moléculas de almacenamiento de energía eficiente. Adicionalmente, los ácidos grasos pueden ser escindidos a partir de membranas celulares por las lipasas y pueden modificar enzimáticamente para producir efectores de señalización 1. De origen natural los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) contienen dos o más enlaces dobles cis. Los ácidos grasos omega-3 y los ácidos grasos omega-6 se distinguen unos de otros sobre la base de las posiciones de los dobles enlaces con respecto al extremo metilo del ácido graso. Las dietas saludables requieren tanto de omega-6 y ácidos grasos omega-3. Sin embargo, las dietas occidentales son especialmente ricos en ácidos grasos omega-6 y pobres en ácidos grasos omega-3. Un alto contenido de omega-6 proporción de ácidos grasos omega-3 que se asocia con un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares e inflamatorias, sin embargo, las funciones beneficiosas y perjudiciales precisas de ácidos grasos específicos no se conocen bien 2. Las lombrices intestinales Elega Caenorhabditisns es útil en el estudio de la función de ácido graso, ya que sintetiza todas las enzimas necesarias para producir una gama de ácidos grasos omega-6 y omega-3 grasos, incluyendo una desaturasa omega-3, una actividad que está ausente en la mayoría de los animales 3,4. Los mutantes que carecen de las enzimas ácido graso desaturasa fallan para producir PUFA específicos, dando lugar a una serie de defectos en el desarrollo y neurológicos 4-6. Para estudiar los efectos fisiológicos de los ácidos grasos de la dieta, hemos desarrollado un ensayo bioquímico compatible con el análisis genético utilizando tanto técnicas de derribo de RNAi mutante y en C. elegans. La suplementación con PUFA específicos se logra mediante la adición de una solución de sal de sodio de ácido graso para el medio de agar antes de verter. Esto resulta en la absorción de ácidos grasos poliinsaturados por el E. fuente de alimento coli, donde se acumula en las membranas bacterianas. C. elegans ingieren las bacterias que contienen PUFA, y esto los suplementos dietéticos es suficiente para rescatar el defectuosoct de mutantes deficientes en ácidos grasos poliinsaturados. La suplementación de la mayoría de los ácidos grasos no tiene efectos perjudiciales sobre los animales de tipo salvaje, sin embargo, los ácidos grasos específicos de omega-6, especialmente el ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA, 20:03 n-6) causar una destrucción permanente de C. células germinales elegans 7,8. La cromatografía de gases se utiliza para controlar la absorción del ácido graso complementado en la fuente de alimento bacteriana (ya sea OP50 o HT115), así como en los nematodos. La adición de la Tergitol detergente (NP-40) en los medios de comunicación permite una distribución uniforme de los ácidos grasos a través de la placa entera y la absorción más eficiente de los ácidos grasos por la E. coli y los nematodos. Hemos encontrado que los ácidos grasos insaturados son fácilmente absorbidos por las bacterias y C. elegans, pero la absorción de ácidos grasos saturados es mucho menos eficiente. Este artículo describirá paso a paso cómo complementar los medios de agar con ácidos grasos, así como la forma de controlar la absorción de ácidos grasos en the nematodo mediante cromatografía de gases.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Bacto-Agar</td>
			<td style="width:128px;">Difco</td>
			<td style="width:155px;">214010</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Tryptone</td>
			<td style="width:128px;">Difco</td>
			<td style="width:155px;">211705</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">3624-05</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Tergitol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">NP40S-500mL</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">C8667-25G</td>
			<td style="width:275px;">(5 mg/mL in ethanol)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">MgSO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">2504-01</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">CaCl2</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">1311-01</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">3254-05</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">3246-05</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sodium dihomogamma linolenate</td>
			<td style="width:128px;">NuCHEK</td>
			<td style="width:155px;">S-1143</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Warm sterile Millipore water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sterile water for collecting worms</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Nuclease-free Water for DGLA stock solution</td>
			<td style="width:128px;">Ambion</td>
			<td style="width:155px;">AM9932</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:128px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">BP1760-25</td>
			<td style="width:275px;">100 mg/ml in water (for RNAi plates)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:128px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:155px;">12481C100</td>
			<td style="width:275px;">1 M in water (for RNAi plates)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">HSO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">9681-03</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Methanol</td>
			<td style="width:128px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A452-4</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Hexane</td>
			<td style="width:128px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">H302-4</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">diamindinophenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">D9542</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">VectaShield</td>
			<td style="width:128px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:155px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Glass Flask</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">4980-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Autoclaveable Glass bottles with stirbars</td>
			<td style="width:128px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:155px;">FB-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Autoclaveable Glass Graduated Cylinder</td>
			<td style="width:128px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:155px;">08-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Stir Plate</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">97042-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Waterbath at 55+ &#176;C</td>
			<td style="width:128px;">Precision Scientific Inc.</td>
			<td style="width:155px;">66551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Screwcap Brown Glass Vial</td>
			<td style="width:128px;">Sun SRI</td>
			<td style="width:155px;">200 494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Argon gas tank</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Automated Pipette aid</td>
			<td style="width:128px;">Pipette-Aid</td>
			<td style="width:155px;">P-90297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sterile Serological Pipettes (25 ml)</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Bunsen Burner</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">89038-534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:128px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">TLB3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Silanized glass tube</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:155px;">STT-13100-S</td>
			<td>for FAMEs derivitization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">PTFE Screw caps</td>
			<td style="width:128px;">Kimble-Chase</td>
			<td style="width:155px;">1493015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Clinical tabletop centrifuge</td>
			<td style="width:128px;">IEC</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">GC Crimp Vial</td>
			<td style="width:128px;">SUN SRi</td>
			<td style="width:155px;">200 000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">GC Vial Insert</td>
			<td style="width:128px;">SUN SRi</td>
			<td style="width:155px;">200 232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">GC Vial cap</td>
			<td style="width:128px;">SUN SRi</td>
			<td style="width:155px;">200 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Gas Chromatograph</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">7890A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Mass Spectrometry Detector</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">5975C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Column for gas chromatography</td>
			<td style="width:128px;">Suppelco</td>
			<td style="width:155px;">SP 2380</td>
			<td>30 m x 0.25 mm fused silica capillary column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in caenorhabditis elegans

Los ácidos grasos son esenciales para muchas funciones celulares. Sirven moléculas de almacenamiento de energía en forma eficiente, constituyen el núcleo hidrofóbico de las membranas, y participar en las diversas vías de señalización. Caenorhabditis elegans sintetiza todas las enzimas necesarias para producir una gama de ácidos grasos omega-6 y omega-3 los ácidos grasos. Esto, combinado con la simple anatomía y la gama de herramientas genéticas disponibles, lo convierten en un modelo atractivo para estudiar la función del ácido graso. Con el fin de investigar las vías genéticas que median en los efectos fisiológicos de los ácidos grasos de la dieta, hemos desarrollado un método para complementar la C. elegans dieta con ácidos grasos insaturados. La suplementación es un medio eficaz para alterar la composición de ácidos grasos de gusanos y también se puede utilizar para rescatar los defectos en los mutantes deficientes en ácido grasos. Nuestro método utiliza el crecimiento medio de agar nematodo (NGM) suplementado con sales de acidsodium graso. Los ácidos grasos en las placas suplementadas se convierten en incorporaciónTed en las membranas de la fuente de alimento bacteriana, que luego es absorbido por la C. elegans que se alimentan de las bacterias suplementadas. También se describe un protocolo de cromatografía de gases para monitorear los cambios en la composición de ácidos grasos que se producen en los gusanos suplementados. Esta es una manera eficaz para complementar las dietas de las poblaciones grandes y pequeñas de C. elegans, lo que permite una gama de aplicaciones para este método.

La suplementación de la C. dieta elegans está limitada por la capacidad de la fuente de alimento de las bacterias a la absorción e incorporar los ácidos grasos en la membrana bacteriana. Para determinar la capacidad de E. OP50 coli para asimilar diversos ácidos grasos en sus membranas, OP50 se cultivó en placas sobre medios con ningún suplemento, 0,1 mM y concentraciones de 0,3 mM de ácido esteárico (18:0), oleato de sodio (18:1 n-9), y el DGLA de sodio (20 : 3n-6). Las placa...

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Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

&lt;em&gt; Caenorhabditis elegan &lt;/ em&gt; es un modelo útil para explorar las funciones de los ácidos grasos poliinsaturados en el desarrollo y la fisiología. Este protocolo describe un método eficiente de complementar la &lt;em&gt; C. elegans &lt;/ em&gt; la dieta con ácidos grasos poliinsaturados.

La suplementación dietética de ácidos grasos poliinsaturados en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

dietary-supplementation-polyunsaturated-fatty-acids-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

17.0K vistas.  Washington State University.  Caenorhabditis elegan es un modelo útil para explorar las funciones de los ácidos grasos poliinsaturados en el desarrollo y la fisiología. Este protocolo describe un método eficiente de complementar la C. elegans la dieta con ácidos grasos poliinsaturados. 

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Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Investigación

Biología

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extracción y análisis de prostaglandina en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

El cultivo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En tres dimensiones en el Laboratorio

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...